圖1 開心果基因組進化

2.?開心果應激適應相關的擴張基因家族

為了揭示開心果表型（如耐鹽性）的遺傳基礎，利用OrthoMCL通過識別不同植物之間獨特和共同的基因家族來研究基因家族的進化。開心果與擬南芥、柑橘、雷蒙德氏棉、葡萄相比有9735個共有基因家族，而含有1381個基因的707個開心果有特基因家族。對這些基因進行GO與KEGG富集分析，并都發(fā)現(xiàn)了許多與“防御反應”有關的基因，其中包括許多包含NB-ARC domain和NBS-LRR domain的基因。這種基因以植物抗病性著稱，對開心果的防御反應具有相當重要的意義。

接下來，作者研究了開心果基因家族的擴張和收縮（圖1c）。由于很難從基因家族規(guī)模的收縮或與未在該參考基因組中成功組裝的基因有關，這里只分析了擴展的基因家族。對擴展基因家族的基因富集分析發(fā)現(xiàn)，它們在代謝類別中豐富，如萜類、黃酮類、倍半萜類和生物堿的生物合成?；蚣易宓臄U展發(fā)生在長期進化之后，并推動了黃連木屬和柑橘屬之間的進化差異，而不是開心果從野外馴化的非常短期的進化。因此，我們認為上述基因的擴展可能與野生黃連木中有機化合物的代謝有關。野生黃連木的植物化學篩選發(fā)現(xiàn)了許多植物化學物質(zhì)，如生物堿、黃酮、香豆素、甾醇、單寧、萜類和倍半萜類。

此外，豐富的術語“氧化還原過程”包含許多細胞色素P450基因，這些基因編碼參與多種功能復雜代謝途徑的蛋白質(zhì)，并在多個過程中發(fā)揮重要作用，特別是在應激反應中發(fā)揮作用。在187個細胞色素P450基因中，我們發(fā)現(xiàn)許多可能具有耐鹽功能。例如，透水性研究發(fā)現(xiàn)，CYP94家族基因表達水平的升高可減輕水稻的茉莉酸反應，增強水稻的耐鹽性。在開心果的這些擴張基因家族中，有14個CYP94基因。大豆中，CYP82A3參與茉莉酸和乙烯信號通路，增強對鹽堿和干旱的抗性，開心果擴張基因家族中有20個CYP82基因成員。毛果楊CYP714A3的異位表達增強了水稻的耐鹽性，開心果擴張基因家族中有10個CYP714A基因。因此，一些細胞色素P450基因可能與開心果的耐鹽性有關。

3.?RNA-seq揭示了開心果鹽適應的遺傳機制

進一步研究開心果的耐鹽性潛在遺傳機制，研究者進行了鹽度實驗。開心果砧木（P.vera?L.cv.Ohadi）的葉和根在正常條件和鹽度條件下進行RNA測序。使用Tophat-Cufflinks-Cuffdiff?pipeline，在鹽水條件下處理的植物與對照之間表現(xiàn)出差異表達，鑒定214和461蛋白質(zhì)編碼基因分別在葉和根組織中（ncontrol = 3, nsalinity = 3, corrected P < 0.05,）?；蚋患治霭l(fā)現(xiàn)許多差異表達基因（31個基因）參與到“氧化還原進程”中（圖2a，b）。像比較基因組分析一樣，該類別中的15個基因是細胞色素P450基因，特別是CYP74A（即AOS），其編碼細胞色素P450 CYP74基因家族的一個成員，其起到丙二烯氧化物合酶（AOS）的作用。這種酶催化茉莉酸酯合成中的第一步[即茉莉酸（JA）]。AOS中每千堿基外顯子的表達片段（FPKM）值在葉片中從對照中的近0增加到鹽水條件下的2163.75，在根中從對照中的1.87增加到鹽水處理的87.74。研究者還發(fā)現(xiàn)了7個差異表達的基因(ChiC, TT4, ILL6, MYB108, MYB6, PRB1, and TIFY5A)被富集到“茉莉酸反應”中。以前的研究表明，干旱和高鹽度導致水稻葉片和根部JA含量增加。鹽度處理可以增加濕地物種鳶尾（Iris hexagona）中的內(nèi)源JA水平。茉莉酸酯激活植物對生物脅迫（即病原體攻擊）和非生物脅迫（即鹽）的反應。在此，用鹽水處理增加了在葉和根中參與茉莉酸反應的這些基因的表達水平（圖2c）。這些基因的表達增加（例如，AOS作為酶催化茉莉酸酯合成中的第一步）應該增加茉莉酮酸酯的合成，因此，它們很可能被開心果用于應對鹽脅迫。

差異表達的基因富集到“幾丁質(zhì)結合”，其中四種基因編碼幾丁質(zhì)酶(CHIB, EP3, ChiC, AT2G43590)。植物幾丁質(zhì)酶涉及多種生物系統(tǒng)。植物中的一些幾丁質(zhì)酶是針對環(huán)境脅迫（如高鹽濃度，寒冷和干旱）而表達的，并且可以通過植物激素如乙烯，茉莉酸和水楊酸來上調(diào)。例如，基因ChiC編碼V類幾丁質(zhì)酶，其表達可由茉莉酸和擬南芥鹽度引起的脅迫來誘導。研究者的轉(zhuǎn)錄組學分析表明，編碼幾丁質(zhì)酶的基因和參與JA生物合成途徑的基因可能有助于開心果適應鹽水環(huán)境。

?圖2 鹽處理下開心果的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

4.?不同野生種間混和

為了研究開心果的種群歷史和適應性進化，研究者對107個開心果基因組進行重測序，包括93個品種和14個野生開心果，平均測序深度為6-8X。作者還重新測序了來自不同近緣種的35個基因組，包括P.mutica，P.khinjuk，P.integerrima和P. palaestina。用stringent GATK pipeline，發(fā)現(xiàn)14.77百萬個單基因變異位點，其中2.42百萬個在基因區(qū)。使用鄰近法和最大似然法的系統(tǒng)發(fā)育分析清楚地分離了5種不同的種群，即?P.vera, P.mutica, P. khinjuk, P. integerrima, and P. palaestina。通過TreeMix程序在一些物種之間檢測到漸滲的信號，這表明雜交可能在自然界中的不同近親之間發(fā)生，并且與植物中被發(fā)現(xiàn)的普遍雜交一致。然而，從其他開心果物種到馴化的開心果沒有檢測到漸滲，這種現(xiàn)象來源于野生的P. vera（圖3）。

?圖3 不同野生種間的基因漸滲

5.?開心果兩步馴化歷程

基于重測序數(shù)據(jù)，研究人員推測了這些物種的有效群體大小的變化，并發(fā)現(xiàn)在 Pleistocene期間發(fā)生了瓶頸事件，且在 ~200 kyr前，有效群體大小增加。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示馴化和野生開心果之間的分離（圖4a）。利用δaδi推算野生和馴化開心果的分化時間在 ~8000年前，這與早在公元前6750年就表明開心果種子是一種常見的食物這一考古記錄相似。為了深入了解開心果種質(zhì)之間的遺傳關系，研究人員進行了兩項經(jīng)典分析：群體結構和主成分分析（圖4b，c）。這些分析清晰的顯示栽培種質(zhì)分為兩個群。栽培種Group I的LD最高，栽培種Group II和野生開心果的LD衰減值相近。Group II包括 Qazvini，Italiaei和Badami

Zarand在內(nèi)的5種類型的個體，且這些種質(zhì)被記錄為古代具有種子的材料（圖4d）。與系統(tǒng)發(fā)育樹一致，這三個品種含有較高比例的野生血統(tǒng)（圖4e）,這些結果支持了其兩步馴化的過程，初步馴化，然后通過作物育種進行改良。

圖4 野生和馴化開心果的系統(tǒng)發(fā)育關系分析

6.?開心果馴化的遺傳機制

群體核苷酸多態(tài)性θπ分析揭示了馴化型種質(zhì)的核苷酸多態(tài)性低于野生型種質(zhì)，通過分析發(fā)現(xiàn)，栽培種質(zhì)中基因組上的一些區(qū)域的多態(tài)性降低，這些區(qū)域可能含有受到人工選擇的基因。此外，研究人員鑒定了栽培型和野生型樣品分化水平增加的區(qū)域。在馴化和野生的開心果之間，在基因組上約有9.2 Mb的區(qū)域被鑒定為具有高水平的群體分化。栽培種間遺傳多樣性降低，且超過95%的閾值。遺傳多樣性減少的區(qū)域和群體分化增強的區(qū)域在馴化或育種過程中經(jīng)歷了選擇性清除。共計有665個基因定位在該區(qū)域。研究人員定位了受正向選擇的候選基因，其可能與馴化過程中重要的表型進化相關。在開心果馴化的過程中，其樹形大小經(jīng)歷了人工選擇（圖5a）。研究人員發(fā)現(xiàn)了基因SAUR55（圖5b），編碼生長素應激蛋白，在植物的生長過程中發(fā)揮重要的作用，其在開心果的人工選擇下進化而來。除此之外，基于也和根的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結果顯示，馴化種與野生種相比，基因SAUR55表現(xiàn)出了顯著增加的表達水平（圖5c）。這些結果與在其它作物（如水稻和小麥）中生長素應激性基因的選擇性清除的研究結果一致，并揭示了在作物馴化期間類似特征性狀的人工選擇。果實重量是作物馴化和育種期間最重要的特征之一，包括開心果。在栽培種中，品種成分與果實重量呈正相關（圖4e）。這支持了一個結論，在開心果中，果實重量的人工選擇發(fā)生在馴化與人工選擇期間。研究人員指出，基因CYCD7-1在人工選擇的進化下，野生種和馴化的栽培種之間具有高度的群體分化特征。該基因編碼D型細胞周期蛋白，控制細胞分裂及種子發(fā)育過程中的生長率。CYCD7-1基因的過表達包括在胚胎和胚乳中的細胞增殖和細胞增大，其在擬南芥中導致種子過度生長?；?em>CYCD7-1在花粉和早期發(fā)育中顯示特殊表達，但在葉和根中沒有表達。因此，有希望在未來的實驗中比較野生型和馴化型開心果在花粉和早起發(fā)育時期CYCD7-1基因的表達，研究人員提出在CYCD7-1基因上進行的人工選擇可能會改變開心果的重量。

?圖5 開心果果樹大小的人工選擇

結論

本研究為開心果的局部適應和馴化提供了遺傳學基礎。黃連木屬物種基因組序列有助于未來的研究，以了解沙漠作物農(nóng)藝和環(huán)境相關性狀的遺傳基礎。

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