1)植物葉片：（天根 DP441（廠家：天根，型號：DP441）
2)植物根、莖、種子：艾德萊 RN40（廠家：艾德萊，型號：RN40））試劑盒
3)動物常規(guī)組織：TRIzol
4)皮膚、毛發(fā)：凱捷 217044（廠家：凱捷。型號：217004）
5)全血PAX管送樣：PAXgene Blood miRNA Kit(50)（廠家：GENENODE。型號：2145A）試劑盒
6)EDTA抗凝血：TRIzol
2.1檢測方法
使用 Nanodrop2000 （廠家：賽默飛，型號 ：Nanodrop2000）對于提取的核酸進行濃度純度檢測，并使用 LabChip GX（廠家：鉑金埃爾默，型號：LabChip GX Touch HT）對完整性進行檢測
2.2判定標準
1)總量≥1（ug），滿足 2 次建庫
2)濃度≥20（ng/ul）
3)體積≥10(ul)
4)OD260/280 在 1.7-2.5 之間，OD260/230 在 0.5-2.5 之間，260nm 吸收峰顯示正常
5)RIN值≥8（非植物），RIN值≥7.5（植物），同時若GX檢測6.0-6.4的需結合基線判斷，28S/18S≥1 且基線無上抬或輕微上抬
6)樣本狀態(tài)正常，樣本粘稠、顏色異常、有渾濁或不溶物均不合格
3.1建庫流程
1) 利用帶OligodT的反轉錄引物通過退火與mRNA的polyA尾結合，然后加入RT逆轉錄酶合成第一鏈
2)使用含barcode的擴增引物擴增成雙鏈cDNA，并為樣品加上barcode
3)使用NEB Next FFPE DNA Repair Mix和NEB Next Ultra II End Repair/dA-Tailing Module完成核酸片段的損傷修復和末端修復加A
4)使用SQK-LSK114試劑盒完成測序接頭的連接
3.2建庫設備
數(shù)字 3*32PCR 儀 廠家 Appliedbiosystems 儀器規(guī)格 proflex3*32
制冷型程控五段金屬浴 廠家 天根生化 儀器規(guī)格 OSE-DB-02
3.3建庫試劑盒
1)PCR條形碼試劑盒 貨號 EXP-PBC096 廠家 Nanopore
2)NEBNext FFPE DNA Repair Mix 貨號 M6630L 廠家 NEB
3)NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module 貨號 E7546L 廠家 NEB
4)連接測序試劑盒 V14 貨號 SQK-LSK114 廠家 Nanopre
4.1上機操作
1)用測序芯片制備試劑盒配制 Flow cell Priming mix
2)用測序輔助擴展試劑盒配置上機文庫
3)用 PromethION Flow Cells 芯片，在PromethION48測序儀運行MinKnow 軟件，開始測序，默認運行72 小時
4.2測序設備
PromethION48 測序儀 廠家 Nanopore 儀器規(guī)格 PromethION48
4.3測序試劑
測序芯片制備試劑盒 廠家 Nanopore 貨號 EXP-FLP004
測序輔助擴展試劑盒 廠家 Naonopore 貨號 EXP-AUX003
測序芯片 PromethION Flow Cell(R10.4.1) 廠家 Nanopore 貨號 FLO-PRO114M
]]>