研究背景

大豆（Glycine max）是從6000到9000年前的東亞野生親緣大豆中馴化而來(lái)，導(dǎo)致了巨大的形態(tài)和生理變化，統(tǒng)稱為“馴養(yǎng)綜合癥”。一些與馴化有關(guān)的性狀（DRT）受一主要QTL控制，并且不同DRT所基于的某些QTL區(qū)域重疊。

許多豆科植物的種皮上都有一層含有致敏性過(guò)敏原的泥膜，使得種子不易被看見(jiàn)，為潛在的掠食者提供了雙重保護(hù)，保護(hù)后代。然而，無(wú)泥膜的光澤的種子對(duì)于人類消費(fèi)和健康是有利的，并且是馴化選擇的目標(biāo)。較早的研究提出，三個(gè)互補(bǔ)基因B1，B2和B3控制花開(kāi)發(fā)育，但多項(xiàng)研究?jī)H檢測(cè)到13號(hào)染色體上的B1基因座。

技術(shù)路線

結(jié)果展示

圖1.?G. max、?G. soja及其子代的種皮光澤

為了確定從開(kāi)花到無(wú)花表型馴化過(guò)渡的基礎(chǔ)關(guān)鍵基因，將無(wú)花大豆品種Williams 82引入兩個(gè)高度不同的開(kāi)花G. soja品種PI468916和PI 479752，并獲得了由大約3500個(gè)RIL組成的兩個(gè)F_6：7重組自交系（RIL）群體。以Williams 82作為母本的雜交種子（F₁種子）沒(méi)有種皮開(kāi)花，而衍生自F₁植物的F_1：2種子則具有種皮開(kāi)花。而來(lái)自以Williams 82作為父本的雜交的F₁和F_1：2種子均攜帶種皮開(kāi)花（圖1b）。兩個(gè)RIL群體的兩個(gè)子集的表型分析顯示開(kāi)花與無(wú)花表型的比例為1：1。根據(jù)種皮開(kāi)花與母果莢果內(nèi)果皮觀察表明，兩種種皮開(kāi)花主要由單個(gè)基因控制，并且在表皮上，開(kāi)花表型為顯性或部分顯性。值得注意的是，開(kāi)花RIL之間的種皮開(kāi)花數(shù)量不同，這可能反映了少量QTL調(diào)節(jié)種皮開(kāi)花積累的影響。

圖2.?B1基因克隆

隨后對(duì)RIL的兩個(gè)子集進(jìn)行處理，以通過(guò)測(cè)序（GBS）進(jìn)行基因分型?；蛐秃捅硇蛿?shù)據(jù)的組合在PI 468916和PI 479752中在13號(hào)染色體上種皮開(kāi)花的基礎(chǔ)上定義了一個(gè)區(qū)域（圖2a），該區(qū)域與先前映射的B1區(qū)域重疊，表明這兩個(gè)種質(zhì)由B1基因座控制。在映射區(qū)域內(nèi)的其他標(biāo)記用于鑒定兩個(gè)RIL群體中與B1基因座之間的重組體，最后根據(jù)大豆參考基因組序列將B1基因座精細(xì)映射到一個(gè)包含兩個(gè)基因（Glyma.13G241700、Glyma.13G241800）的14.5 kb區(qū)域（圖2b）。對(duì)三個(gè)親本系的兩個(gè)基因進(jìn)行測(cè)序，Williams 82和兩個(gè)大豆親本之間的差異只有一個(gè)SNP位點(diǎn)，即Glyma13G241700的編碼序列（CDS）中的一個(gè)（C到T）點(diǎn)突變，導(dǎo)致氨基酸從半胱氨酸變?yōu)榫彼幔▓D2c）?；ê?周，Glyma.13G241700在發(fā)育中的豆莢中最高表達(dá)，其在PI 468916和（Williams 82×PI 468916）F1中的表達(dá)水平相似，但均明顯高于Williams 82（圖2d）。相比之下，兩個(gè)親本中的Glyma.13G241800和F1的表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異（圖2e）。這些觀察結(jié)果表明，雙親中的Glyma.13G241700最有可能成為B1的候選基因，預(yù)計(jì)B1編碼跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白樣蛋白（圖2f）。

然后將來(lái)自PI 4768916的Glyma.13G241700的CDS與花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子融合，并將融合構(gòu)建體（p35S：CDS-B1）引入Williams82。兩個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件各自獲得約20個(gè)T1轉(zhuǎn)基因種子。如圖2g所示，在所有轉(zhuǎn)基因種子的表面均觀察到種皮開(kāi)花，但在非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩袇s沒(méi)有，證明Glyma.13G241700是B1基因座。在R5（種子發(fā)育）階段，由35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因B1在發(fā)育中的豆莢，豆莢果皮，種皮和種子中的表達(dá)水平顯著高于Williams 82中的b1（圖2h），并且在四個(gè)組織中的每一個(gè)中，轉(zhuǎn)基因B1的表達(dá)水平與T_1：2種子的表皮表面積累的泥膜量呈正相關(guān)。

檢查先前重新測(cè)序的62個(gè)G. soja種質(zhì)和240個(gè)G. max種質(zhì)是否存在種皮開(kāi)花和B1位點(diǎn)的序列變異。發(fā)現(xiàn)2大豆和Williams 82之間B1的CDS內(nèi)（C到T）多態(tài)性與302個(gè)種之間種皮開(kāi)花的表型差異完全相關(guān)（圖2i），提示（C到T）點(diǎn)突變是表型轉(zhuǎn)變的原因。預(yù)計(jì)該點(diǎn)突變會(huì)導(dǎo)致該基因編碼的蛋白質(zhì)的螺旋結(jié)構(gòu)丟失，而兩個(gè)大豆親本之間的另一個(gè)SNP（A到G）并未導(dǎo)致該蛋白質(zhì)的任何明顯結(jié)構(gòu)變化（圖2j）。

隨后，將來(lái)自PI 468916的B1的CDS和來(lái)自Williams 82的b1分別與B1啟動(dòng)子區(qū)域融合，并將融合的pB1：CDS-B1和pB1：CDS-b1構(gòu)建體引入擬南芥以獲得T2轉(zhuǎn)基因品系。由于擬南芥的種子較小且種子表面粗糙，因此無(wú)法清楚地區(qū)分轉(zhuǎn)基因種子與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩g的種子表面紋理。然而，pB1：CDS-B1轉(zhuǎn)基因種子的表面比pB1：CDS-b1轉(zhuǎn)基因種子和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏谋砻娓n白和暗沉（圖2k）。與G. soja和G. max中的B1 / b1等位基因相似（圖2d），pB1：CDS-B1在擬南芥背景中的表達(dá)水平明顯高于pB1：CDS-b1（圖2l）。 B1 / b1之間的C到T多態(tài)性與基因的表達(dá)水平有關(guān)。

圖3.?B1基因座對(duì)種子油含量的多效性影響

先前通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）使用302個(gè)重測(cè)序種質(zhì)的子集，確定了潛在的主要QTL種子油含量，包括46 個(gè)G. soja種質(zhì)和127個(gè) G. max種質(zhì)的種子油含量信息（www.ars-grin.gov/npgs）和一個(gè)246 kb 的QTL區(qū)域在35,194,140 bp處達(dá)到峰值，位于B1基因座的下游約31 kb處（圖3a）與籽油含量的變化顯著相關(guān)。由于G. soja和G. max的種子油含量差異很大，前者的平均值約為10.9％，后者的平均值約為18.0％，因此認(rèn)為該油脂QTL為可能是造成栽培大豆種子油含量升高的原因。

由于B1位點(diǎn)和油脂QTL均被定義為一個(gè)約410 kb的“馴化”區(qū)域（由大豆馴化形成）（圖3a），想知道這兩個(gè)基因座（如果不同）是否通過(guò)連鎖同時(shí)選擇，或單個(gè)基因座是否對(duì)這兩個(gè)性狀具有多效作用，從美國(guó)農(nóng)業(yè)部大豆種質(zhì)資源庫(kù)（www.ars.grin.gov/npgs）中選擇全部70個(gè)開(kāi)花的G.max品種和從先前選擇用于調(diào)查GWAS種子油含量的遺傳多樣性的這個(gè)收集物中的52個(gè)“無(wú)花”的G.max品種。利用來(lái)自這122個(gè)種質(zhì)的全基因組SNP數(shù)據(jù)，檢測(cè)到與B1選擇性清除區(qū)域中種皮開(kāi)花相關(guān)的種子油QTL（圖3b），表明B1基因座可能對(duì)種子油含量具有多效性作用。據(jù)推測(cè)，與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾?，?lái)自兩個(gè)獨(dú)立事件的大豆p35S：CDSB1轉(zhuǎn)基因種子均顯示出種子油含量顯著降低（4.5％和6.9％）。種子油含量降低的水平似乎與轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平相關(guān)（圖2h）。與pB1：CDS-b1轉(zhuǎn)基因種子或非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾?，擬南芥pB1：CDS-B1轉(zhuǎn)基因種子中的脂肪酸含量也顯著降低，但在pB1：b1-CDS轉(zhuǎn)基因種子和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩g未檢測(cè)到種子油含量的顯著差異（圖3d），表明（C到T）多態(tài)性是表型差異的原因。

圖4.?調(diào)控大豆脂肪酸生物合成的四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)水平和相互作用

為了闡明B1介導(dǎo)降低種子油含量的機(jī)制，分析了Williams 82發(fā)育豆莢、豆莢內(nèi)果皮、種皮和種子中四種轉(zhuǎn)錄因子GmWRI1a，GmLEC1a，GmLEC1b和GmABI3b的表達(dá)水平。B1和PI 468916的T1轉(zhuǎn)基因植物在R5階段過(guò)表達(dá)。這些轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)了大豆種子中脂肪酸的生物合成，其表達(dá)水平與種子油含量呈正相關(guān)。在B1的過(guò)表達(dá)下發(fā)育中的豆莢和豆莢果皮中四種轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平均顯著降低而在發(fā)育中的種皮和種子中未觀察（圖4a）。Williams 82和PI 468916之間的B1 / b1表達(dá)模式與之呼應(yīng)（圖4b）。表明B1基因不影響大豆種子中脂肪酸的合成，是通過(guò)下調(diào)脂肪酸生物合成影響莢果（圖4c）。

總結(jié)

B1基因座對(duì)種皮開(kāi)花和種子油含量均具有多效性，為進(jìn)一步分離B1介導(dǎo)的兩個(gè)重要種子性狀的基因網(wǎng)絡(luò)奠定了基礎(chǔ)。盡管已經(jīng)在種群水平上對(duì)許多植物物種進(jìn)行了測(cè)序和重測(cè)序，但有限數(shù)量的馴化相關(guān)基因，其中表型轉(zhuǎn)變的致病性突變已闡明。部分原因可能是由于基因-環(huán)境相互作用和各種基因-等位基因相互作用（包括多效性）決定了馴養(yǎng)綜合征的復(fù)雜性。最近的一項(xiàng)研究表明，在非洲水稻馴化過(guò)程中人為選擇SHATTERING 4的無(wú)意義突變會(huì)導(dǎo)致不破粒但顆粒尺寸較小。多效性并不總是對(duì)古代和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)有利。

英文題目：Genomic introgression through interspecific hybridization counteracts genetic bottleneck during soybean domestication
中文題目：通過(guò)種間雜交實(shí)現(xiàn)基因組滲入抵消了大豆馴化過(guò)程中的遺傳瓶頸
發(fā)表期刊：Genome Biology
影響因子：14.028
發(fā)表時(shí)間：2019年1月30日

研究背景

已有文獻(xiàn)證明通過(guò)自發(fā)雜交和回交，農(nóng)作物及其野生近緣種之間有滲入，是遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移的證據(jù)。而對(duì)滲入的進(jìn)化模式、后果及其對(duì)作物馴化、品種多樣化過(guò)程的影響知之甚少。種間雜交都有什么實(shí)例？本篇文章為您解析。

大豆(Glycine max?[L.] Merr.)是世界上最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，為飼料、食品及工業(yè)用途的植物油、燃料提供了高質(zhì)量蛋白質(zhì)來(lái)源。栽培大豆起源于中國(guó)，在距今約6000至9000年前由野生大豆(Glycine soja)馴化而來(lái)，之后進(jìn)行了品種多樣化，形成許多適合于不同生態(tài)區(qū)域在農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中種植的大豆地方品種。盡管單一來(lái)源模型已被普遍接受，但大豆的馴化歷史和過(guò)程仍不清楚。一項(xiàng)早期研究提出，從野生大豆到馴化大豆的過(guò)渡是一個(gè)漸進(jìn)過(guò)程。在中國(guó)的大豆種植區(qū)仍存在形態(tài)介于野生大豆與馴化大豆間的半野生型大豆(Glycine gracilis)。由此推測(cè)從野生大豆到栽培大豆可能存在基因流。

雜交產(chǎn)生的基因組片段滲入是基因流的主要途徑，在玉米和水稻種均報(bào)道存在基因滲入情況，但少有研究調(diào)查作物馴化期間基因組滲入的過(guò)程、模式和進(jìn)化結(jié)果。

技術(shù)路線

研究結(jié)果

全基因組鑒定的野生大豆-栽培大豆基因滲入

通過(guò)302份已公布的大豆種質(zhì)進(jìn)行同源遺傳關(guān)系分析 (Identical By Descent，IBD), 發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)大豆均存在種間基因滲入片段。各個(gè)基因組（包括62個(gè)野生種和129個(gè)地方種）中檢測(cè)到的滲入片段的比例在0.00037至0.60之間，平均為0.032（圖1）。

圖2顯示了檢測(cè)到的基因滲入在各個(gè)基因組中具有> 5％滲入片段的種質(zhì)的染色體分布。在野生大豆基因組中，檢測(cè)到栽培大豆片段的比例為0.00059至0.41，平均為0.019。在栽培大豆基因組中，檢測(cè)到野生大豆片段比例為0.00037至0.60，平均為0.031。野生大豆和栽培大豆亞群中，基因滲入片段的43.94％和54.61％由兩個(gè)或更多的種質(zhì)共享，其余的是種質(zhì)特異性的。滲入片段均未完全固定在野生大豆或栽培大豆中（圖2）。

具有推定基因滲入?yún)^(qū)域的D統(tǒng)計(jì)量顯著低于沒(méi)有推定基因滲入?yún)^(qū)域，并且也顯著低于全基因組平均水平，這表明野生大豆和栽培大豆間的基因流與這些基因區(qū)域有關(guān)（圖3）。

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圖1?野生大豆和栽培大豆的進(jìn)化樹(shù)

圖2?種間基因滲入在全基因組的分布

環(huán)形從外至內(nèi)依次表示(i)染色體臂(灰色)，近著絲粒區(qū)(綠色) (ii)群體水平的基因滲入比例在各條染色體的分布(iii)馴化相關(guān)QTL位點(diǎn)在各條染色體的分布(紅色) (iv)選擇掃蕩區(qū)域在各條染色體的分布(紅色) (v)具有代表性的12份栽培大豆及10份野生大豆材料基因滲入?yún)^(qū)間的在各條染色體的分布：栽培大豆片段(藍(lán)色)，野生大豆片段(橙色)

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圖3?D-statistic 分析方法展示野生和栽培大豆間基因組不同區(qū)域中不同模式的基因流

為了檢測(cè)到基因滲入的起源，比較了野生品種（PI 578357，s61）和地方品種（PI 339734，m30）中的代表性大滲入片段，據(jù)估計(jì)分別有33％、31％的基因滲入片段具有其他種質(zhì)的相應(yīng)區(qū)域。圖4b說(shuō)明了在野生種PI 578357（s61）中，與栽培種進(jìn)化相鄰的野生種之一的全基因組推定性基因滲入。PI 578357中2號(hào)染色體的檢測(cè)區(qū)域與地方品種黑河小黃豆（m104）中的相應(yīng)區(qū)域具有最高的序列相似性（圖4a，b，d，f ），而PI 578357的非滲入?yún)^(qū)與野生品種PI 522226（s5）的對(duì)應(yīng)區(qū)域具有最高的相似性（圖4b，c，e，f）。地方品種PI 339734中19號(hào)染色體的滲入?yún)^(qū)域與野生大豆PI 407275（s42）中的相應(yīng)區(qū)域具有最高的序列相似性（圖4h，i， k，l），PI 339734非滲入?yún)^(qū)與地方品種PI 548456（m111）對(duì)應(yīng)區(qū)域具有最高的相似性（圖4g，h，j，l）。

根據(jù)基因序列分析，PI 578357和黑河小黃豆之間及PI 339734和PI 407275之間的分歧時(shí)間分別可追溯到約0.37和27萬(wàn)年前（mya）。由于大豆的馴化發(fā)生在大約6000-9000年前，兩對(duì)（野生大豆-栽培大豆）品種之間所檢查的滲入?yún)^(qū)域的如此高的相似性應(yīng)被視為野生大豆-栽培大豆?jié)B入的直接證據(jù)。

圖4?基于同源遺傳關(guān)系分析推測(cè)的滲入片段起源的范例

(a-c)黑河小黃豆, PI 578357和PI 52226三個(gè)材料中基因組成分在2號(hào)染色體的分布(d)基于2號(hào)染色體基因滲入?yún)^(qū)域SNP構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)揭示的PI 578357中PI 52226成分的起源(e)基于2號(hào)染色體非基因滲入?yún)^(qū)域SNP構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)揭示的PI 578357中黑河小黃豆成分的起源(f)上述三個(gè)材料的地理分布(g-i) PI 548456, PI 339734和PI 407275三個(gè)材料中基因組成分在19號(hào)染色體的分布(j)基于19號(hào)染色體基因滲入?yún)^(qū)域SNP構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)揭示的PI 339734中PI 548546成分的起源(k)基于19號(hào)染色體非基因滲入?yún)^(qū)域SNP構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)揭示的PI 339734中PI 407275成分的起源(l)上述三個(gè)材料的地理分布

野生大豆-栽培大豆基因滲入的影響因素

圖5?自然選擇與人工選擇下基因滲入的模式

(a)野生大豆中選擇掃蕩區(qū)段中野生大豆成分的比例(b)野生大豆中馴化相關(guān)QTL區(qū)段中野生大豆成分的比例(c)栽培大豆中選擇掃蕩區(qū)段中栽培大豆成分的比例(d)栽培大豆中馴化相關(guān)QTL區(qū)段中栽培大豆成分的比例

相較于在野生大豆種質(zhì)中檢測(cè)到的基因組其他區(qū)域，與選擇性掃描區(qū)域相應(yīng)區(qū)域中的栽培大豆片段比例顯著降低（圖5a）。相比之下，與栽培大豆基因組相比，選擇性掃除區(qū)中野生大豆片段在基因組其他區(qū)域的檢出率顯著降低（圖5c）。在栽培大豆或野生大豆相應(yīng)馴化QTL區(qū)域中，滲入片段比例比選擇性掃描區(qū)域中檢測(cè)到的小（圖5b，d）。這些結(jié)果表明雙向選擇，即自然選擇與人工選擇，對(duì)野生大豆和栽培大豆中滲入片段的保留具有不同的結(jié)果、影響。

關(guān)鍵馴化基因周圍的基因流

圖6?基于兩個(gè)馴化相關(guān)基因所在的選擇掃蕩區(qū)段SNP信息構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)

基因滲入被認(rèn)為是基因流的主要途徑，那么基因流如何在種群水平上影響馴化過(guò)程和大豆基因組的遺傳結(jié)構(gòu)？現(xiàn)有研究已分離出分別控制種子硬度和種皮開(kāi)花的關(guān)鍵大豆馴化基因GmHs1-1和Bloom1（B1），圍繞GmHS1-1、Gmhs1-1和B1、b1基因座的兩個(gè)選擇性掃除區(qū)域中的SNP分析系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系發(fā)現(xiàn)基因滲入現(xiàn)象在這兩個(gè)區(qū)域均有存在?？紤]到野生大豆和栽培大豆亞種的系統(tǒng)發(fā)育差異，在研究種群中兩個(gè)馴化基因位點(diǎn)檢測(cè)到的選擇性掃描區(qū)域和單倍型的混合將被視為亞種群間基因流動(dòng)的進(jìn)一步證據(jù)。

核基因組和細(xì)胞器基因組之間的不對(duì)稱多樣化揭示了基因滲入

圖7?栽培大豆和野生大豆核基因組和葉綠體基因組的非對(duì)稱分歧

191個(gè)材料的核基因組進(jìn)化樹(shù)基于全基因組的SNP信息，葉綠體進(jìn)化樹(shù)基于333個(gè)高度可信SNP位點(diǎn)。栽培大豆用藍(lán)色分枝藍(lán)色背景表示，野生大豆用紅色分枝紅色背景表示。兩個(gè)進(jìn)化樹(shù)中的相同材料用直線連接。藍(lán)線表示栽培大豆中含有野生大豆葉綠體成分，橙線表示野生大豆中含有栽培大豆葉綠體成分?；揖€表示分別具有野生大豆和栽培大豆葉綠體的種質(zhì)。

栽培大豆比野生大豆的葉綠體進(jìn)化分化程度更小，但有些栽培大豆中含有野生大豆的葉綠體基因組，有些野生大豆中含有栽培大豆的葉綠體基因組（圖7）。說(shuō)明野生大豆與栽培大豆之間存在雜交事件，這種雜交事件很可能是豐富的遺傳多樣性的原因。核基因組與葉綠體基因組總體上呈現(xiàn)出共進(jìn)化趨勢(shì)，但部分細(xì)胞核與葉綠體基因組間發(fā)生了非平行進(jìn)化，或許是由于種內(nèi)天然雜交。

選擇抗?jié)B入的后果

圖8?大豆馴化過(guò)程模型

在大豆馴化期間或之后，種間雜交和隨后的回交產(chǎn)生廣泛的基因組滲入。之后通過(guò)從QTL或大豆馴化基礎(chǔ)的選擇清除區(qū)域清除滲入的變異，對(duì)DRT（馴化相關(guān)基因）進(jìn)行重新選擇或輪回選擇（圖8）。在這些區(qū)域中觀察到的野生大豆?jié)B入片段的比例明顯低于地方品種的其余基因組區(qū)域。該模式與野生大豆種質(zhì)中假定的漸滲的栽培大豆片段的分布模式相呼應(yīng)，表明種間漸滲的進(jìn)化命運(yùn)由兩個(gè)不同選擇壓力的相對(duì)強(qiáng)度決定。作物馴化伴隨著遺傳多樣性的大量丟失，是作物形成中的主要遺傳瓶頸。但與野生大豆相比，栽培大豆中依然存在著較高的遺傳多樣性。據(jù)此估算，栽培大豆個(gè)體間的平均分化時(shí)間可追溯到30萬(wàn)年前，而這樣高的多樣性通常是無(wú)法通過(guò)對(duì)某個(gè)地域中少數(shù)野生材料的人工選擇而獲得的。

結(jié)論

本研究揭示了農(nóng)作物及其野生近緣種之間假定的基因組基因滲入的進(jìn)化力、模式和后果，以及滲入對(duì)作物馴化和品種多樣化過(guò)程的影響。設(shè)想種間滲入是抵消馴化作物特別是單種馴化作物遺傳多樣性減少的重要機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)材料

大豆“Taiwan 75”培養(yǎng)在正常條件下，第一真葉期的幼苗分為對(duì)照組和處理組。對(duì)照組—25°C（12h），17°C（12h），處理組—4°C（24h）。設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

研究結(jié)果

1.sRNA測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
首先，對(duì)大豆4°C處理組（3h、6h、9h、12h、24h和36h）及對(duì)照組進(jìn)行相對(duì)生長(zhǎng)速率（RGR）和MDA含量的檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)在24h時(shí)，對(duì)照組和處理組RGR和MDA含量明顯不同。因此，選擇冷脅迫24h進(jìn)行sRNA測(cè)序。

對(duì)照組和處理組分別獲得6559098和8273245 clean reads。長(zhǎng)度為21nt所占比例*高（圖1A）。非冗余的reads，長(zhǎng)度分布統(tǒng)計(jì)可以看出24nt所占比例*高，在對(duì)照組和處理組中分別為68.4%和59%（圖1B）。

圖1.sRNA長(zhǎng)度分布圖

2.鑒定大豆中已知的miRNA
共鑒定到已知的434個(gè)miRNA，屬于133個(gè)家族。這些miRNA包括保守miRNA和種間特異性miRNA。保守miRNA在植物發(fā)育過(guò)程和響應(yīng)脅迫上起到重要作用。通過(guò)同源比對(duì)鑒定大豆中保守的miRNA家族。例如miR156，miR160，miR164等在很多植物物種中都是高度保守的。此外，找到一些非保守miRNA，例如miR3522,表明他們可能參與大豆的物種進(jìn)化。

3.預(yù)測(cè)大豆中新的miRNA
根據(jù)miRNAs前體的發(fā)夾結(jié)構(gòu)來(lái)預(yù)測(cè)miRNAs，找到3個(gè)預(yù)測(cè)的miRNA并鑒定折疊成的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

4.驗(yàn)證大豆中預(yù)測(cè)的miRNA
為了驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果，利用qRT-PCR分析miRNA表達(dá)情況。選擇了35個(gè)miRNA（33個(gè)已知miRNA，2個(gè)預(yù)測(cè)miRNA）進(jìn)行qRT-PCR分析。線性回歸分析測(cè)序結(jié)果和qRT-PCR結(jié)果相關(guān)性系數(shù)為0.8048，表明miRNA-Seq和qRT-PCR結(jié)果相一致。盡管miRNA-Seq和qRT-PCR結(jié)果在√確的倍數(shù)方面有些差異，這可能是由于2種實(shí)驗(yàn)結(jié)果敏感性和特異性的不同導(dǎo)致的，但是miRNA表達(dá)趨勢(shì)是一致的。

圖2.qRT-PCR結(jié)果

5.miRNA靶基因鑒定
利用降解組測(cè)序鑒定miRNA降解的靶基因。共獲得12283683條raw reads，2623291條非冗余raw reads。共鑒定到898個(gè)轉(zhuǎn)錄本是54個(gè)miRNA家族的靶基因。本研究發(fā)現(xiàn)miRNAs可以降解2個(gè)甚至更多的靶基因，與之前的研究相似。例如，gma-miRNAs可以沉默屬于SBP家族的15個(gè)基因，脫落酸響應(yīng)結(jié)合因素蛋白家族和2個(gè)基因，2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子等。而且，有7個(gè)轉(zhuǎn)錄本受到多個(gè)miRNAs的調(diào)控。

6.鑒定大豆冷脅迫下相關(guān)的miRNA
對(duì)miRNA進(jìn)行差異表達(dá)分析，共鑒定到32個(gè)miRNA家族的51個(gè)miRNA差異表達(dá)。在冷脅迫下有30個(gè)下調(diào)表達(dá)，21個(gè)上調(diào)表達(dá)。

對(duì)相應(yīng)靶基因進(jìn)行功能注釋來(lái)研究差異表達(dá)的miRNA可能行使的功能。差異表達(dá)的miRNA可以分為四類。第一類包括miRNA家族（miR156、miR164、miR169、miR4412和miR5327），靶基因?yàn)檗D(zhuǎn)錄因子SBP、NAC、NFY、GRAS和bHLH，參與調(diào)控基因表達(dá)和信號(hào)傳導(dǎo)。第二類包括miR4411，其對(duì)應(yīng)靶基因涉及抵御疾病。第三類包括miR5761、miR159、miR5667、miR1535、miR511、miR4382和miR4416，其對(duì)應(yīng)靶基因參與植物生長(zhǎng)發(fā)育中的適應(yīng)性。為了進(jìn)一步確認(rèn)冷脅迫下miRNA和靶基因的關(guān)系，選擇了5個(gè)miRNAs及其靶基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。結(jié)果表明，在冷脅迫下miRNA-164a，miRNA-4411和miRNA-169e上調(diào)。相反的，他們的靶基因NAC、DRP和NFY顯著下調(diào)。說(shuō)明miRNA和對(duì)應(yīng)靶基因呈負(fù)相關(guān)性。

圖3.miRNA和對(duì)應(yīng)靶基因qRT-PCR圖

為了近一步確認(rèn)這些差異表達(dá)miRNA的功能，對(duì)靶基因進(jìn)行GO分析。靶基因共參與了56個(gè)分子功能terms，37個(gè)生物學(xué)過(guò)程terms和7個(gè)細(xì)胞組分terms。在分子功能分類下，ATP結(jié)合、蛋白結(jié)合、組蛋白結(jié)合等terms是顯著富集的。超過(guò)35%miRNAs的靶基因參與了生物學(xué)過(guò)程途徑。

圖4.GO注釋

結(jié) 論
首次研究大豆冷脅迫下miRNA調(diào)控基因表達(dá)情況。利用降解組測(cè)序鑒定到了上百個(gè)靶基因，揭示miRNAs和靶基因之前的相互關(guān)系。盡管miRNAs調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜，目前還不是十分清楚，本次研究完善了miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)，為研究大豆和其他物種的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了重要基礎(chǔ)。也發(fā)現(xiàn)了51個(gè)響應(yīng)冷脅迫的miRNAs。

文章亮點(diǎn)
1.處理時(shí)間點(diǎn)的選擇上進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn)，設(shè)置多個(gè)時(shí)間梯度進(jìn)行處理并進(jìn)行生理指標(biāo)測(cè)定，最終選擇變化較為明顯的時(shí)期。選樣時(shí)間點(diǎn)有理有據(jù)。
2.利用降解組測(cè)序z確鑒定miRNA降解的mRNA。

參考文獻(xiàn)
[1] Xu S, Liu N, Mao W, et al. Identification of chilling-responsive microRNAs and their targets in vegetable soybean (Glycine max L.)[J]. Scientific Reports, 2016, 6.