全長轉(zhuǎn)錄組研究可全面快速的獲取有參或無參物種特定組織或器官在某一狀態(tài)下的全長轉(zhuǎn)錄本信息，構(gòu)建轉(zhuǎn)錄本基因集。相較于RNA-seq，基于Nanopore三代測序平臺的轉(zhuǎn)錄組研究，無需打斷，直接讀取5’ 端到3’-PolyA的高質(zhì)量完整轉(zhuǎn)錄本，準(zhǔn)確鑒定可變剪接、新基因/新異構(gòu)體、可變多聚腺苷酸化、融合基因等，完善基因組注釋。此外，Nanopore平臺更擁有Direct RNA測序方式。

那么，使用Direct RNA測序技術(shù)，我們能做些什么呢？下面小編帶大家解析一篇新出爐的direc RNA 測序文章

結(jié)果

1、線蟲測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計及全長轉(zhuǎn)錄本鑒定

選取線蟲發(fā)育的L1、L2、L3、L4、幼年成蟲（YA）和成蟲時期，以及雄性成蟲，其中幼年成蟲和成蟲雌雄同體，對其進(jìn)行direct RNA測序，每個時期兩個技術(shù)重復(fù)。共計獲得5.54M reads，其平均長度為739到934 bp，基因組比對率為87.8%。

通過一系列的篩選標(biāo)準(zhǔn)，最終共計獲得2.9M 全長reads。綜合所有階段，最終鑒定到25,944 個全長轉(zhuǎn)錄本，其中20,987個轉(zhuǎn)錄本有唯一的可變剪接形式，16,325個轉(zhuǎn)錄本有唯一的3’UTRs ，平均每個階段鑒定到超過12,000條全長序列。在和線蟲數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋比對后，有12,613 轉(zhuǎn)錄本和10,711 個基因有全長數(shù)據(jù)支持，此外還鑒定到4,234個新基因和7,404 個新轉(zhuǎn)錄本。其中，發(fā)現(xiàn)9,900個已知可變剪接轉(zhuǎn)錄本和2,188個新的可變剪接轉(zhuǎn)錄本，對應(yīng)1,349個基因。在這些新的剪接轉(zhuǎn)錄本中，有1,283個轉(zhuǎn)錄本在注釋的供體和受體剪接位點之間存在新的剪接位點，同時173個轉(zhuǎn)錄本還存在新的外顯子。

圖一 全長轉(zhuǎn)錄本測序概述

2、3’UTR鑒定

本文共鑒定到16,325個唯一的3’UTR轉(zhuǎn)錄本，在每個階段均鑒定到超過10,000 個3’UTRs。將鑒定到的3’?UTR與已知數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)共有82.9% UTRs的重疊。此外，還鑒定到2,304個新的發(fā)現(xiàn)的3’?UTR。3’?UTR的長度會隨著階段的延續(xù)，從L1到L4，逐漸變短，在成年線蟲中，雄性線蟲的3’?UTR要短于雌雄同體的成蟲，而成蟲的 3’?UTR要稍長于L4階段的成蟲，這與前人的報道相反。通過不同階段多聚腺苷酸化位點統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)在不同階段，其位點不存在顯著差異，該結(jié)果表明，不同階段3’?UTR的長度分布與多聚腺苷化位點無關(guān)。

?圖二?3’?UTR特征統(tǒng)計

3、PolyA尾預(yù)測

研究表明，在黑腹果蠅中，polyA尾的長度會隨著發(fā)育階段而呈現(xiàn)出動態(tài)變化。而在本文中，通過對線蟲不同時期polyA長度的統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)其變化比較穩(wěn)定，在幼蟲發(fā)育階段，其變化范圍為49nt（L1）到54nt（L2）；在成蟲發(fā)育階段（幼年成蟲、雌雄同體成蟲和雄性成蟲），其polyA長度中位數(shù)為58nt，要長于幼蟲的polyA長度（52nt）。該結(jié)果表明，在成蟲和幼蟲之間，polyA的長度變化最為顯著。將L4階段的polyA長度分布與前人研究報道進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)其長度分布非常相似，均在30~40 nt出現(xiàn)峰值，并向較長的尾部延伸。

PolyA的長度，有可能和3’?UTR區(qū)域的polyA剪接位點（AAUAAA）有關(guān)。為了證明該推測，本文對不同polyA剪接位點類型（經(jīng)典的、可變的及無剪接位點）的polyA尾進(jìn)行了長度統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)不同類型間存在顯著差異，且3’UTR區(qū)域不存在polyA剪接位點的，具有更長的polyA尾巴。在3’UTR區(qū)域，無polyA剪接位點的，其polyA長度中位數(shù)為58 nt，具有可變polyA剪接位點的，長度為46 nt；具有經(jīng)典的polyA剪接位點（AAUAAA），其長度中位數(shù)為48 nt。研究表明，polyA尾的長度與基因表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，即高表達(dá)的基因具有更短的polyA尾。對本研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，在幼蟲發(fā)育階段發(fā)現(xiàn)有相似的負(fù)相關(guān)關(guān)系。例如，Y37E3.8基因的a轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)要顯著高于b.1轉(zhuǎn)錄本，其polyA尾相較于b.1更短。polyA長度和基因表達(dá)水平的相關(guān)性R²?最高為0.1297。在成蟲發(fā)育階段，polyA長度和基因表達(dá)水平的相關(guān)性并不是很高。該結(jié)果表明，基因表達(dá)水平和polyA尾長度的負(fù)相關(guān)性具有階段性。最后，本文研究了polyA長度與內(nèi)含子保留可變剪接事件的相關(guān)性。研究表明，在人類細(xì)胞系中，polyA尾的長度與內(nèi)含子保留有關(guān)。在本文中，也發(fā)現(xiàn)polyA尾和內(nèi)含子保留事件呈現(xiàn)正相關(guān)。該結(jié)果表明，polyA尾在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控存在一種保守機(jī)制，即在核轉(zhuǎn)錄本中，其擁有更長的polyA尾，而隨著轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的過程中，polyA尾會進(jìn)行脫腺苷化而進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后進(jìn)程。

圖三 PolyA 特征統(tǒng)計