百邁客生物為該研究提供了轉錄組測序服務。

研究背景

漬澇災害是全球農業(yè)生產的重大威脅之一。隨著氣候變化加劇，極端降水事件日益頻繁，漬澇災害對作物造成的損失也愈發(fā)嚴重。大麥作為世界第四大谷類作物，對漬澇脅迫高度敏感。因此，挖掘大麥耐漬澇基因資源，培育耐漬澇新品種，對于保障糧食安全具有重要意義。

研究結果

1.全基因組關聯(lián)分析（GWAS）鎖定4H染色體上的關鍵位點

利用包含334份雙棱大麥種質資源的自然群體，結合基因型數(shù)據和苗期耐漬澇脅迫下的葉綠素含量數(shù)據，進行全基因組關聯(lián)分析（GWAS）。結果在4H染色體上檢測到一個與葉綠素含量顯著相關的QTL。在漬澇脅迫下，該QTL不同等位基因間的葉綠素含量存在顯著差異，但在正常條件下差異不明顯（圖1C）。基于連鎖不平衡衰減距離，確定該QTL的候選基因位于4H染色體上567.5 Mb-576.5 Mb的區(qū)間內。

圖1

2.?轉錄組分析篩選候選基因?HvERF62

對3個耐漬澇材料（Fleet、Tam169、ZW）和3個漬澇敏感材料（Lian87、Su194、Xiu79）進行轉錄組測序（RNA-seq）分析。通過比較不同材料在正常和漬澇條件下的基因表達差異，發(fā)現(xiàn)在3個耐漬澇材料中，位于4H染色體QTL區(qū)間內的 HvERF62 基因受漬澇脅迫顯著誘導表達，而在3個漬澇敏感材料中，該基因表達量較低（圖3B, 3C）。

3.HvERF62 基因編碼核定位蛋白，屬于VII類乙烯反應因子

生物信息學分析顯示，HvERF62 基因編碼的蛋白具有典型的VII類乙烯反應因子（ERFVII）特征，即N端具有保守的MCGGAIL基序（圖3D, 3E）。亞細胞定位實驗表明，HvERF62蛋白定位于細胞核中，符合其轉錄因子的功能特征（圖3F）。

圖3

4.CRISPR/Cas9基因編輯創(chuàng)制?HvERF62?突變體

利用CRISPR/Cas9基因編輯技術，獲得了3個獨立的 HvERF62 純合突變體（erf1、erf2、erf3）。這些突變體在正常條件下與野生型（GP）的生長發(fā)育沒有顯著差異。然而，在漬澇脅迫下，突變體的不定根數(shù)量顯著少于野生型，且根長、地上部干重、根干重和葉綠素含量均顯著低于野生型（圖4B-4F）。

圖4

5.HvERF62?通過調控氣孔形成、ROS穩(wěn)態(tài)和碳水化合物積累影響耐漬澇性

對野生型和 HvERF62 突變體進行轉錄組測序分析。結果顯示，在漬澇脅迫下，突變體中有403個基因上調表達，888個基因下調表達（圖5A, 5B）。KEGG富集分析表明，這些差異表達基因顯著富集在植物-病原互作、淀粉和蔗糖代謝、苯丙烷類生物合成、MAPK信號通路、植物激素信號轉導、糖酵解/糖異生等通路中（圖5C）。

圖5

進一步分析發(fā)現(xiàn)，在漬澇脅迫4天后，野生型的不定根中形成了氣孔，而突變體中沒有形成（圖6B, 6D）。同時，突變體中ADH和PDC活性顯著高于野生型（圖7I, 7J），表明突變體更早進入無氧呼吸狀態(tài)。在漬澇脅迫8天后，野生型和突變體都形成了氣孔，但野生型中的氣孔比例更高（圖6C, 6D）。此外，野生型積累了更多的碳水化合物（蔗糖、葡萄糖和淀粉），而突變體中的碳水化合物含量顯著較低（圖7F-7H）。

圖6

細胞活力染色實驗表明，在漬澇脅迫下，HvERF62 突變體根部的細胞死亡程度高于野生型（圖8）。ROS熒光染色實驗表明，在漬澇脅迫下，突變體根部積累了更多的ROS（圖9）。此外，突變體中H2O2含量顯著高于野生型，而CAT和GSH活性顯著低于野生型（圖7A-7C）。

圖7

圖8

圖9

6.HvERF62?基因的自然變異與耐漬澇性關聯(lián)

對自然群體中 HvERF62 基因的序列進行分析，發(fā)現(xiàn)存在43個SNPs和4個InDels。根據這些變異，將種質資源分為3個單倍型（Hap1、Hap2和Hap3）。其中，Hap3由于序列變異導致編碼提前終止。在漬澇脅迫下，Hap1和Hap2的葉綠素含量顯著高于Hap3（圖10A, 10B）?；贗nDel變異設計的分子標記可用于區(qū)分不同單倍型（圖10C-10E）。

圖10

研究總結

該研究通過GWAS和轉錄組分析，鑒定到一個新的大麥耐漬澇基因 HvERF62。該基因編碼一個VII類乙烯反應因子，通過調控氣孔形成、ROS穩(wěn)態(tài)和碳水化合物積累，從而影響大麥的耐漬澇性。CRISPR/Cas9基因編輯實驗證實了 HvERF62 基因的功能。此外，HvERF62 基因的自然變異與大麥耐漬澇性顯著相關。該研究為大麥耐漬澇分子育種提供了新的基因資源和分子標記，加深了對大麥響應漬澇脅迫分子機制的理解。未來，可進一步研究 HvERF62 基因在不同遺傳背景下的耐漬澇效應，以及與其他耐漬澇基因的互作關系，為培育高產、優(yōu)質、耐漬澇的大麥新品種提供理論依據和技術支撐。

內容來源于小麥研究聯(lián)盟，侵刪

百邁客生物為該研究提供群體、轉錄組測序服務。

研究背景

高粱是世界第五大禾谷類作物，養(yǎng)活了世界干旱或半干旱地區(qū)5億多人口。高粱起源于非洲薩赫勒地區(qū)，對非生物脅迫，比如干旱、高溫、貧瘠、鹽堿等有良好的耐受性，是研究植物響應逆境脅迫機制的理想模式物種。然而，有限的遺傳和基因組資源以及遺傳轉化技術的瓶頸限制了高粱功能基因的研究。

研究內容

研究團隊利用ONT Ultra-long、PacBio HiFi和Hi-C技術，成功組裝了高粱E048 的T2T無缺口高質量基因組圖譜。該基因組大小為729.5 Mb，預測蛋白編碼基因35,549個，并完整解析了全部端粒和著絲粒序列信息。通過與BTx623、Ji2055、HYZ等另外3個高粱T2T基因組的比較分析，研究團隊鑒定出E048特異存在的2.9 Mb基因組區(qū)域，包含187個基因。這些基因主要參與信號轉導、免疫響應和代謝調控等生物學過程，為解析E048高抗病、抗逆、抗倒伏和高含糖量等優(yōu)異性狀的分子機制提供了重要線索。

為了深入解析高粱E048的轉錄調控過程，研究團隊測定了E048在13個不同發(fā)育階段多種組織（包括幼苗、葉片、根、莖、花序和種子等）的轉錄組數(shù)據，構建了全面的基因表達參考圖譜。分析表明，E048基因組中93.39%（33,200個）的基因在至少一種組織中表達，20,475個基因（57.59%）在所有13種組織中均檢測到表達。其中在開花前的花序組織中特異表達的基因數(shù)量最多，GO富集分析發(fā)現(xiàn)些特異表達基因主要參與生殖相關的生物學過程，反映了高粱從營養(yǎng)生長階段向生殖生長階段過渡時的關鍵轉錄特征。

研究團隊進一步開發(fā)了E048大規(guī)模飽和EMS突變體庫，在M1代收獲了13,226個單株并對179個M2植株進行了全基因組重測序。對變異位點進行分析發(fā)現(xiàn)，突變體包含了2,291,074個SNPs或InDels變異，突變位點幾乎均勻分布在每條染色體上，涵蓋了97.54%的基因，這些突變體為高粱功能基因解析與遺傳改良提供了重要種質資源。研究團隊利用E048基因組，通過MutMap和MapMap+的方法，快速定位了黃化突變體和多葉突變體的目的基因，驗證了利用E048基因組和突變體資源進行高粱功能基因研究的高效性。

為促進高粱功能基因組研究以及突變體庫的廣泛應用，研究團隊還建立了高粱基因組和突變體庫數(shù)據庫SGMD（https://sorghum.genetics.ac.cn/SGMD）。該數(shù)據庫整合了高粱E048基因組信息、基因表達圖譜、突變體庫部分表型變異和基因變異信息等，是高粱功能基因研究的“超級工具包”。

內容來源于MPlant植物科學，侵刪

本次為各位老師帶來華中農業(yè)大學鄧秀新教授團隊在Plant Journal中發(fā)表的研究論文，題目為“Adventitious embryonic causal gene FhRWP?regulates multiple developmental phenotypes in citrus reproduction”，該文章利用ATAC-seq和轉錄組技術，探究了柑橘中無性繁殖現(xiàn)象——不定胚發(fā)生的機制。百邁客生物為該研究提供了ATAC-seq測序服務。

研究背景

植物的再生和發(fā)育是一個關鍵的過程，涉及從組織、器官、愈傷組織甚至具有多能性或多能性的單個細胞中重建整個植物，并通過復雜的調控網絡進行細胞命運的轉化，深入了解植物的再生和發(fā)育，對于設計提高作物再生效率的分子工具至關重要。

不定胚直接從獲得胚性命運的珠心組織細胞亞群發(fā)育而來，作為有性生殖的替代品，在柑橘和芒果等少數(shù)植物中已有報道，因此，對不定胚胎發(fā)生的研究可以為植物再生和發(fā)育的遺傳機制提供獨特的視角；由于缺乏合適的遺傳系統(tǒng)來探索潛在機制，我們對不定胚和再生之間關系的理解非常有限，在植物再生工程應用中，目前已有部分基因被鑒定并用于促進植物再生，從而克服了與物種相關的局限性，F(xiàn)hRWP的功能和不定胚的調節(jié)網絡仍在很大程度上未被了解，已有研究提出，染色質重塑復合體亞基?被認為能夠誘導FhRWP的高表達，該研究通過整合轉錄組與染色質開放圖景數(shù)據闡明了FhRWP表達與其表觀遺傳調控之間的調控關系。

材料及方法

材料：單胚基因型和多胚基因型山橘胚珠、腋芽、幼葉及胚源性愈傷組織等；

方法：ATAC+轉錄組+重測序+激素檢測等

研究結果

1.多胚山橘的開放性染色質

為了揭示來自珠粒細胞的外胚的重編程模式，作者采用ATAC-seq分析了多胚（PO）及單胚（MO）基因型山橘后胚的胚珠的全基因組染色質可及性，結果表明，PO特異性開放染色質區(qū)域（ACRs）基因參與了次級代謝過程、生長正調控、細胞分化和正向調控細胞生長。

先前的研究表明，一個顯性基因FhRWP決定了與微型倒重復轉座因子（MITE）插入相關的不定胚胎的啟動，在PO基因型中FhRWP的啟動子區(qū)中鑒定到了特異性ACR，而Mo基因型中不含ACR，該ACR與FhRWP啟動子區(qū)域的MITE序列重疊，即MITE序列被FhARID1蛋白結合，這可能是染色質重塑復合體的一個亞基，這些結果表明，F(xiàn)hRWP是可及染色質的決定因素，參與不定胚胎發(fā)育，與MITE的插入有關。

山橘基因組中與組織再生和體細胞胚胎發(fā)生相關的hub基因，研究結果表明，與組織再生和體細胞胚胎發(fā)生相關的hub基因，有12個ACRs特異性轉錄因子在PO和Mo基因型柑橘品種之間存在差異表達，WUSCHEL（WUS）基因是干細胞維持的關鍵調控因子，在PO基因型柑橘中表達上調。FhKRP7kip相關蛋白（KRP）基因編碼一種細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CKI），是細胞分裂的負調控因子。而FhKRP在PO基因型中下調了0.59倍?？偟膩碚f，分析顯示，多胚胎基因型可能具有更大的染色質可及性區(qū)域，促進植物重編程通路相關基因來調控不定胚的形成。

2.FhRWP基因的基因編輯結果展示其在不定胚發(fā)生中的作用

FhRWP基因在胚囊中的表達是特異性和短暫的，可以從受精前7天開始追蹤，直到后10天，作者采用RNAi方法構建了6個干擾系，發(fā)現(xiàn)FhRWP在6個干擾系中的表達量相比PO系顯著降低，但顯著高于Mo基因型，且FhRWP表達量降低后不定胚數(shù)量也都減少了，這些結果提示，受FhRWP控制的不定胚表型可能與基因表達的劑量效應有關。

作者之前的研究顯示的雜合子插入MITE啟動子區(qū)域和一個FhRWP的CDS序列區(qū)域SNP（C-G），導致這個基因的分裂成兩個單倍型，M等位基因（MITE）和P等位基因（沒有MITE）。根據Mo和PO腋芽的轉錄組結果，作者發(fā)現(xiàn)PO中RWP轉錄本高表達P等位基因，而Mo中M等位基因表達較小，于是作者構建了CRISPR/Cas9載體，以敲除FhRWP，結果表明，插入MITE可以通過促進含有MITE的P等位基因的表達，同時減少不插入MITE的M等位基因的表達，從而改變該基因的表達模式。雖然FhRWP在ko-47-1和ko-47-2中的FhRWP的表達下降到與Mo一致的水平，但P等位基因突變導致的過早終止導致了FhRWP功能的喪失，因此，ko-47-1和ko-47-2植株表現(xiàn)出新的表型，如生長遲緩和花芽分化失敗。

此外，對對照和轉基因株系的腋芽進行差異表達分析發(fā)現(xiàn)，這些基因在確定植物器官特性和植物器官形成等過程中存在明顯的富集，與開花相關的FT/TFL1基因家族的表達也存在差異；此外，有研究表明CEN促進了芽的休眠作用，通過酵母單雜交，發(fā)現(xiàn)FhRWP直接調控FhCEN的啟動子區(qū)域。

柑橘胚愈傷組織的誘導具有明顯的基因型依賴性，作者在Mo基因型山橘中過表達FhRWP的P等位基因CDS，檢測到GFP的植株胚胎愈傷組織增長迅速。qRT-PCR顯示FhRWP表達高度上調，細胞分裂素、ABA和水楊酸激素水平有顯著變化，而生長素和赤霉素水平則無顯著性差異，F(xiàn)hRWP的過表達有助于Mo基因型山橘莖段上胚胎愈傷組織的形成。轉錄組結果顯示，WUS和CLV1等再生途徑相關的低豐度基因表達上調，在OE-FhRWP愈傷組織中，WUS與CLV1表達量增加，與激素分析結果一致，與ABA和細胞分裂素合成途徑相關的基因，包括IPT、CKK、AHK、PYL的表達存在顯著差異。

3.FhRWP在柑橘多種組織繁殖中的多效性

多項實驗結果表明，F(xiàn)hRWP在協(xié)調細胞命運和啟動植物再生和繁殖過程中起著關鍵作用，因此，該研究對腋芽MO/PO胚珠的表達數(shù)據進行了整合的轉錄組分析。差異基因在花器官發(fā)生和繁殖相關的生物過程顯著富集，其中來自MADS和WOX等基因家族的轉錄因子，包括FhWUS和FhAGL6，均顯著富集，在過表達的愈傷組織中，共鑒定出354個差異表達的轉錄因子，GO注釋顯示與胚胎后發(fā)育和再生相關的過程顯著相關。值得注意的是，屬于GRF和TALE等基因家族的轉錄因子，包括FhAHT1和FhGRF1，表現(xiàn)出顯著的富集，這些基因已被廣泛報道參與光形態(tài)建成、葉片發(fā)育等信號通路。

同時，作者在Mo和PO胚珠中發(fā)現(xiàn)了56個差異表達的轉錄因子，它們與分生組織維持和胚胎后發(fā)育相關的過程顯著相關，其中，來自NAC、NAC等基因家族的轉錄因子，包括FhNAC等轉錄因子顯著富集。此外，還發(fā)現(xiàn)了另一個與柑橘核細胞胚發(fā)育密切相關的轉錄因子FhC2H2，這些基因參與了傷口的愈合、再生和繁殖，研究結果表明，F(xiàn)hRWP可能是一個關鍵的調控樞紐，通過調節(jié)下游轉錄調控網絡和影響各種組織來影響植物的再生。

思路發(fā)散

該研究從ATAC-seq入手，先從特異性及差異開放區(qū)域相關基因中篩選出來部分目的基因，再結合轉錄組基因表達以及大量基因編輯逐步完善FhRWP調節(jié)柑橘繁殖中的多效性，與直接從轉錄組入手篩選基因相比，初篩的基因范圍可能會更小，更利于進一步鎖定關鍵基因，為后續(xù)其他研究提供了新的思路。

參考文獻：

Song X, Wang N, Zhou Y, Tian X, Xie Z, Chai L, Wu X, Xu Q, Zhang F, Ye J, Deng X. Adventitious embryonic causal gene FhRWP regulates multiple developmental phenotypes in citrus reproduction. Plant J. 2024 Aug;119(3):1494-1507. doi: 10.1111/tpj.16870. Epub 2024 Jun 16.

研究背景

葡萄（Vitis）在全球范圍種植廣泛，即可鮮食又可加工成葡萄酒等，具有很高的經濟價值，是農民致富、鄉(xiāng)村振興、人民美好生活中不可或缺的重要園藝作物。葡萄屬于葡萄科葡萄屬植物，該屬包括兩個亞屬，麝香葡萄亞屬(Muscadinia Planch)和真葡萄亞屬(Euvitis Planch），共計70余個種；根據地理分布可將其分為三大類群，歐亞種群、北美種群和東亞種群。

葡萄作為最古老的馴化作物之一（約公元前11,000年），漫長的持續(xù)馴化和多年的育種改良導致現(xiàn)代葡萄品種的遺傳多樣性縮小和抗性丟失，使其易受病蟲、逆境等各種不利條件的影響。近年北美葡萄泛基因組（Genome biology, 2023），歐洲葡萄泛基因組（Nature Genetics, 2024）的相繼報道，野生葡萄以其豐富的遺傳多樣性和超強的抗性基因再次受到關注，但以大群體染色體級基因組組裝為基礎，涵蓋主要品種，特別是包含東亞野生種葡萄的屬級泛基因組一直未見報道。因此構建涵蓋整個葡萄屬的泛基因組將成為了解葡萄遺傳多樣性、開展功能基因組學研究、識別隱性遺傳特性以及葡萄精準改良的關鍵資源。

材料方法及研究結果

該研究首先組裝了釀酒葡萄（Vitis vinifera）霞多麗的完整單倍型基因組，并首次基于ChIP-seq數(shù)據鑒定了葡萄著絲粒序列，解析著絲粒的衛(wèi)星重復序列結構特征，發(fā)現(xiàn)單倍型著絲粒之間的顯著差異，表明其快速進化。其次，該研究通過對591個葡萄材料的群體基因組分析，選取了72個代表性葡萄材料（包括25個野生種和47個栽培種）進行染色體水平的單倍型基因組組裝（圖1），基因組驗證表明這些單倍體基因組序列具有較高的質量和完成度。

圖1-葡萄樣品全球地理分布及其果實和葉片形態(tài)

鑒于葡萄基因組因頻繁雜交而具有的高度雜合性，單倍型基因組不僅能精確解析雜合區(qū)域序列，而且對分析葡萄的育種歷史也至關重要。該研究構建了單倍型系統(tǒng)發(fā)育進化樹，揭示了葡萄屬植物復雜的育種歷史和豐富的遺傳多樣性。結果顯示，北美和歐洲品種存在較多內部雜交，而東亞品種的內部雜交較少，跨大洲雜交事件有限（圖2）。特別是東亞葡萄極少被開發(fā)的遺傳多樣性，表明了其潛在的巨大育種價值。此次發(fā)布的東亞野生葡萄基因組為葡萄遺傳育種研究提供了強有力的資源支持。

圖2-144個單倍型基因組系統(tǒng)發(fā)育樹

該研究還分析了72份葡萄材料的泛基因組家族，發(fā)現(xiàn)了超過6.4萬個基因家族，包括不同數(shù)量的核心、可變和私有的基因家族。擬合曲線表明，該研究的泛基因家族數(shù)量趨向飽和，表明葡萄泛基因組接近閉合。研究還系統(tǒng)分析了葡萄屬免疫受體蛋白基因家族NLR，結合三大種群的葡萄和圓葉葡萄抗霜霉病數(shù)據發(fā)現(xiàn)，TIR-NBARC-LRR家族的NLR基因在抗?。ㄒ吧咸眩┖透胁∑咸眩ㄔ耘嗥咸眩┲写嬖陲@著數(shù)量差異，因此有可能是葡萄抗霜霉病表型差異的重要因素之一。該超級泛基因組分析為研究葡萄屬的遺傳多樣性、進化歷史及功能基因挖掘提供了全面的基因組基礎（圖3）。

圖3-葡萄屬72份代表性材料超級泛基因組基因家族圖譜

其次，該研究進一步繪制了目前比較完整的葡萄基因組遺傳結構變異（SV) 圖譜，助力挖掘與抗性及資源利用效率等重要性狀相關的功能基因（圖4）。該研究通過全基因組序列比對和變異檢測，在67個Euvitis葡萄樣本中鑒定出132,518個非冗余結構變異。功能富集分析表明，這些SV與葡萄葉片形態(tài)、病原識別及生物刺激感知相關。通過與已知分子標記的比較，該研究鑒定到霜霉病抗性分子標記Rpv3相關SV事件，并發(fā)現(xiàn)三大種群中該SV位點的不同單倍型與葡萄霜霉病抗性有顯著關聯(lián)性，證明該SV是一個關鍵抗病分子標記，突出了超級泛基因組圖譜的價值。

圖4-葡萄屬72份代表性材料結構變異圖譜

最后，該研究使用葡萄結構變異圖譜和基于霞多麗完整基因組序列，構建了涵蓋歐、亞、美三大種群的圖形泛基因組?；谠搱D形泛基因組，該研究對113個葡萄樣本的霜霉病抗性表型、氣孔表型以及霜霉病侵染轉錄組數(shù)據進行了基因組變異的eQTL分析（圖5），鑒定出63個SV-eQTL和1,808個SNP-eQTL與葡萄抗霜霉病顯著相關。在63個與霜霉病抗性密切相關的SV的輔助下，該研究定位到一個氨基酸轉運蛋白基因VvLHT8。進一步的分子功能實驗發(fā)現(xiàn)VvLHT8可能通過負調控葡萄水楊酸合成和氣孔免疫反應進而抑制葡萄抗病性，證實了高質量泛基因組輔助的多組學關聯(lián)分析在作物重要農藝性狀分子標記開發(fā)及功能基因挖掘中的高效性。該研究構建的葡萄屬超級泛基因組不僅加深了對葡萄生物進化和育種改良的理解，也為精準改良葡萄抗病性和多樣性提供了重要的科學基礎。

圖5-超級泛基因組圖譜輔助SV-eQTL鑒定及VvLHT8基因功能驗證

研究總結

該研究提供了比較全面的葡萄屬基因組資源，有助于全面解析葡萄基因組的復雜性和多樣性，從而高效發(fā)掘并利用葡萄特別是野生葡萄種中的優(yōu)異基因。該研究結合葡萄屬超級泛基因組、群體轉錄組學和表型組學，對葡萄屬遺傳多樣性和重要農藝性狀形成機制的深入探索，為未來培育超級葡萄提供了理論基礎和新的思路（圖6），標志著葡萄基因組研究邁進新的階段，也必將加速推動我國葡萄種質創(chuàng)新和葡萄產業(yè)的高質量發(fā)展。

圖6-葡萄屬超級泛基因組構建和應用

本次為各位老師帶來重慶醫(yī)科大學黃愛龍教授/唐開福教授團隊在nature子刊?Nature Communications?中發(fā)表的題目為“SARS-CoV-2 N protein-induced Dicer, XPO5, SRSF3, and hnRNPA3 downregulation causes pneumonia”的文章。該文章研究了 SARS-CoV-2 N 蛋白如何影響 RNA 干擾 (RNAi) 和 RNA 剪接途徑，并揭示了這些途徑在 COVID-19 發(fā)病機制中的作用，有助于開發(fā)更有效的 SARS-CoV-2 相關肺炎治療方法。

中文題目：SARS-CoV-2 N蛋白誘導的Dicer、XPO5、SRSF3和hnRNPA3下調導致肺炎

英文題目：SARS-CoV-2 N protein-induced Dicer, XPO5, SRSF3, and hnRNPA3 downregulation causes pneumonia

發(fā)表期刊：Nature Communications?

影響因子：14.7

合作單位：重慶醫(yī)科大學

百邁客生物為該研究提供了小RNA測序和ONT全長轉錄組測序服務。

研究背景

2019 冠狀病毒病 （COVID-19） 由嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒 2 （SARS-CoV-2） 引起，具有高度異質性，且發(fā)病病例分布在各個年齡群體中，但重癥及死亡率明顯字老年群體比較集中。DNA 損傷是導致衰老的關鍵因素，也是 COVID-19 發(fā)病機制的驅動因素，蛋白質穩(wěn)態(tài)喪失是衰老的另一個標志，會導致不受抑制的炎性小體激活、功能失調的細胞器積累和細胞損傷，可能導致 COVID-19 的發(fā)病機制。Dicer 是 RNA 干擾 （RNAi） 通路的關鍵組成部分，在衰老過程中下調， RNAi 組分的敲除會導致 DNA 損傷，并且可能由于 miRNA的整體下調而增加蛋白質合成，從而影響蛋白質穩(wěn)態(tài)，與年齡相關的剪接因子失調發(fā)生在不同生物體的多個組織中，并且與基因組穩(wěn)定性和蛋白質穩(wěn)態(tài)有關，可通過R環(huán)誘導 DNA 損傷。然而，RNAi 成分及RNA 剪接因子在 COVID-19 發(fā)病機制中的確切作用還有待明確。

材料和方法

材料：異位表達 N 蛋白的人肺癌 （A549） 和人正常肺上皮 （BEAS-2B） 細胞系 ，N 蛋白誘導的雄性肺損傷小鼠及正常對照 C57BL/6J 雄性小鼠；

方法：小RNA測序+ONT全長轉錄組+免疫組化+RIP等

研究結果

1.SARS-CoV-2核衣殼 （N） 蛋白誘導自噬降解及DNA損傷的作用機制

通過對已發(fā)表的COVID-19 患者RNA測序數(shù)據的分析，確定了重癥 COVID-19 患者 M-MDSC 中 RNAi 成分和剪接因子的 mRNA 水平低于無癥狀 COVID-19 患者，且已故 COVID-19 患者肺組織中的 RNAi 成分和剪接因子水平也低于未感染 COVID-19 的個體，表明RNAi 成分和剪接因子的表達減少與 COVID-19 感染加重有關。

細胞沉默逆轉測定使用含有內含子的熒光素酶報告基因小基因證明了 SARS-CoV-2 抑制了該小基因的剪接。該研究從相互作用數(shù)據集的生物通用存儲庫 （BioGRID） 中檢索了 N 蛋白的推定蛋白質相互作用子，并用免疫共沉淀測定證實了異位表達 N 蛋白的人肺癌 （A549） 和人正常肺上皮 （BEAS-2B） 細胞系中 N 蛋白與?Dicer、XPO5、SRSF3和hnRNPA3?之間的相互作用，進一步定量測定結果發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2 感染導致?Dicer、XPO5、SRSF3和hnRNPA3在蛋白水平上下調，但在 mRNA 水平上不下調，而自噬抑制劑氯喹或巴弗洛霉素 A1 治療可緩解 N 蛋白或 SARS-CoV-2 誘導的?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?下調，用蛋白酶體抑制劑 MG132 處理并無效果，表明?N 蛋白對?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?蛋白表達的影響是自噬依賴性的。

在 BioGRID 數(shù)據庫中找到了一種自噬受體蛋白SQSTM1/p62 ，共聚焦顯微鏡分析和免疫共沉淀分析分別證實了 N 蛋白和 p62 之間的相互作用及其共定位，p62 敲低部分緩解了 N 蛋白誘導的?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?蛋白的下調；然而，它不會影響不表達 N 蛋白的細胞中的?Dicer、XPO5、SRSF3?或?hnRNPA3?蛋白水平，表明?p62 通過與 N 蛋白的相互作用將 N 蛋白相互作用蛋白（包括?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3）募集到吞噬細胞中，導致自噬降解。

ATM等的磷酸化、DNA 斷裂積累等病灶形成證明了異位 N 蛋白表達或 SARS-CoV-2 感染誘導了 DNA 損傷，敲低?Dicer、XPO5、SRSF3?或?hnRNPA3?導致 DNA 損傷，而它們的過表達部分減輕了 N 蛋白誘導的 DNA 損傷，同時異位 N 蛋白表達或 SARS-CoV-2 感染誘導了 R 環(huán)積累，進一步誘導DNA損傷，RNase H1（一種降解 R 環(huán)的 RNA 部分的核糖核酸內切酶）的過表達部分減輕了這種影響并減少了 DNA 損傷積累，總的來說，這些發(fā)現(xiàn)表明?N 蛋白誘導的 Dicer 、 XPO5 、 SRSF3 和 hnRNPA3 表達下調導致 DNA 損傷。

2.SARS-CoV-2 N蛋白通過抑制 miRNA 生物發(fā)生及抑制 RNA 剪接作用機制

XPO5和Dicer在 miRNA 生物合成中起關鍵作用，小 RNA 深度測序顯示，N 蛋白誘導 miRNA 表達的整體下調，對 A549 和 BEAS-2B 細胞中表達量最高的前五個 miRNA進行定量驗證顯示，它們在表達 N 蛋白的細胞和 SARS-CoV-2 感染的細胞中均下調；生化分級分離實驗顯示，異位 N 蛋白表達或 SARS-CoV-2 感染誘導 pre-miRNA 的核保留，如細胞核中 pre-miRNA 水平的增加和細胞質中 pre-miRNA 水平的降低所示，?XPO5過表達后得到緩解。此外，異位 N 蛋白表達或 SARS-CoV-2 感染降低了成熟 miRNA 和 pre-miRNA 之間的比率，Dicer過表達后得到緩解?？傮w而言，這些發(fā)現(xiàn)表明，N 蛋白通過降低?XPO5?表達阻斷 pre-miRNA 從細胞核到細胞質的運輸，并通過下調?Dicer?表達抑制 pre-miRNA 向成熟 miRNA 的加工。

SRSF3或hnRNPA3敲除抑制了含有內含子的報告基因小基因的剪接，證實了它們確實是剪接因子，而它們的過表達部分緩解了 N 蛋白或 SARS-CoV-2 感染對 RNA 剪接的抑制作用，進一步進行全長轉錄組測序，通過可變剪接分析發(fā)現(xiàn)，N 蛋白誘導內含子保留。此外，RT-qPCR證實，異位 N 蛋白表達或 SARS-CoV-2 感染降低了一組內源性內含子的剪接效率，SRSF3?和?hnRNPA3?過表達部分減輕了 N 蛋白和 SARS-CoV-2 對 RNA 剪接的抑制作用，這些結果表明，N 蛋白通過降低?SRSF3?和?hnRNPA3?的表達來抑制 RNA 剪接。

剪接抑制會誘導廣泛的 IR 和隨后的內含子保留 mRNA 的翻譯，一部分內含子衍生的多肽容易縮合且具有蛋白毒性，用嘌呤霉素對新生多肽進行代謝標記，結果顯示異位 N 蛋白表達或 SARS-CoV-2 感染誘導不溶性蛋白合成增加，而N蛋白與RNA的結合主要在可溶性蛋白部分被檢測到，免疫熒光檢測結果表明，N 蛋白和 SARS-CoV-2 感染誘導了 EGFP 聚集體的產生，誘導蛋白毒性應激。

3.SARS-CoV-2 N 蛋白在蛋白水平的影響及動物模型驗證

盡管異位 N 蛋白表達或 SARS-CoV-2 感染導致 4EBP1 去磷酸化，但它增加了整體蛋白質合成，而沒有顯著影響 S6K1 磷酸化，對照組的刺突蛋白和膜蛋白對整體蛋白質合成沒有影響，而包膜蛋白甚至抑制了整體蛋白質合成，Dicer?或?XPO5?敲低導致 JNK 激活和 4EBP1 去磷酸化，同時略微增加 S6K1 磷酸化并促進蛋白質合成，表明 N 蛋白通過降低?Dicer?和?XPO5?表達來促進蛋白質合成，并通過下調?SRSF3?和?hnRNPA3?表達來抑制蛋白質合成。由于?Dicer?和?XPO5?的下調比?SRSF3?和?hnRNPA3?的下調更顯著地促進蛋白質合成，因此 N 蛋白最終增強了蛋白質合成。

小鼠體內驗證結果顯示， N 蛋白在小鼠肺組織中的表達導致?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?下調、DNA 損傷、胞質 DNA 積累、細胞凋亡、IFNβ、IL-6 和 NKG2D 配體上調，以及伴有明顯巨噬細胞浸潤的肺炎，肺組織中?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?敲低導致肺損傷和肺炎，而它們的過表達部分緩解了 N 蛋白誘導的肺炎，這些結果表明，N 蛋白誘導的?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?蛋白表達下調是 SARS-CoV-2 誘導肺炎的一種機制。

分析已發(fā)表的 3、6、12 和 24 個月齡 C57BL/6J 小鼠肺組織的 RNA 測序數(shù)據，在 8 周齡和 18 個月齡 C57BL/6J 小鼠的 mRNA 和蛋白質水平上證實了肺組織中?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?的年齡依賴性下調， DNA 損傷、細胞凋亡等功能在老年小鼠中明顯富集，結合Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?敲低實驗，表明，Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?的年齡相關下調與 N 蛋白誘導的肺炎嚴重程度增加有關。

PJ34 是一種（ADP-核糖）聚合酶 （PARP） 抑制劑，免疫沉淀結果表明 PJ34 通過阻止 N 蛋白誘導的?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?的下調來緩解肺炎，阿那曲唑是一種增強 Dicer 表達的芳香化酶抑制劑，WB結果表明，阿那曲唑通過促進?Dicer、XPO5、SRSF3?和?hnRNPA3?的表達來緩解 SARS-CoV-2 N 蛋白誘導的肺炎。

思路發(fā)散

本研究通過數(shù)據庫檢索及分子實驗驗證先初步推測SARS-CoV-2 N蛋白的年齡依賴調控機制與RNAi以及可變剪接相關，之后通過組學測序在整體水平上驗證了猜測并進一步細化了調控方式，之后再通過大量過表達及敲降后對應分子在RNA及蛋白水平的定量驗證了結果，是一個比較經典有效的實驗思路，可以在其他實驗中參考。

參考文獻：

Luo YW, Zhou JP, Ji H, Xu D, Zheng A, Wang X, Dai Z, Luo Z, Cao F, Wang XY,Bai Y, Chen D, Chen Y, Wang Q, Yang Y, Zhang X, Chiu S, Peng X, Huang AL, Tang KF. SARS-CoV-2 N protein-induced Dicer, XPO5, SRSF3, and hnRNPA3 downregulation causes pneumonia.?Nat Commun. 2024 Aug 13;15(1):6964. doi:10.1038/s41467-024-51192-1.

本期為各位老師帶來一篇關于小RNA及l(fā)ncRNA研究的高分經典案例解讀，希望能為各位老師后續(xù)研究激發(fā)新的研究思路~

中文題目：Klotho衍生肽1通過轉錄后調控恢復Klotho表達抑制纖維化腎臟細胞衰老

英文題目：Klotho-derived peptide 1 inhibits cellular senescence in the fibrotic kidney by restoring Klotho expression via posttranscriptional regulation[2]

合作單位：南方醫(yī)科大學

發(fā)表期刊：Theranostics?

影響因子：12.4

百邁客生物為該研究提供了miRNA測序服務。

研究背景

慢性腎?。–KD）是一種持續(xù) 3 個月以上的腎功能不全病癥，特征通常是細胞衰老增加、表觀遺傳重編程、持續(xù)的成纖維細胞活化和持續(xù)的細胞外基質（ECM）產生，與老年腎臟存在很多相似之處，因此，CKD現(xiàn)在被認為是一種腎臟過早和加速衰老的狀態(tài)?？顾ダ系鞍?Klotho 屬于由α和β亞型組成的單跨膜蛋白小家族，腎損傷會導致Klotho表達下調，Klotho 缺乏可導致高磷血癥、腎小管細胞衰老和腎纖維化等，進一步加速 CKD的進展，因此Klotho 被認為是腎臟疾病診斷和預后的潛在生物標志物和治療靶點。

然而由于Klotho 是一種大型跨膜蛋白，臨床生產成本高且難度大，因此作者團隊在前期報道了Klotho衍生肽1（KP1） 的發(fā)現(xiàn)，可通過結合TGF-β 受體2（TβR2） 并抑制 TGF-β/Smad3 信號轉導來減輕腎纖維化，且生產上會更便捷經濟，有可能替代 Klotho 進行臨床轉化，為了進一步研究 KP1 在保護腎臟中的作用，作者在本篇研究中檢查了其對細胞衰老的影響。

材料方法

材料：8-10周齡雄性C57BL/6小鼠假手術組（sham）、單側缺血再灌注損傷（UIRI）組別小鼠和治療組別小鼠（UIRI + KP1）共三組小鼠腎臟組織；

方法：miRNA測序+雙熒光素酶報告基因檢測+RNA 熒光原位雜交等

研究結果

WB檢測了許多細胞衰老標志物如p21、p16和γ-H2AX的表達，結果表明了UIRI 誘導纖維化腎中對應標志物的表達，而KP1明顯消除了這種誘導。此外針對其內源Klotho 的檢測也證明UIRI 導致腎臟中Klotho 的丟失而KP1在很大程度上恢復了它們的表達，單側輸尿管梗阻（UUO）誘導的 CKD 模型以及體外細胞模型中也出現(xiàn)了類似的結果，此外，UIRI 還導致 Klotho mRNA 的顯著下調。然而，KP1 不影響 Klotho mRNA 的穩(wěn)態(tài)水平，說明KP1通過獨立于轉錄調控的機制誘導 Klotho。

此外，通過流式細胞術進行的細胞周期分析表明，TGF-β1 孵育后的衰老原代腎小管細胞停滯在 G1 期，這被 KP1 處理抵消，證明了KP1阻斷細胞衰老的能力，而在可以阻斷新mRNA合成的放線菌素D（ActD）存在下與 TGF-β1 孵育后 12 小時和 24 小時，KP1 不會影響 Klotho mRNA 水平，進一步證實了 KP1 誘導 Klotho 蛋白表達而不影響其mRNA和蛋白質穩(wěn)定性。

由于 KP1 不影響 Klotho mRNA 水平和蛋白質穩(wěn)定性，作者開始探索 KP1 是否通過miRNA調節(jié) Klotho 蛋白，在 UIRI 腎臟中鑒定到了68個上調miRNA，在注射 KP1 后恢復到基線，其中 10 個與 Klotho mRNA 的 3′-UTR 特異性結合，其中miR-223-3p表現(xiàn)非常明顯，且在對公共轉錄組數(shù)據集分析后發(fā)現(xiàn)，miR-223-3p 與 Klotho 水平呈負相關，支持了 miR-223-3p 與 Klotho 調節(jié)的相關性。

為了證實 miR-223-3p 在 Klotho 表達中的調節(jié)作用，作者進行了雙熒光素酶報告基因測定，轉染 miR-223-3p 模擬物降低了含有野生型未突變型 Klotho mRNA 序列的報告基因的熒光素酶活性，表明 miR-223-3p 可以特異性靶向 Klotho mRNA，抑制其活性，用miR-223-3p轉染HK-2細胞進一步證明miR-223-3p抑制 HK-2 細胞中 Klotho 蛋白的表達。體內模型原位雜交驗證了miR-223-3p 在 UIRI 腎腎小管上皮中被誘導，而KP1抑制了miR-223-3p表達，結合免疫熒光染色結果證明了KP1 可以通過在體內抑制 miR-223-3p 來恢復 Klotho 表達，在體外的HK-2 細胞中的miR-223-3p及其拮抗劑轉染實驗也呈現(xiàn)出了相同的結果。

為了進一步驗證實驗結果，作者對小鼠模型靜脈注釋miR-223-3p 表達質粒和 KP1構建體內表達模型，結果顯示，miR-223-3p 的過表達加劇了 p16 、 γ-H2AX 、纖連蛋白、 I 型膠原和 α-SMA 的表達，所有這些都被 KP1 抑制，而miR-223-3p拮抗素的注射同樣消除了 UIRI 小鼠中的 p21、p16 和 γ-H2AX、纖連蛋白、膠原蛋白 I 和 α-SMA，恢復了腎功能。而 KP1、SB431542 （TβR1/2 抑制劑） 和 SIS3 （p-Smad3 抑制劑） 處理 TGF-β1 刺激的 HK-2 細胞結果進一步闡明了，KP1 通過阻斷 TGF-β1/Smad3/miR-223-3p 信號傳導來恢復 Klotho 表達并防止細胞衰老。

由于 miRNAs 和 lncRNAs 經常相互作用并相互調節(jié)，作者搜索了幾個 lncRNA-miRNA 相互作用數(shù)據庫，并預測 miR-223-3p 和 lncRNA-TUG1 （牛磺酸上調基因 1） 具有推定的結合位點，雙熒光素酶報告基因測定驗證了miR-223-3p 降低了野生型TUG1報告基因的熒光素酶活性，且在 HK-2 細胞中過表達 miR-223-3p 抑制了 lncRNA-TUG1，而KP1則消除了這個效果，TGF-β1抑制了HK-2細胞中l(wèi)ncRNA-TUG1的表達，而KP1、SB43154或SIS3則消除了此類效果，這些結果表明lncRNA-TUG1受TGF-β/Smad信號傳導的調節(jié)。而LncRNA-TUG1 沉默也降低了 Klotho 蛋白，但沒有降低其 mRNA 水平，說明miR-223-3p 可以與 lncRNA-TUG1 相互作用，形成競爭性內源性 RNA （ceRNA） 網絡，從而放大其在調節(jié) Klotho 表達和細胞衰老中的作用。體內UUO和UIRI 模型中都驗證了這一點。

綜上所述，miR-223-3p 和 lncRNA-TUG1 協(xié)同工作，導致 Klotho 丟失、細胞衰老和腎纖維化，所有這些都被 KP1 緩解。KP1 是一種新發(fā)現(xiàn)的 Klotho 衍生肽，通過恢復 Klotho 表達來抑制細胞衰老，KP1 的這種作用由 miR-223-3p 和 lncRNA-TUG1 介導的轉錄后調節(jié)運作。通過恢復 Klotho 表達，KP1 充當 Klotho 誘導劑，并具有廣泛的腎保護特性，例如抗氧化、抗衰老和干細胞保護，有望將KP1轉化為 CKD 患者的臨床治療。

思路發(fā)散

本研究中利用miRNA測序、公共lncRNA數(shù)據庫以及公共轉錄組數(shù)據集共同分析出了miRNA與lncRNA共同構建ceRNA網絡在轉錄后水平調控蛋白表達的作用機制，對于較新的研究來說，可以直接通過全轉錄組，利用同一來源組織構建兩個文庫（lncRNA及小RNA文庫）得到包括lncRNA、miRNA、mRNA以及circRNA的結果，由此可分析出更可靠的相關性調控網絡，便于篩選關鍵非編碼RNA。

參考文獻：

[1] Chen LL, Kim VN. Small and long non-coding RNAs: Past, present, and future.Cell. 2024 Nov 14;187(23):6451-6485. doi: 10.1016/j.cell.2024.10.024. PMID:39547208.

[2] Zhang X, Li L, Tan H, Hong X, Yuan Q, Hou FF, Zhou L, Liu Y. Klotho-derived peptide 1 inhibits cellular senescence in the fibrotic kidney by restoring Klotho expression via posttranscriptional regulation. Theranostics. 2024 Jan 1;14(1):420-435. doi: 10.7150/thno.89105. PMID: 38164143; PMCID: PMC10750200.

文章標題：Nanoplastics induced health risk: Insights into intestinal barrier homeostasis and potential remediation strategy by dietary intervention

發(fā)表期刊：Journal of Hazardous materials?

影響因子：12.2

合作單位：西北農林科技大學

研究對象：對照組及老化NPs處理小鼠

研究方法：轉錄組+qPCR+ELISA等

百邁客生物為該研究提供了轉錄組測序技術服務。

研究背景

微塑料/納米塑料（MPs/NPs）是由較大的塑料碎片的老化過程形成的，會造成對免疫穩(wěn)態(tài)的破壞和腸道功能障礙，人類攝取MPs/NPs的方式主要是通過攝入食物和飲料，MPs/NPs被魚類或海洋生物攝入后通過食物鏈積累并以食物方式進入人體，老化的納米塑料（NPs）具有獨特的環(huán)境作用特性，如表面粗糙、高氧含量等，有研究強調了老化NPs的潛在危害，但目前的研究為老化NPs污染修復提供了策略，槲皮素的飲食干預是解決老化NPs健康風險的一個新見解。

槲皮素 （Que） 占膳食總黃酮類化合物的 60-75%，是一種天然化合物，存在于人類飲食中的各種食物中，包括蔬菜、水果和茶，Que 及其衍生物可以調節(jié)多個細胞內靶標和細胞信號傳導過程的能力，具有抗氧化和抗炎分子的作用，探索膳食補充劑 Que 是否可以改善 NPs 誘導的腸道屏障功能障礙具有重要意義。本研究通過轉錄組學、組織病理學和免疫學分析探討老化 NPs 暴露下腸道屏障損傷的機制，此外，還評估了 Que 在老化 NPs 暴露下對腸道屏障的積極影響。

材料方法

材料：對照組（攝入去離子水）；老化NPs（攝入146 mg/kg/d老化NPs）；老化NPs+Que（攝入146 mg/kg/d老化NPs和80 mg/kg Que），取三組小鼠的腸道組織；

方法：轉錄組+qPCR+ELISA等

研究結果

采用RNA測序（RNA-seq）檢測老化NPs和Que對腸道的影響，與對照組相比，老化NPs共鑒定出363個差異表達基因（DEGs），包括254/ 109個上調/下調基因，與老化NPs相比，老化NPs+Que組中的DEGs為562個，包括347/215個上調/下調基因，GO富集結果顯示老化NPs暴露后，顯著富集集中在生物過程中，如肌肉細胞命運決定、程序性細胞死亡的調節(jié)和凋亡過程的負調控。

細胞成分中最突出的基因Term是線粒體，鑒定出45個DEGs，值得注意的是，老化的NPs影響了與氧化還原酶活性和泛醌細胞色素-c還原酶活性相關的活性，這些發(fā)現(xiàn)表明，老化的NPs會導致氧化應激、線粒體損傷和細胞凋亡，線粒體損傷激活線粒體凋亡通路，該通路在凋亡中起著重要作用，表明老化的NPs激活線粒體凋亡通路，最終導致細胞凋亡。而增加Que后，差異基因顯著細胞代謝和細胞分解中，如氮化合物代謝、轉移酶活性、正調控DNA修復等，KEGG富集結果顯示，老化NPs組差異基因參與信號轉導、免疫系統(tǒng)、癌癥、轉運和轉分解代謝等通路，Que治療后癌癥的細胞代謝途徑和途徑顯著富集，此外，Que干預改變了自由基代謝，如化學致癌-活性氧和GSH代謝，qPCR結果驗證了相關基因表達。

組織病理學結果顯示，老化NPs組的血清DAO、d-Lac和LPS水平顯著高于對照組，說明老化NPs誘導的腸道通透性增加，而Que降低了這些升高的水平，恢復了腸道屏障的完整性。形態(tài)學結果顯示老化NPs組的腸絨毛結構有萎縮、變形、長度減少等結構損傷，Que治療可減輕老化NPs引起的組織學損傷，促進腸腺體恢復，保留絨毛形態(tài)，減少淋巴細胞浸潤，值得注意的是，Que保護了腸道內部結構，但對腸上皮和管腔之間的界面影響較小。

血清肌酐等指標結果顯示，老化NPs刺激顯著增加了血清中標記物的水平，表明細胞旁通透性增強，Que減弱了細胞旁通透性，恢復了接近對照的標記水平，這些結果說明腸道屏障的破裂主要歸因于腸上皮細胞的丟失和死亡，而不是緊密連接的破壞。磨蝕效應和程序性細胞死亡可能為損傷的主要原因。TUNEL結果顯示，與對照組相比，老化NPs組的熒光標記細胞更多，而老化NPs+Que染色的上皮細胞數(shù)量減少，表明Que對上皮細胞凋亡具有保護作用。JNK通路的激活通過bax-線粒體途徑促進細胞凋亡，MAPK信號通路是KEGG富集通路之一，它在細胞凋亡過程中起著至關重要的作用，p-JNK作為MAPK通路的一個主要分支，p-JNK在老化NPs組顯著增強，此外，衰老的nps也增加了JNK的靶蛋白c-Jun的磷酸化水平，結果表明，老化NPs通過JNK信號通路激活bax-線粒體凋亡通路，從而誘導細胞凋亡。在老化NPs處理中，DHE染色顯示出較高的紅色熒光密度和明顯的亮點，表明ROS水平較高，而在老化NPs+Que中沒有，添加Que顯著降低了老化NPs處理后高過氧化氫和?O2-的存在，NOX活性測定結果顯示，與對照組相比，老化NPs和老化NPs+Que處理均導致NOX活性增加，且之間無顯著差異，表明Que的主要作用是作為一種自由基清除劑，而不是一種自由基生成的抑制劑。

為了探討細胞凋亡的發(fā)生機制，該研究分析了細胞超微結構的改變和凋亡相關蛋白的表達，正常腸內細胞核完整，細胞膜光滑，微絨毛排列整齊，線粒體結構清晰，暴露于老化NPs會導致腸上皮細胞中微絨毛的部分缺失，此外，還發(fā)生了細胞扭曲，細胞分裂包括細胞核解體（黑色箭頭）、染色質凝結（紅色箭頭）和細胞質密度增加。老化NPs小鼠的線粒體出現(xiàn)水腫、空泡化和破裂，并伴有嵴的紊亂和破壞（黃色箭頭），提示細胞凋亡和線粒體損傷。老化NPs+Que小鼠的微絨毛排列更長、更有規(guī)律，表明Que對老化NPs誘導的損傷有有益作用。

此外，Que減輕了腸道內線粒體的混亂和空泡化，同時也消除了凋亡小體。與對照組和老化NPs組相比，老化NPs+Que組的細胞核中Nrf2水平顯著升高，相反，在老化NPs+Que處理后，細胞質中Nrf2含量下降，這表明Que誘導的Nrf2核易位增強，與對照組相比，老化NPs導致p-p38/總p38、p-JNK/總JNK和p-c-Jun/cJun的比值顯著增加，然而，在老化NPs+Que中觀察到它們的顯著減少。這表明Que抑制了p38、JNK和c-Jun的磷酸化。

研究總結

總的來說，該研究發(fā)現(xiàn)了膳食化合物對改善NPs引起的腸道損傷的潛力，老化NPs激活了免疫防御，最終增加了ROS的生成，引起全身炎癥，其誘導的JNK磷酸化觸發(fā)了c-Jun/AP-1靶基因的表達，促進了線粒體Bax易位，最終導致凋亡過程。Que作為一種外源性膳食抗氧化劑，促進Nrf2轉位到細胞核，上調其下游靶基因HO-1和GSH，有效降低老化NPs誘導的腸道ROS水平和氧化應激。此外，Que刺激了MKP-1和GSTπ的表達，從而抑制了MAPK中關鍵酶的激活，從而逆轉了老化NPs誘導的細胞凋亡和炎癥反應。然而，Que可能不能有效緩解老化NPs引起的機械損傷，有待進一步研究揭示其潛在機制，結果表明，Que可減輕因消耗老化NPs而引起的腸道氧化應激、炎癥和細胞凋亡，因此，富含Que的飲食在解決和逆轉老化NPs造成的腸道損傷方面具有重要的前景。它證明了NPs的環(huán)境相關毒性，并為糾正NPs污染造成的人類健康風險提供了一種可能的飲食策略。

參考文獻：

Meng X, Ge L, Zhang J, Xue J, Gonzalez-Gil G, Vrouwenvelder JS, Guo S, Li Z.Nanoplastics induced health risk: Insights into intestinal barrier homeostasis and potential remediation strategy by dietary intervention. J Hazard Mater.?2024 Jul 5;472:134509. doi: 10.1016/j.jhazmat.2024.134509. Epub 2024 May 3.

文章標題：Metabolomics and transcriptomic profiles reveal membrane lipid metabolism being an important factor of sliced taro browning

期刊名稱：Postharvest Biology and Technology

影響因子：7.0

合作單位：韶關學院和華南農業(yè)大學

研究對象：芋頭

研究方法：生理、轉錄組學、代謝組學等

百邁客生物為該研究提供了植物廣靶、轉錄組測序和分析服務。

研究背景

在飲食中加入更多的新鮮蔬菜可以帶來許多健康益處，包括降低對慢性疾病的易感性和減緩衰老過程。市場上根莖類蔬菜切根產品的保質期短，破壞了這些優(yōu)勢。切面褐變是限制切片蔬菜產品壽命的主要因素之一。因此，了解切片產品褐變背后的機制對于開發(fā)創(chuàng)新技術至關重要，這些技術可以在儲存和消費過程中有效地保持這些產品的營養(yǎng)價值和整體質量。

實驗材料

本研究選用購自中國韶關的“冰瑯玉”品種(Colocasia esculenta)。用于調查的芋頭大小相似，從大約800克到1000克不等，沒有任何明顯的缺陷或機械損傷。這些選定的芋頭被迅速運送到實驗室，為了確保清潔，在削皮和切割之前，要用自來水沖洗掉芋頭球莖表面殘留的淤泥。然后，將芋頭削皮，切成約1厘米厚的薄片作進一步實驗。首先用次氯酸鈉溶液(0.1 g/L)對芋頭切片進行滅菌。隨后，將無菌芋頭片密封在聚乙烯袋中(0.02 mm厚，尺寸為20 × 30 cm) (Xiao et al, 2020)。最后，芋頭切片冷藏(4℃)， RH為90-95%，持續(xù)12天。樣品每隔2天采集一次，用于后續(xù)分析。在第0天(C0)、第6天(C6)和第12天(C12)獲得的樣本用于植物廣靶代謝組學和轉錄組學分析。

研究結果

1.生理分析——冷庫條件下芋頭片褐變評價

芋片切面顏色隨貯藏時間的變化如圖1A所示。切面L*值從0 d時的88.72下降到12 d時的80.36，冷藏12 d后L*值下降了9%(圖1A)。芋頭切片表面的a*、b*、△E和BI值在冷藏過程中也表現(xiàn)出類似的變化趨勢(圖1B-E)。這些褐變指標隨著貯藏時間的延長而增加。冷藏12 d后，a*、b*、△E和BI值分別比0 d增加了582%、58%、725%和19%(圖1B-E)。宏觀褐變癥狀在第6天首次出現(xiàn)，并在隨后的儲存過程中逐漸加劇(圖1F)。綜上所述，這些結果表明，即使在低溫(4℃)條件下，切片芋頭在儲存過程中也會發(fā)生褐變。

為了闡明切片芋頭褐變的機制，研究人員分別在第0天、第6天和第12天對芋頭樣品進行了轉錄組學和代謝組學分析。

圖1-4℃貯藏期間切片芋頭的褐變發(fā)展

2.代謝組分析——切片芋頭褐變過程代謝組學分析

為了比較芋頭切片褐變過程中三個階段代謝物組成的差異，研究通過植物廣靶代謝組學分析，總共成功鑒定了芋頭切片中的638種代謝物。PCA分析顯示，三個儲存點采集的芋頭樣品具有明顯的分離性(圖2A)。在C0 vs C6中，共鑒定出206個DAMs，其中99個DAMs的豐度增加，107個DAMs的豐度減少。C6 vs C12共197個DAMs，分別有84個DAMs豐度增加，113個DAMs豐度減少。C0 vs C12包括119個DAMs，分別有51個DAMs和68個DAMs顯示豐度增加和減少(圖2B)。這些結果表明，在褐變過程中，代謝物豐度的減少幅度更大。

韋恩圖分析評估每個差異分組特有和共有的DAMs (圖2C)。圖2D-F展示了每個比較組中豐度增加和減少的top20的DAMs。C6組中10個代謝物豐度升高，如2′-脫氧腺苷、3-O-對香豆?？鼘幩?、n -乙酰- l -蘇氨酸、松柏醛、9(10)-EpOME、6-O-咖啡酰丁醇、表肌醇、l -同型半胱氨酸、5-O-對香豆酰奎寧酸、異鼠李素。相反，琥珀酸酐、9-(阿拉伯糖基)次黃嘌呤、氨基丙酸、N6-(2-羥乙基)腺苷、2-(二甲氨基)鳥苷、芐基-(2 ‘-O-木糖基)葡萄糖苷、鳥苷、肌苷、D-甘露糖和肌苷5 ‘ -單磷酸在C6組中的豐度較低(圖2D)。

在C6和C12中，9(10)- epOME、n -乙酰- l-蘇氨酸、2 ‘ -脫氧腺苷、松木醛、2-亞麻油基甘油-1,3-二- O-葡萄糖苷、6- O -對咖啡酰基熊果甙、5-O-對香豆酰基奎寧酸、異鼠李素、反式- 4-羥基肉桂酸甲酯和3- O -對香豆?；鼘幩嵩贑12組中表現(xiàn)出更高的富集度。相反，9-(阿拉伯糖基)次黃嘌呤、酪氨酸、S-Aiiyl-L-半胱氨酸、8，11，14-二十烷三烯酸甲酯、L-蛋氨酸甲酯、LysoPC17:0、鳥苷、肉桂酸、11、14、17-二十碳三烯酸和黃嘌呤在C6組中具有更高的豐度(圖2E)。

在C0和C12中，9(10)- epOME、n -乙酰- L-蘇氨酸、2 ‘ -脫氧腺苷、5- O -對香豆酰基奎寧酸、2-亞麻油基甘油-1,3-二- O -糖苷、松木醛、6- O -對咖啡酰基熊果甙、異鼠李素、3-O-對香豆?；鼘幩岷头词?4-羥基肉桂酸甲酯在C12組中含量較高。相反，9-(阿拉伯糖基)次黃嘌呤、肌苷、S – aiiyl -L -半胱氨酸、8，11，14-二十烷三烯酸甲酯、L-蛋氨酸甲酯、LysoPC17:0、鳥苷、肉桂酸、11、14、17-二十碳三烯酸和黃嘌呤在C0組中表現(xiàn)出更高的豐度(圖2F)。

圖2-切片芋頭植物廣靶代謝組分析

3.代謝組分析——切片芋頭褐變過程中DAMs的積累模式

為進一步分析代謝物在9個樣本的積累模式，該研究進行了聚類熱圖分析。結果顯示，隨著貯藏時間的延長，褐變程度逐漸增加，推測持續(xù)增加的DAMs可能有助于切片芋頭的褐變或促進其褐變過程。因此，該研究關注分析在褐變過程中豐度持續(xù)上升的DAMs (圖3B-L)。確定了11個DAMs在褐變過程中豐度持續(xù)增加，如2-α-亞麻烯酰甘油、甘油亞油酸、(9Z,11E)-十八烯二烯酸、N-油基乙醇胺、γ-亞麻酸、1-亞麻油基甘油、2-亞麻油基甘油、N-α-乙酰基- L-鳥氨酸、α-亞麻酸、9-羥基-10、12-十八烯二烯酸和1-α-亞麻烯酰甘油。值得注意的是，在這11個DAMs中，有10個是脂肪酸或脂質衍生物。幾種褐變指標與這些水DAMs之間的相關系數(shù)非常高。這些結果表明，在切片芋頭中脂質代謝與褐變發(fā)展之間存在潛在的聯(lián)系。

圖3-切片芋頭中差異代謝物(DAMs)的積累模式

4.轉錄組分析——冷藏芋頭切片褐變過程的轉錄組學分析

為了更好地了解基因表達的變化，該研究進行比較轉錄組分析。結果顯示許多基因在芋褐變過程中表現(xiàn)出不同的表達譜。具體來說，在C0和C6的比較中，鑒定出3103個表達上調的基因和1685個表達下調的基因。同樣，在C6和C12組的比較中，發(fā)現(xiàn)3021個DEGs上調，2350個DEGs下調。此外，與C0組相比，C12組有5108個基因的表達量更高(圖4A)。在褐變過程中發(fā)現(xiàn)了更多的上調基因，表明芋頭的基因表達發(fā)生顯著的變化。有趣的是，當比較C0與C6、C6與C12、C0與C12之間的DEGs時，發(fā)現(xiàn)1396個DEGs重疊(圖4B)。

根據褐變過程中的表達模式，將DEGs分為6個簇。每個聚類(從1到6)分別由1607、1293、533、1741、634和2470個度組成(圖4C)。KEGG富集分析顯示，簇1中有四個途徑的DEGs顯著富集:α-亞麻酸代謝、生物素代謝、植物-病原體相互作用以及淀粉和蔗糖代謝(圖4D)。此外，集群2中的DEGs在α-亞麻酸代謝、植物-病原體相互作用以及倍半萜和三萜生物合成途徑中富集(圖4E)。

圖4-切片芋頭褐變過程中的轉錄組學分析

5.聯(lián)合分析——基因共表達網絡構建

為了進一步研究脂質代謝與冷藏芋頭切片褐變之間的關系，研究采用WGCNA分析進行研究。如圖5A所示，鑒定出兩個與切片芋頭在冷藏期間褐變發(fā)育顯著相關的模塊。藍色模塊中基因與褐變BI、a*、b*、△E 4項指標呈正相關，而綠松石模塊中基因與褐變指標呈負相關(圖5B)。此外，隨著褐變的發(fā)展，藍色模塊中基因的表達量逐漸增加，而綠松石模塊中基因的表達量逐漸減少(圖5C)。此外，藍色和綠松石模塊中每個基因與褐變的相關性都很高(圖5D)，說明這兩個模塊的基因與冷藏芋頭片的褐變發(fā)育高度相關。

切片芋頭的褐變與藍色模塊中的基因正相關，對該模塊中的基因進行了KEGG富集分析。在top20個富集的KEGG通路中，泛素介導的蛋白水解、α-亞麻酸代謝和谷胱甘肽代謝是富集最顯著的通路。尤其是α-亞麻酸代謝途徑和甘油脂代謝途徑中分別富集了14個和18個基因(圖5E)。這些結果為脂質代謝參與切片芋頭褐變的事實提供了進一步的線索。

圖5-WGCNA對模塊與性狀的相關性分析

6.基因驗證——參與亞麻酸代謝的DEGs的表達模式

為了驗證RNA-seq數(shù)據的質量，研究檢測了亞麻酸代謝途徑中DEGs的表達模式。在切片芋頭褐變過程中，該途徑中的DEGs差異表達(圖6A)。在這些基因中，4個基因(taro_028466、029177、001379和new gene_1582)的表達量在第6天較0天下降(圖6A)。10個基因(taro_026230、017933、007794、026197、032526、040173、011856、050352以及new gene_27424和3563)的表達量在第6天出現(xiàn)了增加，隨后又出現(xiàn)了下降。然而，這些基因在第12天的表達水平仍然高于第0天(圖6A)。其余15個基因在褐變過程中表現(xiàn)出穩(wěn)定的表達增加。這些結果再次證實了亞麻酸代謝參與了芋頭褐變過程。

作者選擇了5個DEGs進行qRT-PCR分析(圖6B-F)。隨著貯藏時間的延長或褐變程度的惡化，這5個基因的表達量均呈上升趨勢。此外，通過RNA-seq和qRT-PCR分析確定的這些基因的總體表達模式高度一致(圖6B-F)，證實了轉錄組學數(shù)據的可靠性。

圖6-亞麻酸代謝途徑中DEGs的表達模式

7.基因驗證——在褐變過程中，膜脂過氧化作用加劇

上述結果表明，膜脂代謝可能在芋頭褐變過程中起一定作用。為了進一步研究，評估了參與膜脂過氧化的關鍵DEGs的表達譜，如脂肪酶(LIP)和脂氧合酶(LOX)。三個差異表達的LIP基因在褐變過程中表達持續(xù)增加。LOX基因，除了8個LOX基因在褐變過程中逐漸增加，其他基因在褐變過程中表達先增加后下降 (圖7a)。這些結果表明，新鮮切割操作(如剝皮和切割)激活了芋頭的脂質過氧化過程。

丙二醛通常被認為是植物脂質過氧化的生物標志物。為了監(jiān)測切片芋頭褐變過程中膜脂過氧化情況，測定了LOX活性和MDA含量。隨著時間的推移，LOX活性和MDA含量隨著褐變繼續(xù)進行逐漸升高 (圖7B, C)。這些結果表明，在褐變過程中，膜脂過氧化加劇。此外，相關分析顯示，LOX活性、MDA含量和其他褐變指標之間存在很強的相關性?(圖7D)。這些結果進一步支持了膜脂過氧化和/或代謝參與芋頭褐變。

圖7-膜脂過氧化的評價

研究總結

切面褐變的發(fā)生是鮮切行業(yè)中切片芋頭生產和商業(yè)化的一個重要障礙。代謝組學分析顯示，在芋頭褐變過程中，亞麻酸及其衍生物以及氫過氧化物的含量增加，表明發(fā)生了膜脂降解。RNA-seq分析顯示，參與褐變過程的DEGs富集于α-亞麻酸代謝途徑。WGCNA分析得到了兩個與芋頭褐變密切相關的模塊，其中藍色模塊的基因與BI呈正相關，強化了膜脂代謝與芋頭褐變之間的聯(lián)系。隨著芋頭褐變的進行，LOX基因的表達和蛋白活性以及MDA的水平增加，表明膜脂過氧化促進了切片芋頭褐變。總之，該研究結果強調了膜脂代謝在切片芋頭褐變中的重要性。這項研究通過轉錄組和植物廣靶代謝組分析全面研究了芋頭褐變的機制。

四川省人民醫(yī)院龔波研究員在Journal of Genetics and Genomics雜志發(fā)表題為“ Epigenetic and transcriptional activation of the secretory kinase?FAM20C?as an oncogene in glioma ” 的研究論文，結合ATAC-seq與ONT全長轉錄組，揭示FAM20C在神經膠質瘤中的致癌作用等。

中文標題：全長轉錄組及ATAC協(xié)助解析神經膠質瘤致癌基因FAM20C調控

英文標題：Epigenetic and transcriptional activation of the secretory kinase?FAM20C?as an oncogene in glioma

期刊名稱：Journal of Genetics and Genomics

合作單位：四川省人民醫(yī)院

研究對象：神經膠質瘤及配套癌旁組織

測序技術：ONT全長轉錄組+ATAC-seq+qPCR+免疫組化等

百邁客為該研究提供了全長轉錄組及ATAC等測序技術服務。

研究背景

神經膠質瘤是神經系統(tǒng)中最常見的原發(fā)性腫瘤，攻擊力極強，約占所有腦腫瘤的80%，目前主要的癌癥治療方案，包括手術切除、放療和化療，都會導致預后不良和高死亡率，很難對膠質瘤提供理想的治療效果，因此現(xiàn)在迫切需要探索新的有效策略以及膠質瘤治療的潛在治療靶點。長讀長RNA測序技術已應用在包括肝細胞癌和非小細胞肺癌等多種癌癥類型中，ATAC-seq也已經應用于胰腺癌、胃癌和乳腺癌等多種腫瘤研究中。FAM20C是一種可調節(jié)分泌途徑中的各種網絡的分泌蛋白，主要負責礦化激酶，然而越來越多的研究表明，FAM20C?與包括包括乳腺癌、膀胱癌和結直腸癌在內的多種癌癥廣泛相關。

材料方法

材料：神經膠質瘤及配套癌旁（病灶旁2cm處）組織樣本

方法：ONT全長轉錄組+ATAC-seq+qPCR+免疫組化等

研究結果

用三對膠質瘤及癌旁組織作為發(fā)現(xiàn)組進行了ONT全長轉錄組測序，之后又用另外6對膠質瘤及癌旁組織作為鑒定組進行了ONT全長轉錄組測序，兩次測序中發(fā)現(xiàn)共有差異基因（DEG）503 個，在癌癥相關通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路和Ras信號通路中顯著富集。另外，差異基因也在神經元活動通路中富集，表明神經元激活與神經膠質瘤有關，這與最近的研究一致，已經有研究證明，突觸粘附分子神經粘附蛋白-3（NLGN3）的活性依賴性裂解和分泌介導了腦癌神經調控，有助于通過PI3K-mTOR途徑促進神經膠質瘤增殖，而PIK3CA 變體已被證明在神經膠質瘤發(fā)生過程中選擇性地啟動大腦過度活躍，并在神經元環(huán)境的腫瘤重塑中增加活性發(fā)揮重要作用。因此，鑒定出的神經元活動相關DEGs為神經元和膠質瘤細胞之間串擾的前瞻性研究奠定了基礎。

APA分析結果顯示，在發(fā)現(xiàn)數(shù)據集以及鑒定數(shù)據集中，共鑒定到了12492個APA事件，兩組各自有97例和260例APA事件顯示出顯著差異，且各有52例和65例APA在兩組中顯示存在多A位點，為了分析APA事件與差異表達基因的關系，結果中比較了差異APA及差異基因集合，發(fā)現(xiàn)大部分共有基因在神經膠質瘤中APA 信號和表達都呈現(xiàn)較低水平，這意味著更多的多聚腺苷酸化可能有助于 mRNA 的穩(wěn)定性。神經膠質瘤中的APA事件與基因表達高度相關，表明APA事件在這些基因的失調和膠質瘤發(fā)病機制中起著關鍵作用。

為了探究神經膠質瘤中基因的轉錄調控，對發(fā)現(xiàn)數(shù)據集中的6個樣本進行了ATAC測序，鑒定出與1129個基因關聯(lián)的1176個差異峰（DPs），如預期所料，大多數(shù)DPs分布在基因結構的近端啟動子區(qū)域，結果中觀察到兩個增加的Glypican 1（GPC1）DPs信號，其中一個位于啟動子中，另一個位于第一個內含子區(qū)域。此外，在神經膠質瘤樣本中還觀察到蛋白酪氨酸磷酸酶受體 B 型 （PTPRB） 的 DP 信號降低（內含子區(qū)），隨后將1129個DPs相關基因和503個常見DEGs進行比較，找到交集的22個基因，結合CGGA數(shù)據庫分析對應表達，發(fā)現(xiàn)有16個基因顯著差異表達，針對這16個基因的患者生存率分析發(fā)現(xiàn)，僅?RAB3A?和?FAM20C?同時具有預后及臨床的意義，另外這22個基因中，NPTN基因也是目前研究熱度較高的基因。通過qRT-PCR和免疫組化（IHC）染色驗證了NPTN和FAM20C在我們收集的神經膠質瘤樣本中的表達，在膠質瘤較高階段的樣品中觀察到NPTN的表達顯著降低，相反，FAM20C在神經膠質瘤樣本中的表達顯著增加，特別是在IV期，IHC 染色進一步驗證了?NPTN?通過抑制神經膠質瘤進展到晚期來抵消?FAM20C?的致癌功能。

最后，為了探索與神經膠質瘤中?FAM20C?和?NPTN?失調相關的轉錄因子，從在線數(shù)據庫 ChIP-Atlas 下載組蛋白標記物（H3K4me 和 H3K27ac）的 ChIP 數(shù)據，并用TCGA數(shù)據集驗證這些轉錄因子在FAM20C或NPTN中的表達，最終結果表明，在TCGA數(shù)據集中，REST與FAM20C的相關系數(shù)最高。鑒定出兩個反式活性因子（BRD4 和 REST）與?FAM20C?和?NPTN?均呈正相關。結合染色質可及性、TFs 結合位點和 APA 分析共同影響基因表達，結果表明，神經膠質瘤樣本中NPTN的表達顯著降低，而在神經膠質瘤中觀察到的峰值信號增加。此外，神經膠質瘤中NPTN的APA數(shù)量明顯小于對照組。因此，提出了APA編號在神經膠質瘤中NPTN基因表達的轉錄調控中占主導地位的假設，本研究開創(chuàng)了FAM20C在神經膠質瘤中的臨床意義、體外功能和樞紐轉錄因子。值得注意的是，F(xiàn)AM20C 抗體顯著消除了?FAM20C?異位表達引起的腫瘤大小增加，總之，本項研究證明了轉錄激活的?FAM20C?是一種致癌基因，對神經膠質瘤具有治療意義。

參考文獻：

Gong B, Liang Y, Zhang Q, Li H, Xiao J, Wang L, Chen H, Yang W, Wang X, Wang Y, He Z. Epigenetic and transcriptional activation of the secretory kinase?FAM20C?as an oncogene in glioma.?J Genet Genomics. 2023 Jun;50(6):422-433. doi:10.1016/j.jgg.2023.01.008. Epub 2023 Jan 25.

中文標題：基于銥（III）的PD-L1激動劑調節(jié)p62和ATF3用于增強癌癥免疫治療

英文標題：Iridium(III)-Based PD-L1 Agonist Regulates p62 and ATF3 for Enhanced Cancer Immunotherapy

期刊名稱：Journal of Medicinal Chemistry

影響因子：7.3

合作單位：南京師范大學

百邁客生物在該研究中提供了轉錄組測序及部分數(shù)據分析服務。

研究背景

金屬復合物是一種靶向細胞器誘導的免疫原性細胞死亡（ICD）的抗癌藥物，可用于乳腺癌和結腸癌的抗腫瘤免疫治療，然而，腫瘤細胞可能在治療后自適應表達PD-L1，從而刺激腫瘤自我保護機制，進一步加劇免疫抑制腫瘤微環(huán)境（TME），阻礙效應T細胞的浸潤和激活。PD-1是一種調節(jié)T細胞衰竭的核心細胞表面受體，T細胞會由于PD-1與PD-L1（PD-1配體）結合而失活，導致腫瘤免疫逃逸，阻斷PD-1/PD-L1通路可以逆轉TME，增強內源性抗腫瘤免疫應答，然而以PD-L1高表達為特征的免疫原性腫瘤或“熱腫瘤”相對于“冷腫瘤”（非免疫原性）來說，對ICB（免疫檢查點阻斷）治療更為敏感，因此，一種基于促進PD-L1表達水平的策略有望將“冷腫瘤”轉化為“熱腫瘤”，并提高ICB的治療效果。

為了有效刺激PD-L1的表達，本文研究團隊根據之前的工作，合成了激動劑Ir-UA（銥-松蘿酸）復合物，Ir-UA主要作用于線粒體，導致嚴重的線粒體功能障礙，包括產生過量活性氧（ROS）和線粒體膜電位（MMP）喪失。線粒體氧化磷酸化（OXPHOS）和糖酵解均受到抑制，從而阻止了A549細胞從代謝適應中的治療性逃逸。

材料方法

材料：Ir-UA處理前后的A549細胞（人非小細胞肺癌細胞系）；

方法：轉錄組+免疫熒光+WB（蛋白印跡分析）+ROS檢測+線粒體膜電位檢測等

研究結果

據報道，天然產物UA（松蘿酸）具有刺激ATF3表達的能力，產生顯著的ROS來啟動氧化應激。然而，UA的溶解度和生物利用度極低，而研究團隊之前報道過線粒體靶向復合物Ir-NH2，可通過p62積累阻斷線粒體吞噬對NSCLC A549細胞的抗增殖能力，而PD-L1水平的上調不顯著，于是研究團隊結合IrNH2和UA合成了復合物Ir-UA，實現(xiàn)了通過p62和ATF3的同時促進來啟動PD-L1的顯著過表達，產生“1+1>2”的效果。

為了證明Ir-UA對PD-L1表達的強大調節(jié)能力，研究團隊進行了轉錄組分析，并比較了Ir-UA處理前后的基因表達情況，KEGG分析結果表明，癌癥進展的各種途徑顯著變化。例如，在Ir-UA處理后觀察到與PD-L1表達高度相關的信號通路，如磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-AKT信號通路、Janus激酶/信號傳感器和轉錄激活因子（JAKSTAT）信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路等。此外，還檢測到控制先天或適應性免疫細胞的信號通路，如核因子-κB（NF-κB）信號通路、細胞因子?細胞因子受體相互作用，白細胞介素17（IL-17）信號通路，腫瘤壞死因子信號通路等，它們對從“冷腫瘤”向“熱腫瘤”的轉變和克服αPD-L1耐藥性起到了重要作用。GSEA結果顯示吞噬小體和OXPHOS顯著富集，提示Ir-UA可能觸發(fā)自噬小體的形成并抑制OXPHOS。值得注意的是，包括ATF3在內，癌癥中的PD-L1的表達和PD-1檢查點通路也顯著富集，這些結果證實了IrUA增強了PD-L1相關基因的轉錄。細胞毒性評估結果顯示，與A549細胞相比，Ir-UA對正常HLF細胞的半抑制濃度高了5倍，據推測，利用PD-L1作為治療靶點，可能通過選擇性地調節(jié)TME中的免疫反應來降低毒性。與Ir-NH2相比較，Ir-UA的親脂性以及A549細胞線粒體中的積累量均有明顯提升，進一步證實了Ir-UA具有較強的線粒體靶向能力。

為了進一步探討Ir-UA誘導線粒體功能障礙的復雜機制，該研究利用ROS檢測及流式細胞術檢測到，在Ir-UA處理的A549細胞中，ROS顯著增加，MMP顯著喪失，說明Ir-UA可誘導細胞內ROS的過量產生，導致線粒體損傷。此外作者還測量了細胞外酸化率（ECAR），與未處理的A549細胞相比，Ir-UA處理后的基礎糖酵解、糖酵解能力和糖酵解儲備也受到抑制。

這些結果表明，Ir-UA不僅抑制OXPHOS，還抑制糖酵解，從而切斷它們之間的轉換，最終導致細胞死亡。結合WB結果，該研究證實了Ir-UA可以阻斷A549細胞的自噬，誘導p62的積累，從而可能促進PD-L1的表達。結合RNA-seq結果中PD-L1相關基因表達水平變化和自噬阻斷的變化，作者綜合了免疫印跡及流式細胞術的結果，表明Ir-UA可誘導腫瘤細胞中PD-L1的高表達，這可能是由自噬阻斷和ATF3上調的協(xié)同作用引起的，有望導致“冷腫瘤”向“熱腫瘤”的過渡。之后，該研究在皮下移植的LLC細胞腫瘤小鼠模型中驗證了其抗腫瘤效果，證實，Ir-UA和αPD-L1聯(lián)合使用可顯著抑制具有良好生物安全性的小鼠體內腫瘤的生長。

參考文獻：

Deng D, Wang M, Su Y, Fang H, Chen Y, Su Z. Iridium(III)-Based PD-L1 Agonist Regulates p62 and ATF3 for Enhanced Cancer Immunotherapy.?J Med Chem. 2024 Apr 25;67(8):6810-6821. doi: 10.1021/acs.jmedchem.4c00404. Epub 2024 Apr 13