1.1 適用范圍

本指南介紹百邁客實(shí)驗(yàn)平臺(tái)空間轉(zhuǎn)錄組產(chǎn)品的送樣要求及制備方法，采集送樣前請(qǐng)?jiān)敿?xì)閱讀。

1.2 聲明

我國(guó)法定的傳染病分為三大類：甲類（一類）傳染病包括霍亂和鼠疫；乙類（二類）傳染病包括傳染性非典肺炎、新型冠狀病毒 (2019-nCoV)肺炎、艾滋病、病毒性肝炎、人感染高致病性禽流感、脊髓灰質(zhì)炎、麻疹、流行性出血熱、狂犬病、登革熱、流行性乙型肝炎、細(xì)菌性和阿米巴性痢疾、肺結(jié)核、傷寒和副傷寒、炭疽、流行性腦脊髓膜炎、白喉、百日咳、新生兒破傷風(fēng)、猩紅熱、布魯士病、梅毒、淋病、鉤端螺旋體病、血吸蟲(chóng)、瘧疾。丙類（三類）傳染病包括流行性感冒、流行性腮腺炎、流行性和地方性斑疹、傷寒、風(fēng)疹、麻風(fēng)病、急性出血性結(jié)膜炎、黑熱病、絲蟲(chóng)病、包蟲(chóng)病、還有除了霍亂、細(xì)菌、阿米巴性痢疾、傷寒和副傷寒以外的感染性腹瀉。

涉及上述傳染病的科學(xué)研究需符合國(guó)家的相關(guān)規(guī)定，為嚴(yán)格遵守國(guó)家法律法規(guī)，本著對(duì)社會(huì)及相關(guān)操作人員負(fù)責(zé)的態(tài)度，我司要求客戶方真實(shí)準(zhǔn)確地提供樣品的生物安全性信息，對(duì)樣品是否含有上述感染性病原體進(jìn)行事先說(shuō)明。樣品中含有上述感染性病原體時(shí)，客戶方需要提供符合生物安全等級(jí)要求的實(shí)驗(yàn)室以便開(kāi)展相關(guān)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行時(shí)，客戶方有義務(wù)協(xié)助我方實(shí)驗(yàn)員做好實(shí)驗(yàn)安全防護(hù)?？蛻舴讲坏秒[瞞樣品的生物安全性信息，若出現(xiàn)樣品含有感染性病原體而客戶事先未告知我司的情況，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)我司將停止進(jìn)行相關(guān)項(xiàng)目，已產(chǎn)生的費(fèi)用由客戶方承擔(dān)。如因客戶方提供的生物安全性信息不實(shí)、隱瞞樣品感染性等有關(guān)情況等造成實(shí)驗(yàn)員及相關(guān)人員被感染、疾病傳播等嚴(yán)重后果的，我司將按規(guī)定報(bào)告國(guó)家相關(guān)部門(mén)，并將通過(guò)法律等手段追究相關(guān)責(zé)任。

2、項(xiàng)目流程

目前百邁客空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序服務(wù)模式默認(rèn)為組織寄送模式，如果有特殊情況需要上門(mén)服務(wù)，請(qǐng)與百邁客技術(shù)人員確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備情況。

組織寄送前請(qǐng)至少提前1周進(jìn)行預(yù)約，百邁客接收到樣本并確認(rèn)樣本無(wú)異常后，3-5天內(nèi)安排RNA質(zhì)檢并反饋質(zhì)檢結(jié)果，質(zhì)檢合格后安排切片、組織結(jié)構(gòu)確認(rèn)與透化。

圖 1 百邁客新鮮冷凍樣本空間轉(zhuǎn)錄組服務(wù)流程

3、新鮮冷凍樣本

3.1 樣本要求

10x空間轉(zhuǎn)錄組每塊組織樣本長(zhǎng)寬不宜超過(guò)6.5*6.5mm，百創(chuàng)S3000空間轉(zhuǎn)錄組每塊組織樣本長(zhǎng)寬不宜超過(guò)6.8*6.8mm，厚度＞1.5mm，S2000A空間轉(zhuǎn)錄組每塊組織樣本長(zhǎng)寬不宜超過(guò)11*11mm，組織截面覆蓋小于25%的組織，建議多個(gè)包埋成一個(gè)OCT包埋塊，組織間隔盡量小，但是不要重疊，多個(gè)組織保持在一個(gè)水平面充分利用捕獲區(qū)域。

注1：在樣本量足夠的情況下，每個(gè)動(dòng)物樣本最好準(zhǔn)備至少2個(gè)包埋塊，1份用于RNA質(zhì)檢（切片質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)第3部分）、切片選片、上透化芯片和表達(dá)芯片，另1份用做備份，避免因樣本異常等特殊情況需要重新送樣而耽誤項(xiàng)目周期。

注2：在樣本量足夠的情況下，每個(gè)植物樣本最好準(zhǔn)備至少3個(gè)包埋塊，因植物組織目的結(jié)構(gòu)較薄，實(shí)驗(yàn)建議進(jìn)行全流程方案進(jìn)行空間實(shí)驗(yàn)，即一個(gè)包埋塊在一次切片實(shí)驗(yàn)中完成結(jié)構(gòu)確認(rèn)，貼片表達(dá)，貼片透化，避免反復(fù)切片導(dǎo)致結(jié)構(gòu)損失，其余2塊用做備份，避免因樣本異常等特殊情況需要重新送樣而耽誤項(xiàng)目周期。

3.2 樣本采集與運(yùn)輸

3.2.1 采集前準(zhǔn)備

1. 所有器械和環(huán)境需要消毒滅菌，所有器械（如剪刀、鑷子等）需要冰上預(yù)冷；
2. 在醫(yī)用托盤(pán)上放一層冰，然后覆蓋上一層錫箔紙，再鋪幾層無(wú)菌布，將個(gè)體放在無(wú)菌布上進(jìn)行取樣，保持整個(gè)取樣過(guò)程在低溫中進(jìn)行，可以延緩核酸的降解，（動(dòng)物組織建議針對(duì)活體或剛死亡個(gè)體進(jìn)行解剖取樣）；
3. 動(dòng)物組織如果取樣后無(wú)法立即進(jìn)行后續(xù)包埋實(shí)驗(yàn)，可以將樣本清理干凈后，暫時(shí)放入組織保護(hù)液（美天旎，貨號(hào)130-100-008）或DPBS或生理鹽水中并置于4℃冰箱暫存，暫存時(shí)間最長(zhǎng)不要超過(guò)5h，以免造成RNA降解，RIN值質(zhì)檢不合格；
4. 使用指定品牌的OCT（櫻花牌-4583）或OCT（leica-FSC 22）進(jìn)行包埋，OCT使用前在冰上預(yù)冷30分鐘。

3.2.2 動(dòng)物樣本采集

1. 取下新鮮組織，立即剔除結(jié)締組織和脂肪組織等非研究所需的組織類型，對(duì)腫瘤組織的取材，應(yīng)盡可能準(zhǔn)確地判定腫瘤和正常組織，腫瘤組織應(yīng)將周圍的正常組織切除干凈（正常組織也應(yīng)將周圍的腫瘤組織切除干凈）；
2. 迅速用預(yù)冷的 PBS溶液（RNase?free）或生理鹽水將組織表面的殘留血液沖洗干凈，然后用無(wú)菌紗布吸凈表面液體；
3. 如果組織體積較大，需要將組織切成長(zhǎng)寬＜5*6.5mm（10x Genomics）/6.8*6.8mm（百創(chuàng)S3000）的小塊，用7*7*5mm的特小號(hào)包埋盒進(jìn)行包埋；取下的組織應(yīng)立即進(jìn)行后續(xù)包埋實(shí)驗(yàn)。

注：原則上實(shí)驗(yàn)室不提供組織冷凍包埋相關(guān)試劑，需客戶網(wǎng)上自行購(gòu)買(mǎi)，如有需要請(qǐng)聯(lián)系運(yùn)營(yíng)確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室是否有存貨，因 OCT 試劑無(wú)法分裝運(yùn)送，實(shí)驗(yàn)室也僅僅可提供包埋盒。

3.2.3?植物樣本采集

1. 培養(yǎng)基培養(yǎng)樣本：在無(wú)菌超凈臺(tái)中取出組織，去除組織表面附著的培養(yǎng)基，用超純水將組織表面清洗干凈。從活體植株上取下新鮮目標(biāo)區(qū)域組織置于培養(yǎng)皿中，利用4℃預(yù)冷的鑷子和剪刀將目標(biāo)區(qū)域外的組織結(jié)構(gòu)盡量去除，若組織內(nèi)部存在空腔盡可能修剪組織暴露空腔，之后將組織裁剪成＜5*6.5mm（10x Genomics）/6.8*6.8mm（百創(chuàng)S3000）的小塊；
2. 土壤培養(yǎng)樣本：將組織從培養(yǎng)土中完整取出，去除土壤及雜質(zhì)，用超純水將組織表面土壤及雜質(zhì)徹底清洗干凈。從活體植株上取下新鮮目標(biāo)區(qū)域組織置于培養(yǎng)皿中，利用4℃預(yù)冷的鑷子和剪刀將目標(biāo)區(qū)域外的組織結(jié)構(gòu)盡量去除，若組織內(nèi)部存在空腔盡可能修剪組織暴露空腔，之后將組織裁剪成＜5*6.5mm（10x Genomics）/6.8*6.8mm（百創(chuàng)S3000）的小塊；
3. 將目標(biāo)組織按照不同組織類型包埋方法進(jìn)行包埋

注：原則上實(shí)驗(yàn)室不提供組織冷凍包埋相關(guān)試劑，需客戶網(wǎng)上自行購(gòu)買(mǎi)，如有需要請(qǐng)聯(lián)系運(yùn)營(yíng)確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室是否有存貨，因 OCT 試劑無(wú)法分裝運(yùn)送，實(shí)驗(yàn)室也僅僅可提供包埋盒。

3.2.4?動(dòng)物組織速凍包埋

下文提供了2種包埋方法：干冰包埋法、異戊烷+液氮包埋法，客戶可根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行選擇。干冰包埋法適合更多的組織類型，是最常用的包埋方法，也可以得到較好的切片結(jié)果；異戊烷+液氮包埋法，可以快速降溫，保護(hù)細(xì)胞完整性，但操作較復(fù)雜，而且異戊烷對(duì)人體有一定的健康危害，一些較小、較輕的樣本如穿刺樣本推薦使用液氮+異戊烷的方法進(jìn)行冷凍包埋。

方法1干冰包埋法（常用）

無(wú)需異戊烷，直接用干冰粒進(jìn)行包埋。

1. 將新鮮組織置于培養(yǎng)皿中，用干凈的紗布或者紙巾吸干組織周圍血水，盡量使組織表面干燥；
2. 標(biāo)記包埋盒（樣本名稱、樣本方向、包埋日期等，一定在冷凍之前，對(duì)包埋盒做標(biāo)記，一旦冷凍包埋盒將很難標(biāo)記信息）；
3. 將包埋盒轉(zhuǎn)移到冰上，在包埋盒中注入預(yù)冷OCT，注入量為包埋盒高度的1/4-1/3，避免產(chǎn)生氣泡；
4. 冰上預(yù)冷鑷子，將組織放入OCT中，調(diào)整好方向，用OCT覆蓋任何裸露組織的表面，確認(rèn)沒(méi)有氣泡，尤其是在組織附近，如果有氣泡可用移液槍將氣泡移除，以免影響組織切片形態(tài)結(jié)構(gòu)（此步需要拍照記錄，OCT冷凍后會(huì)變白，將很難確定組織的方向）；
5. 將包含組織和OCT的包埋盒放在干冰粒上輕輕按壓（如下圖，左），確保水平（否則會(huì)影響組織的方向，同時(shí)能保證干冰粒與包埋塊的接觸面積最大以達(dá)到快速降溫的效果），直到包埋塊完全凍結(jié)變白（如下圖，右）。
6. 將 OCT 包埋的組織塊和包埋盒用錫紙包裹好，做好樣本標(biāo)記，直接保存在–80℃的密封容器中，利用干冰運(yùn)輸。

方法2?異戊烷+液氮包埋法

腦組織等容易形成冰晶或者水腫病變組織推薦使用此方案進(jìn)行包埋。

1. 用異戊烷（足以完全浸沒(méi)組織）填充三分之二的金屬燒杯，然后放入液氮杜瓦瓶中（液氮與異戊烷保持相同的水平面）以充分接觸，孵育15分鐘；
2. 將新鮮組織置于培養(yǎng)皿中，用干凈的紗布或者紙巾吸干組織周圍血水，盡量使組織表面干燥；
3. 標(biāo)記包埋盒（樣本名稱、樣本方向、包埋日期等，一定在冷凍之前，對(duì)包埋盒做標(biāo)記，一旦冷凍包埋盒將很難標(biāo)記信息）；
4. 將包埋盒轉(zhuǎn)移到冰上，在包埋盒中注入預(yù)冷OCT，注入量為包埋盒高度的1/4-1/3，避免產(chǎn)生氣泡；
5. 冰上預(yù)冷鑷子，將組織放入OCT中，調(diào)整好方向，用OCT覆蓋任何裸露組織的表面，確認(rèn)沒(méi)有氣泡，尤其是在組織附近，如果有氣泡可用移液槍將氣泡移除。以免影響組織切片形態(tài)結(jié)構(gòu)（此步需要拍照記錄，OCT冷凍后會(huì)變白，將很難確定組織的方向）；
6. 用鑷子將包埋盒放到異戊烷上，不要使異戊烷浸入包埋盒內(nèi)，直到組織凍結(jié)，冷凍時(shí)間可根據(jù)組織類型和大小而變化（如下圖）；
7. 將 OCT 包埋的組織塊和包埋盒用錫紙包裹好，做好樣本標(biāo)記，直接保存在–80℃的密封容器中 ，利用干冰運(yùn)輸。

3.2.5 植物組織速凍包埋

下文提供了 3 種包埋方法，根據(jù)植物組織的部位不同，我們推薦了不同的包埋方式：

方法一?：抽真空+干冰冷凍OCT包埋（不需要固定）

1）按照2.3植物采樣方法裁取樣本，空隙較多組織（花苞、莖尖）需將組織部分切開(kāi)，目標(biāo)區(qū)域外組織需盡可能全部去除。

2）將植物組織浸泡在1ml 05%吐溫20中,室溫15min。

3）冰上預(yù)冷75% OCT包埋劑溶液（5mlOCT+2.5ml滅菌水顛倒混勻），1.5ml離心管中加入1ml 75%OCT，將植物組織浸潤(rùn)在其中，將平底的無(wú)吸附膜的吸附柱放入1.5ml離心管中，以防止抽真空過(guò)程組織上浮在OCT表面，打開(kāi)所有管蓋，置于真空濃縮儀中（注意配平）。室溫抽真空10min，摸索設(shè)置成V-AQ，促進(jìn)OCT溶液充分包裹和進(jìn)入組織空隙中，保證OCT填充包埋組織的完整性。如下圖：

4）將包埋盒放置在冰上 ，標(biāo)記包埋盒（組織放置的方向 、樣品名稱等）（可拍照記錄），在包埋盒底部加入適量的OCT包埋劑，約1/4深度 ，防止組織沉底直接接觸包埋盒底部 。

5）在冰上用鑷子輕輕夾住組織，輕輕擦拭表面的OCT，緩慢放入預(yù)冷的含OCT的包埋盒中 ，加預(yù)冷的OCT直至完全包裹組織，并調(diào)整組織在OCT中的位置 ，保證目標(biāo)平面與切面水平一致，如果多個(gè)組織包埋在一起時(shí)一定要將組織放置于包埋盒的中部排列整齊 ，避免重疊在一起，此過(guò)程中避免產(chǎn)生氣泡，如有氣泡產(chǎn)生用用針尖輕緩挑出氣泡或用200 μl槍頭吸出氣泡。

6）將包含組織和OCT的包埋盒放在干冰粒上輕輕按壓（如下圖，左），確保水平（否則會(huì)影響組織的方向，同時(shí)能保證干冰粒與包埋塊的接觸面積最大以達(dá)到快速降溫的效果），直到包埋塊完全凍結(jié)變白（如下圖，右）。

7）將 OCT 包埋的組織塊和包埋盒用錫紙包裹好，做好樣本標(biāo)記，直接保存在–80℃的密封容器中，利用干冰運(yùn)輸。

方法二?：直接冷凍OCT包埋（無(wú)需抽真空）

1. 按照2.3植物采樣方法裁取樣本
2. 將植物組織浸泡在1ml 05%吐溫20中,室溫15min。
3. 將包埋盒放置在冰上 ，標(biāo)記包埋盒（組織放置的方向 、樣品名稱等）（可拍照記錄），在包埋盒底部加入適量的OCT包埋劑，約1/4深度 ，防止組織沉底直接接觸包埋盒底部 。
4. 在冰上用鑷子輕輕夾住組織 ，緩慢放入預(yù)冷的OCT包埋劑中 ，直至OCT完全包裹組織。
5. 調(diào)整組織在OCT中的位置，盡量將組織放置于包埋盒的中部，保證目標(biāo)平面與切面水平一致。如果多個(gè)組織包埋在一起時(shí)一定要將組織放置于包埋盒的中部排列整齊 ，避免重疊在一起 ， 此過(guò)程中避免產(chǎn)生氣泡，如有氣泡產(chǎn)生用用針尖輕緩挑出氣泡或用200 μl槍頭吸出氣泡。
6. 用異戊烷（足以完全浸沒(méi)組織）填充三分之二的金屬燒杯，然后放入液氮杜瓦瓶中 （液氮與異戊烷保持相同的水平面）以充分接觸，孵育5- 10分鐘，時(shí)間不宜太久，防止異戊烷凝結(jié) 。（若無(wú)異戊烷及液氮可使用干冰包埋）
7. 用鑷子夾住包埋盒置于預(yù)冷的液氮-異戊烷浴上（避免模具被異戊烷浸沒(méi)）或干冰上，然后等待OCT凝固變白。
8. 將 OCT 包埋的組織塊或者包埋盒用錫紙包裹好，直接保存在–80℃的密封容器中 ，做好樣本標(biāo)記，利用干冰運(yùn)輸。

方法三?：石蠟包埋

石蠟包埋請(qǐng)使用百邁客專用試劑盒(試用裝)，此試劑盒適用于主根、莖、幼果（含水量大）等組織類型，OCT切片破碎的組織也可以使用此試劑盒嘗試包埋切片。

詳細(xì)操作步驟請(qǐng)查看試劑盒說(shuō)明書(shū)（此試劑盒目前為試用裝，未正式發(fā)布，有需求可溝通銷售）

3.2.6?樣本寄送運(yùn)輸

包埋后的組織用錫箔紙包住，放入密封袋中密封，放入樣本盒在液氮或者-80℃冰箱長(zhǎng)期保存，或者放置在干冰上進(jìn)行冷凍運(yùn)輸，寄送到百邁客實(shí)驗(yàn)室，干冰寄送推薦用量約5kg/日。

不規(guī)范送樣示例：

A.包埋時(shí)組織放置靠近最下層，組織未被OCT包裹，導(dǎo)致樣本RNA降解，質(zhì)檢不合格；

B.組織暴露在空氣中，導(dǎo)致樣本降解，組織兩側(cè)無(wú)OCT支撐，展片時(shí)可能會(huì)破壞樣本結(jié)構(gòu)；

C.組織較小，不滿足做表達(dá)最小25%的要求；

D.同一個(gè)包埋塊包埋了多個(gè)樣本，但不在同一個(gè)平面，并且每一個(gè)樣本組織過(guò)小，覆蓋區(qū)域有限，可能導(dǎo)致分析有效數(shù)據(jù)偏低。

3.3?切片質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

• 組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)：對(duì)動(dòng)物組織切片進(jìn)行H&E染色，對(duì)植物組織切片進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色，觀察是否獲取到目標(biāo)區(qū)域，組織形態(tài)完整性是否在可接受范圍內(nèi)（例如是否有大的裂痕，存在明顯的空泡、褶皺等）。
• RNA完整性檢測(cè)：收取10-15張切片，利用Agilent2100對(duì)樣本進(jìn)行RNA完整性檢測(cè)，要求RNARIN≥6，則認(rèn)為樣本完整性滿足實(shí)驗(yàn)要求，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。具體切片質(zhì)檢量如下：

1）10微米切片厚度，組織占包埋塊面積的1/5-1/4，質(zhì)檢量要求~20張（左圖）；

2）10微米切片厚度，組織占包埋塊面積的＞1/3，質(zhì)檢量要求~15張（右圖）。

3.4 測(cè)序數(shù)據(jù)量推薦

測(cè)序數(shù)據(jù)量：10x Genomics推薦60G/樣，百創(chuàng)S3000推薦250G/樣；

測(cè)序平臺(tái)：SURFSeq?5000

研究背景

大白菜是一種重要的結(jié)葉蔬菜作物。在抽穗期，葉片內(nèi)外表現(xiàn)出明顯的形態(tài)分化。然而，這種復(fù)雜的葉片形態(tài)分化的遺傳控制仍不清楚。

研究目的

在此，作者研究了抽穗期連續(xù)的頭葉從內(nèi)到外的轉(zhuǎn)錄組譜，通過(guò)在24個(gè)不同的葉片組織中展示了全基因組基因表達(dá)的序列-空間剖面，確定了可能在葉片抽穗中發(fā)揮重要作用的關(guān)鍵過(guò)渡頭葉片，為葉狀頭部的形成提供新見(jiàn)解。

材料方法

在溫室盆栽大白菜，使用11周大的植物進(jìn)行取樣。隨機(jī)選擇兩個(gè)正常生長(zhǎng)的大白菜。從外葉到內(nèi)葉的所有頭葉（葉長(zhǎng)>2cm）按順序分離收集，而帶有莖尖分生組織(SAM）的幼葉和小內(nèi)葉（葉長(zhǎng)<2cm）不分離，按順序收集。從每個(gè)大白菜頭部共得到30片葉子。從內(nèi)到外，每3片形態(tài)相似、大小相近的葉子為一葉輪，共得到10葉輪葉。

從每輪葉片中選取一片葉子，命名為L(zhǎng)1-L10，選擇SAM、L1、L2、L3、L5、L7和L9進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。對(duì)于RNA-seq，L2被分為兩部分，葉柄(L2R2）和葉片(L2R1），對(duì)于L3、L5、L7和L9，則分為五個(gè)區(qū)域，包括頂部(R1）、外緣(R2）、葉片的中部區(qū)域(R3）、葉柄的頂部(R4）和中部(R5）區(qū)域進(jìn)行采樣。對(duì)來(lái)自兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)（兩個(gè)葉頭）共計(jì)48個(gè)樣品用Illumina平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

圖1. 跨越11個(gè)葉子層的葉子的代表性圖片

研究結(jié)果

1、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

對(duì)48個(gè)樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共產(chǎn)生7.43×108高質(zhì)量cleanreads，皮爾遜相關(guān)系數(shù)為0.92-0.99，所有生物學(xué)重復(fù)都高度相關(guān)。將cleanread與大白菜參考基因組進(jìn)行比對(duì)，計(jì)算基因表達(dá)量TPM值，共鑒定出27,876個(gè)基因。其中，75.08%的基因在所有樣品中都有表達(dá)。

主成分分析(PCA）顯示沿主成分(PC）1和2有明顯的分離。PC1根據(jù)與SAM的距離將葉片樣本分開(kāi)，而PC2將葉片和葉柄組織分開(kāi)。層次聚類分析將樣本分為五類，與葉子形態(tài)分化一致。SAM和L1的樣本形成內(nèi)葉1(IL1）最接近莖尖的組織。內(nèi)葉2的葉片（IL2B）和內(nèi)葉2的葉柄（IL2P）代表L2-L5的葉片和葉柄組織，而外葉（OLB）和外葉柄（OLP）代表L2-L5的葉片和葉柄組織外葉（L7和L9），與葉子形態(tài)分化一致。

圖2. 抽穗期不同葉層大白菜葉片的轉(zhuǎn)錄組分析

2、差異表達(dá)基因分析

作者在全基因組水平上鑒定了不同葉片中的差異表達(dá)基因（DEG），以探索葉片之間的多樣性和潛在功能。通過(guò)分析，共發(fā)現(xiàn)9,133DEG，k-means聚類將差異基因分為14個(gè)共表達(dá)簇(CEC1-CEC14），這些CEC與圖1中的5個(gè)聚類簇緊密相關(guān)。IL1中DEGs的高表達(dá)水平以CEC1和2為代表。CEC1在SAM中高度表達(dá)，并以與分生組織發(fā)育、組織發(fā)育和近軸/遠(yuǎn)軸極性相關(guān)的基因?yàn)榇?。CEC2在SAM和L1高表達(dá)，包含與細(xì)胞分裂、細(xì)胞增殖、細(xì)胞生長(zhǎng)和生長(zhǎng)素生物合成過(guò)程相關(guān)的基因。IL2B中DEG的高表達(dá)水平以CEC4-6為代表。CEC4、5和6均富集于有機(jī)酸代謝過(guò)程、淀粉代謝過(guò)程、質(zhì)體組織和硫苷代謝、光合光反應(yīng)等過(guò)程。IL2P中DEGs的高表達(dá)以CEC9為代表。CEC9富含植物細(xì)胞壁相關(guān)過(guò)程，包括壁組織或生物發(fā)生，以及果膠代謝過(guò)程。OLB中DEGs以CEC7和8為代表。CEC7在L7葉片中高表達(dá)，并以與蛋白質(zhì)修飾過(guò)程、蛋白質(zhì)磷酸化和蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性相關(guān)的基因?yàn)榇?。這些結(jié)果反映L7具有明顯的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因調(diào)控特征。CEC8在L9葉片中高表達(dá)，含有一組與葉綠素分解代謝過(guò)程、細(xì)胞分解代謝過(guò)程、防御反應(yīng)調(diào)節(jié)、果糖反應(yīng)和脫落酸激活信號(hào)通路相關(guān)的基因。OLP中DEG的高表達(dá)水平以CEC11和12為代表。CEC11中的基因在L7-L9的葉柄中高度表達(dá)，在任何基因本體(GO）術(shù)語(yǔ)中均未富集。CEC12中的基因在L9的葉柄中高度表達(dá)。這些基因可能主要參與脫落酸激活的信號(hào)通路、茉莉酸（JA）代謝過(guò)程、JA反應(yīng)、防御反應(yīng)、生物刺激反應(yīng)、水楊酸反應(yīng)和外部刺激反應(yīng)。這些結(jié)果表明，L9可能在保護(hù)多葉頭部免受外部損害方面發(fā)揮作用。

圖3.差異基因在不同葉子中的表達(dá)譜

3、葉片發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)揭示葉球形成中的關(guān)鍵過(guò)渡葉

作者鑒定了細(xì)胞增殖相關(guān)基因和細(xì)胞擴(kuò)張相關(guān)基因。結(jié)果表明，大多數(shù)細(xì)胞增殖基因在IL1HLs中達(dá)到峰值，包括SAM和L1，但在IL2HLs和外HLs中迅速下調(diào)(圖3A），表明細(xì)胞增殖基因在不斷生長(zhǎng)的內(nèi)葉的起始過(guò)程中發(fā)揮重要作用。與細(xì)胞增殖基因不同，大部分細(xì)胞擴(kuò)張基因在IL2HLs和外HLs的葉片區(qū)域高表達(dá)，且表達(dá)模式更為多樣，分為4個(gè)簇(圖3A）。此外，大部分細(xì)胞擴(kuò)張基因在IL2HLs和外層HLs之間表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式，導(dǎo)致L7細(xì)胞分裂和細(xì)胞擴(kuò)張調(diào)控的變化明顯高于IL2HLs和外層葉(圖3B）。

圖4. 細(xì)胞增殖和細(xì)胞擴(kuò)增基因的表達(dá)模式

大白菜HLs的彎曲通常被認(rèn)為是由葉片正軸和背軸之間的不對(duì)稱細(xì)胞生長(zhǎng)引起的。通過(guò)分析ad-ab極性基因的表達(dá)模式，以探究ad-ab極性基因在頭葉曲率中的作用。結(jié)果表明，與內(nèi)部HL相比，大多數(shù)ad-ab極性基因在外部HL中顯示出顯著不同的表達(dá)模式。

圖5.?ad-ab極性基因的表達(dá)譜。

通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、PCA和聚類分析，以及與細(xì)胞分裂/擴(kuò)張和ad-ab極性相關(guān)的基因表達(dá)，L7位于內(nèi)葉和外葉之間的邊界。作者通過(guò)主成分分析和聚類將L7分類為外葉組，最終確定L7是顯示三種模式的過(guò)渡狀態(tài)。此外，作者進(jìn)一步分析了HLs中可溶性糖的積累和相關(guān)基因的表達(dá)特征，進(jìn)一步證實(shí)L7是葉狀頭部發(fā)育的關(guān)鍵過(guò)渡葉。

4、加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

為確定導(dǎo)致過(guò)渡葉特殊狀態(tài)的形成過(guò)程，作者進(jìn)行加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）。WGCNA共確定了17個(gè)模塊。其中，五個(gè)模塊（greenyellow、magenta、purple、turquoise和yellow）與過(guò)渡葉密切關(guān)聯(lián)。兩個(gè)模塊，greenyellow和magenta，與過(guò)渡葉特別相關(guān)，并包含許多編碼蛋白激酶的基因，包括絲裂原活化蛋白激酶(MAPK）、鈣依賴性蛋白激酶(CDPK）和富含半胱氨酸的受體樣激酶。關(guān)鍵過(guò)渡葉片L7可能受到復(fù)雜信號(hào)相互作用的調(diào)節(jié)，不僅是光和其他外部刺激，也有內(nèi)部激素。

文章亮點(diǎn)

作者報(bào)道了大白菜抽穗期的轉(zhuǎn)錄組圖譜，利用24個(gè)空間解剖組織，分別代表大白菜內(nèi)外葉的不同區(qū)域。全基因組轉(zhuǎn)錄組分析清楚地將內(nèi)葉組織與外葉組織分離開(kāi)來(lái)。通過(guò)對(duì)葉片發(fā)育和糖代謝關(guān)鍵基因的空間表達(dá)分析，確定了關(guān)鍵過(guò)渡葉，關(guān)鍵過(guò)渡葉是第一批內(nèi)彎的葉片。關(guān)鍵過(guò)渡葉的形成由一個(gè)復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)控制，不僅包括內(nèi)部激素和蛋白激酶，還包括外部光和其他刺激。這個(gè)發(fā)現(xiàn)為揭示抽穗性狀的遺傳控制提供了新的見(jiàn)解和豐富的資源。研究過(guò)程中作者利用生活中常見(jiàn)材料，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，思路簡(jiǎn)單，設(shè)計(jì)巧妙，值得借鑒學(xué)習(xí)。

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2022年值得關(guān)注的7大技術(shù)榜單

2021年利用空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)發(fā)文章呈現(xiàn)井噴式增長(zhǎng)，其中已正式發(fā)表文章有40余篇，而空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)為特色的預(yù)印本bioRxiv搜索“空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（spatial transcriptomics）”一詞，獲得了500余條結(jié)果，其中80余條是在2021年提交的，可以說(shuō)2021年是空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)應(yīng)用好文發(fā)表突飛猛進(jìn)的一年。

2016年-2021年空間轉(zhuǎn)錄組文章發(fā)表趨勢(shì)和影響因子分布

通過(guò)檢索空間轉(zhuǎn)錄組發(fā)表文章的數(shù)據(jù)分析來(lái)看，該技術(shù)在2021年中得到廣泛應(yīng)用，并且文章影響因子主要集中在10~20分區(qū)間，其占比高達(dá)39%，其次在30分以上占比達(dá)到30%，由此可見(jiàn)空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用極大提升了文章的質(zhì)量和檔次。

不僅如此，2021年空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)還在物種上有了新的突破，不再局限于人和鼠常見(jiàn)的模式物種，已經(jīng)開(kāi)始邁入哺乳動(dòng)物（豬）、家禽類（雞）、植物類（擬南芥、云杉、楊樹(shù)）等新的物種領(lǐng)域，極大拓展其應(yīng)用范圍。

物種空間轉(zhuǎn)錄組文獻(xiàn)發(fā)表統(tǒng)計(jì)

2021年空間轉(zhuǎn)錄組在不同組織部位上應(yīng)用也取得一些新進(jìn)展：比如骨組織一類就有不少文章發(fā)表，有頭蓋骨[PNAS，IF=11.2]、腰骨骼肌[NatureCommunications，IF=14.9]、肩部肌腱[AnnRheum Dis，IF=19.1 ]；生殖器官有子宮內(nèi)膜[Nat Genet，IF=27.6]、卵巢[NatureBiotechnology，IF=54.9]；泌尿系統(tǒng)：前列腺[Nature Communications，IF=14.9]、膀胱[NatureCommunications，IF=14.9]；腸道組織：胎兒腸道[Cell，IF=41.6]；脂肪組織：皮下腹部[CellMetabolism，IF=27.3]；腦組織：腦內(nèi)炎癥[[Ann Rheum Dis，IF=19.1 ]，IF=24.9]、等皮質(zhì)和海馬[Cell，IF=41.6]、腦神經(jīng)系統(tǒng)[AnnuRev Neurosci，IF=12.4]、前額葉皮層[Nat Neurosci，IF=24.9]、海馬和前額葉皮質(zhì)[NatureCommunications，IF=14.9]等都組織區(qū)域都有不錯(cuò)的研究報(bào)道，甚至連取材最困難的皮膚樣本都發(fā)表重要研究成果：皮膚肉芽腫[Nature Immunology ，IF=25.6]，空間轉(zhuǎn)錄組逐漸在更多的組織類型上得到廣泛的應(yīng)用，揭示更深層次空間維度生物學(xué)表型。

空間轉(zhuǎn)錄組不同組織應(yīng)用發(fā)表文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)

基于上面數(shù)據(jù)我們不難看出來(lái)前期研究，腦組織空間基因表達(dá)探索最為廣泛，當(dāng)然還有心臟組織、肝組織前列腺組織；植物主要集中在花序器官的研究，隨著各種組織探索和嘗試，基本上空間轉(zhuǎn)錄組已經(jīng)在各種組織中全面開(kāi)火，不管從技術(shù)的前瞻性也好，還是從空間這個(gè)維度深度闡釋一些生物學(xué)現(xiàn)象，彌補(bǔ)了細(xì)胞空間位置信息的趨勢(shì)，空間多組學(xué)技術(shù)毫無(wú)疑問(wèn)成為引領(lǐng)科學(xué)研究的風(fēng)向標(biāo)。

后續(xù)文章，敬請(qǐng)關(guān)注：

2021年度空間轉(zhuǎn)錄組動(dòng)植物四大應(yīng)用方向：時(shí)空?qǐng)D譜篇（發(fā)育）、腫瘤篇、疾病機(jī)制篇、生物進(jìn)化篇

關(guān)注我們

大腦是一個(gè)具有精密組織結(jié)構(gòu)的重要器官。對(duì)于大腦結(jié)構(gòu)-功能的關(guān)系、發(fā)育過(guò)程中大腦皮層以及退行性神經(jīng)疾病領(lǐng)域的研究，空間轉(zhuǎn)錄組可以揭示更多的信息。單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組結(jié)合可以將關(guān)注的細(xì)胞類型及亞型√確的錨定到空間位置上，解析不同功能區(qū)域與細(xì)胞類型及亞型的關(guān)聯(lián)性。

文獻(xiàn)一

英文題目：Neuroinflammatory astrocyte subtypes in the?mouse brain

中文題目：小鼠大腦神經(jīng)炎性星形細(xì)胞亞型

期刊：nature neuroscience

IF：24.884

文獻(xiàn)鏈接：https://international.biocloud.net/zh/article/detail/34413515

實(shí)驗(yàn)材料：脂多糖（LPS）和生理鹽水（saline）處理的雄性和雌性小鼠進(jìn)行scRNA-seq，共捕獲79944個(gè)星形膠質(zhì)細(xì)胞。3個(gè)LPS和saline小鼠大腦組織切片進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組。

研究背景：星形膠質(zhì)細(xì)胞在感染、急性損傷和慢性神經(jīng)退行性疾病后發(fā)生炎癥轉(zhuǎn)變。這種轉(zhuǎn)變是如何受到時(shí)間和性別的影響，它在單細(xì)胞水平上的異質(zhì)性，以及亞狀態(tài)在大腦中的空間位置上如何分布，目前仍不清楚。

研究結(jié)論：在本研究中作者使用細(xì)菌細(xì)胞壁內(nèi)毒素脂多糖研究小鼠皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞在急性炎癥刺激后的轉(zhuǎn)錄組變化。發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組變化發(fā)生在數(shù)小時(shí)內(nèi)，隨著時(shí)間的推移急劇變化。通過(guò)對(duì)約80000個(gè)星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，發(fā)現(xiàn)炎癥引起廣譜的反應(yīng)，亞型星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)歷了不同的炎癥轉(zhuǎn)變，并具有明確的轉(zhuǎn)錄組特征。利用空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和原位雜交技術(shù)將炎癥誘導(dǎo)的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的關(guān)鍵亞狀態(tài)錨定大腦區(qū)域。總之，數(shù)據(jù)集為分析星形膠質(zhì)細(xì)胞異質(zhì)性提供了強(qiáng)大的資源，并將有助于理解局部受限反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞亞狀態(tài)的生物學(xué)重要性。

圖1 DLPFC組織空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)

文獻(xiàn)二

英文題目：Neuroinflammatory astrocyte subtypes in the?mouse brain

中文題目：小鼠大腦神經(jīng)炎性星形細(xì)胞亞型

期刊：nature neuroscience

IF：24.884

文獻(xiàn)鏈接：https://international.biocloud.net/zh/article/detail/34413515

實(shí)驗(yàn)材料：脂多糖（LPS）和生理鹽水（saline）處理的雄性和雌性小鼠進(jìn)行scRNA-seq，共捕獲79944個(gè)星形膠質(zhì)細(xì)胞。3個(gè)LPS和saline小鼠大腦組織切片進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組。

研究背景：星形膠質(zhì)細(xì)胞在感染、急性損傷和慢性神經(jīng)退行性疾病后發(fā)生炎癥轉(zhuǎn)變。這種轉(zhuǎn)變是如何受到時(shí)間和性別的影響，它在單細(xì)胞水平上的異質(zhì)性，以及亞狀態(tài)在大腦中的空間位置上如何分布，目前仍不清楚。

研究結(jié)論：在本研究中作者使用細(xì)菌細(xì)胞壁內(nèi)毒素脂多糖研究小鼠皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞在急性炎癥刺激后的轉(zhuǎn)錄組變化。發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組變化發(fā)生在數(shù)小時(shí)內(nèi)，隨著時(shí)間的推移急劇變化。通過(guò)對(duì)約80000個(gè)星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，發(fā)現(xiàn)炎癥引起廣譜的反應(yīng)，亞型星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)歷了不同的炎癥轉(zhuǎn)變，并具有明確的轉(zhuǎn)錄組特征。利用轉(zhuǎn)空間錄組學(xué)和原位雜交技術(shù)將炎癥誘導(dǎo)的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的關(guān)鍵亞狀態(tài)錨定大腦區(qū)域?？傊瑪?shù)據(jù)集為分析星形膠質(zhì)細(xì)胞異質(zhì)性提供了強(qiáng)大的資源，并將有助于理解局部受限反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞亞狀態(tài)的生物學(xué)重要性。

圖2 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組鑒定星形細(xì)胞亞群及空間轉(zhuǎn)錄組細(xì)胞定位

文獻(xiàn)三

英文題目：Molecular atlas of the adult mouse brain

中文題目：成年小鼠腦分子圖片

期刊：Science advances

IF：13.116

文獻(xiàn)鏈接：https://international.biocloud.net/zh/article/detail/32637622

實(shí)驗(yàn)材料：三只雄性小鼠（9周齡）的大腦

研究背景：在建立子區(qū)域及其邊界的參考圖以及確定神經(jīng)元類型及其連接性的多樣性方面，對(duì)成年大腦進(jìn)行映射是探索定義動(dòng)物行為多樣性的腦回路的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的核心。實(shí)驗(yàn)神經(jīng)科學(xué)依賴于重復(fù)準(zhǔn)確地記錄和操縱特定大腦區(qū)域中神經(jīng)元亞型活動(dòng)的能力，因此，基因靶向方法已被證明在針對(duì)細(xì)胞類型的靶向中極為有價(jià)值。

研究結(jié)論：作者基于全腦范圍內(nèi)ST模式的無(wú)監(jiān)督分類建立了成年小鼠大腦的分子圖譜。這種方法是一個(gè)在全腦范圍內(nèi)映射離散空間域的無(wú)偏方法，并且還利用空間信息開(kāi)發(fā)分子方法以研究神經(jīng)系統(tǒng)組織，引入了分子和空間代碼進(jìn)化保守性的能力，以及它們與生理學(xué)和病理學(xué)的關(guān)系。另外作者簡(jiǎn)化了大腦基因索引測(cè)試區(qū)域分類的能力，這些基因也足以將整個(gè)成年大腦映射到相關(guān)的子區(qū)域。這種方法從分子視角對(duì)全腦進(jìn)行分類繪制圖譜，并比較物種間腦區(qū)域分布的保守分子標(biāo)記，可作為關(guān)鍵點(diǎn)為治療腦部疾病提供新策略。

圖3 空間轉(zhuǎn)錄組繪制全腦分子圖譜

空間轉(zhuǎn)錄組在神經(jīng)學(xué)方向研究思路

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