研究背景

細(xì)胞自噬是一種非常保守的細(xì)胞內(nèi)降解系統(tǒng)，近期的研究表明小鼠中細(xì)胞自噬現(xiàn)象表現(xiàn)出了生物鐘節(jié)律，nr1d1基因缺陷能導(dǎo)致小鼠骨骼肌中自噬活動(dòng)的紊亂。然而生物鐘調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的機(jī)理還不清楚。斑馬魚的細(xì)胞自噬活動(dòng)是否表現(xiàn)出生物鐘節(jié)律還沒有報(bào)道，本研究旨在以斑馬魚為實(shí)驗(yàn)材料研究nr1d1基因在調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的生物鐘節(jié)律方面的作用。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)材料：2種材料：野生型WT和nr1d1突變型斑馬魚
2個(gè)時(shí)間點(diǎn)：CT2和CT14（分別為受精后122和134小時(shí)）;
無生物學(xué)重復(fù)
測序方法：百邁客Illumina HiSeq2000 PE125

結(jié)果展示

1.表型描述及關(guān)鍵基因在幼魚和肝臟中的表達(dá)情況

首先用TEM（透射電鏡）對一天內(nèi)不同時(shí)間（ZT0，ZT6，ZT12，ZT18）的肝臟切片進(jìn)行觀察，統(tǒng)計(jì)一天內(nèi)自噬體數(shù)量的變化（紅色箭頭處，圖1，A），并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（圖1，B），研究表明斑馬魚肝臟內(nèi)自噬體的數(shù)量符合生物鐘節(jié)律。

TEM觀測及自噬體數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果

選取了幾個(gè)以前研究過的與自噬體形成、移動(dòng)、延伸、融合、降解有關(guān)的基因進(jìn)行RT-PCR分析，如maplc3b，bnip3，becn1等。材料為受精后72-96小時(shí)的斑馬魚幼體和肝臟材料。由圖可見這些基因都表現(xiàn)出明顯的生物鐘節(jié)律。圖中白色底色表示白天，灰色底色表示黑夜。

圖2 關(guān)鍵基因的RT-PCR檢測

2.用TALEN技術(shù)構(gòu)建nrid1突變斑馬魚，并進(jìn)行表型研究和關(guān)鍵基因表達(dá)分析

用TEM觀察WT和nr1d1突變斑馬魚肝臟中的自噬體數(shù)量，研究表明自噬體數(shù)量在nr1d1中明顯高于WT。

圖3 不同樣品斑馬魚肝臟自噬體觀測及統(tǒng)計(jì)

用RT-PCR研究在WT和nr1d1突變斑馬魚中關(guān)鍵基因的表達(dá)差異，nr1d1突變體中基因表達(dá)模式與WT中明顯不同。

圖4 差異基因的RT-PCR驗(yàn)證

3.用ChIP和熒光素酶研究Nr1d1直接調(diào)控的下游基因

體外熒光素酶實(shí)驗(yàn)表明Nr1d1蛋白能直接結(jié)合ulk1a基因的promoter區(qū)域，體內(nèi)ChIP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明Nr1d1蛋白能夠結(jié)合ulk1a基因的promoter區(qū)域。說明Nr1d1能直接調(diào)控ulk1a基因的表達(dá)。

圖5 熒光素和chip結(jié)果

4. 野生型WT和nr1d1突變型斑馬魚轉(zhuǎn)錄組分析

為了進(jìn)一步說明nr1d1基因的功能，文章選取了野生型WT和nr1d1突變型斑馬魚進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組研究，并且取了2個(gè)時(shí)間點(diǎn)（CT2和CT14）。研究表明在CT2階段兩者有975個(gè)差異表達(dá)基因，在CT14階段有1360個(gè)差異表達(dá)基因。與WT相比，在nr1d1突變體中上調(diào)的基因數(shù)量要大于下調(diào)的基因數(shù)量。

同時(shí)，選取部分關(guān)鍵的差異表達(dá)基因進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致。

圖6 差異基因韋恩圖

圖7 差異基因聚類圖

圖8 關(guān)鍵基因的RT-PCR驗(yàn)證

研究結(jié)論

通過研究WT野生型和nr1d1突變型斑馬魚的基因表達(dá)情況，表明Nr1d1基因在生物鐘調(diào)節(jié)和細(xì)胞自噬過程中起著重要作用。生物鐘相關(guān)基因直接受Nr1d1調(diào)控。此外，通過轉(zhuǎn)錄組分析表明Nr1d1還調(diào)控脅迫、代謝、信號傳導(dǎo)、翻譯后修飾等生理過程。

圖9 Nr1d1在生物鐘和細(xì)胞自噬過程中的作用模式圖

亮點(diǎn)

1.首次利用斑馬魚研究生物鐘和細(xì)胞自噬的關(guān)系；
2.發(fā)現(xiàn)Nr1d1在生物鐘調(diào)節(jié)和細(xì)胞自噬過程中的關(guān)鍵作用；
3.轉(zhuǎn)錄組研究進(jìn)一步證明Nr1d1的作用，并揭示Nr1d1其它生理功能。
4.雖然轉(zhuǎn)錄組的內(nèi)容在這篇文章中比重不大，但卻揭示了除了生物鐘調(diào)節(jié)和細(xì)胞自噬，Nr1d1基因還有很多其它的功能，顯著提升了文章的水平，并為后續(xù)研究打好了基礎(chǔ)。