Nanopore全長轉(zhuǎn)錄組測序

nanopore全長轉(zhuǎn)錄組測序是指基于牛津納米孔公司（Oxford Nanopore Technologies，ONT）三代測序平臺進(jìn)行全長轉(zhuǎn)錄組測序。全長轉(zhuǎn)錄組測序，無需打斷，基于三代測序平臺直接獲取轉(zhuǎn)錄本的5ˊ到3ˊ高質(zhì)量全長序列，可準(zhǔn)確識別可變剪接、基因融合、可選擇性多聚腺苷酸化APA、等位基因特異性表達(dá)等轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)方面變異。基于nanopore三代測序平臺進(jìn)行全長轉(zhuǎn)錄組測序，除了可準(zhǔn)確鑒別上述轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)變異，還可實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄本（mRNA或polyA+ lncRNA）表達(dá)水平準(zhǔn)確定量。

主要在于測序平臺不同。Illumina平臺主要是PE150測序，構(gòu)建小片段文庫，為邊合成邊測序，在建庫以及測序過程中均需要PCR擴(kuò)增，主要用于基因水平表達(dá)定量及差異表達(dá)分析。nanopre全長轉(zhuǎn)錄組測序無需打斷RNA，可獲得5’到3’全長轉(zhuǎn)錄本序列及其表達(dá)信息，對片段大小無偏好，直接檢測電信號無需邊合成邊測序其GC偏好性遠(yuǎn)低于二代平臺；同時由于無需拼接其在轉(zhuǎn)錄本層面的結(jié)構(gòu)變異檢測方面，比如可變剪接、融合基因、APA、新基因預(yù)測等具有絕對優(yōu)勢。

nanopore測序是基于電信號識別堿基序列的三代測序技術(shù)。DNA/RNA上不同堿基或帶不同修飾時化學(xué)性質(zhì)存在差異，當(dāng)單鏈分子通過納米孔通道時，堿基造成的阻礙大小不一，因此會形成特征性離子電流變化信號。通過對這些信號進(jìn)行實時檢測，即可獲得相應(yīng)堿基類型，完成測序。目前通過“遞歸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（Recurrent Neural Network）”的復(fù)雜算法對堿基進(jìn)行判讀。

其特點為：

1）讀長長：最長讀長能達(dá)到2 Mb以上級別[ref1]，有利于可變剪接、基因融合等結(jié)構(gòu)變異檢測；
2）低成本：相比其他三代測序技術(shù)，ONT測序樣本處理極其簡單，無需DNA聚合酶、連接酶和dNTPs，測序價格低；
3）測序過程不涉及PCR擴(kuò)增：避免二代測序中PCR擴(kuò)增可能引入的錯誤或豐度變化；
4）direct-RNA/DNA方式建庫，可直接獲取堿基修飾信息，如甲基化修飾5mC、6mA等，無須像二代測序需要經(jīng)過重硫酸鹽轉(zhuǎn)化或者免疫沉淀富集實驗；
5）低GC含量和堿基偏好性，針對RNA測序無需打斷，轉(zhuǎn)錄本水平表達(dá)定量更準(zhǔn)確。

二代轉(zhuǎn)錄組測序一般基于邊合成邊測序二代短讀長的Illumina等平臺，由于讀長短（通常PE 150bp），需要進(jìn)行片斷化，打斷到200-300bp，測序過程需要DNA聚合酶和dNTPs以及進(jìn)行橋式PCR形成clusters放大熒光信號。
從二代轉(zhuǎn)錄組到nanopore三代全長轉(zhuǎn)錄組，平臺升級，技術(shù)革新，解決二代不能解決的問題！

樣品類型：PolyA RNA；樣品濃度：≥50 ng/ul（Qubit HS RNA定量）； 樣品總量：cDNA-direct方式：>250ng（單次）；總量>750 ng；（若提供總RNA，動物樣品總量需按照PolyA RNA要求的100倍以上準(zhǔn)備）； cDNA-PCR方式：>1μg（單次）；總量>3μg 樣品純度：OD260/280 ~2.0，OD260/230在2.0-2.2 之間，260nm處有正常峰值；樣品無基因組DNA污染； 總RNA完整性： RIN值≥8.0，28S/18S≥1.0；圖譜基線無上抬；5S峰正常。

研究表明，生物學(xué)重復(fù)可提高所有基因表達(dá)水平鑒定的準(zhǔn)確性，而增加測序深度主要提高低表達(dá)基因表達(dá)量鑒定準(zhǔn)確性。每種處理條件下至少3個生物學(xué)重復(fù)，當(dāng)研究樣本的生物學(xué)差異比較高，或者想研究更多的微小表達(dá)差異/fold change時，需要更多生物學(xué)重復(fù)。也就是，比如對于個體差異較大的臨床樣本可以5-10個/組以上，而生物學(xué)差異較小的細(xì)胞系樣本則每組3個生物學(xué)重復(fù)以上即可。

• 首先，轉(zhuǎn)錄本表達(dá)定量，是指針對一個基因的多個不同轉(zhuǎn)錄本(transcript)分別進(jìn)行表達(dá)定量。而基因水平定量，可以理解為一個基因所有轉(zhuǎn)錄本表達(dá)定量的加和。
• 多數(shù)公司二代轉(zhuǎn)錄組測序不提供一個基因的多個轉(zhuǎn)錄本分別定量的結(jié)果，原因在于二代轉(zhuǎn)錄組測序并適用于這種情況。二代短測序單條read無法跨越全長轉(zhuǎn)錄本，其表達(dá)定量在reads比對完成后需要用諸如StringTie等軟件進(jìn)行短reads組裝拼接得到轉(zhuǎn)錄本再進(jìn)行其表達(dá)量評估。
• 那么，二代轉(zhuǎn)錄組測序可能會存在拼接錯誤或者是拼接不完整，不能準(zhǔn)確獲得完整轉(zhuǎn)錄本，導(dǎo)致各個轉(zhuǎn)錄本水平表達(dá)定量不準(zhǔn)確。
• 尤為重要的是，二代測序?qū)τ谝粋€基因的多個轉(zhuǎn)錄本得到的reads，尤其是多個轉(zhuǎn)錄本共享的外顯子區(qū)對應(yīng)reads無法區(qū)分其來源轉(zhuǎn)錄本，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄本水平定量不準(zhǔn)確。
• 還有一些情況，當(dāng)不同基因具有比較相似的高度保守區(qū)時，這些區(qū)域的短reads也無法準(zhǔn)確區(qū)分其來源基因/轉(zhuǎn)錄本，即存在多比對的現(xiàn)象，這也導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄本甚至基因水平表達(dá)定量存在偏倚。
• nanopore三代全長測序無需對各轉(zhuǎn)錄本打斷和拼接，一條read即可跨越全長轉(zhuǎn)錄本，多比對率也比較低，因此能夠準(zhǔn)確獲取一個基因的多個全長轉(zhuǎn)錄本各自的表達(dá)信息。

注：上圖中藍(lán)色方塊表示測到RNA序列中能夠比對到基因組序列的區(qū)域，即屬于某個轉(zhuǎn)錄本外顯子區(qū)的reads；灰色線條表示我們測到的reads回比基因組序列時中間沒有比對上的，則用灰色線條連接，即reads不連續(xù)比對，中間被剪接掉的內(nèi)含子區(qū)。從圖中明顯看出，二代短reads比較短，多數(shù)短read單條連一個外顯子區(qū)都跨越不了，nanopore長讀長測序可以直接得到3種全長轉(zhuǎn)錄本。其中，Exon2和Exon6以及Exon9是三個轉(zhuǎn)錄本間共享的，那么對于完全比對到這3個外顯子區(qū)的短reads無法區(qū)分其來源轉(zhuǎn)錄本。而三代測序則直接跨越三個全長轉(zhuǎn)錄本，因此對于轉(zhuǎn)錄本水平表達(dá)定量更準(zhǔn)確。

• 來自同一基因的多個轉(zhuǎn)錄本可能行使不同功能，二代測序由于片段化測序?qū)е聦D(zhuǎn)錄本水平定量不準(zhǔn)確，對于轉(zhuǎn)錄本水平表達(dá)定量存在固有缺陷，nanopore三代測序彌補(bǔ)了此方面不足，尤其是對于基因水平不顯著差異表達(dá)的基因，該基因的某些轉(zhuǎn)錄本可能顯著差異表達(dá)，這些轉(zhuǎn)錄本可能具有重要生物學(xué)作用。比如有些基因的某些轉(zhuǎn)錄本只在特定條件下才表達(dá)。如果不能對轉(zhuǎn)錄本水平進(jìn)行準(zhǔn)確定量，則可能遺漏這些可能具有重要生物學(xué)功能的轉(zhuǎn)錄本。

• 人類中約95%基因存在可變剪接AS事件、70%以上基因存在APA現(xiàn)象[ref3]。AS、APA和fusion等是轉(zhuǎn)錄本多樣性以及蛋白多樣性的來源，多樣性轉(zhuǎn)錄本或蛋白發(fā)揮不同功能。

• 由于全長轉(zhuǎn)錄本序列的獲得，使得nanopore全長轉(zhuǎn)錄組測序在鑒定可變剪接（alternative splicing, AS）、可選擇性多聚腺苷酸化（APA）以及融合轉(zhuǎn)錄本（fusion transcripts）等轉(zhuǎn)錄本層面的結(jié)構(gòu)變異更準(zhǔn)確，這是之前三代長讀長測序廣為熟知的應(yīng)用。
• 目前利用二代Illumina高通量測序方法進(jìn)行可變剪切的檢測與分析非常普遍，但由于二代測序的讀長短，在準(zhǔn)確預(yù)測完整的isoform全長序列方面存在問題，同時存在難以判斷轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS）和轉(zhuǎn)錄終止位點（TTS）的位置、難以判斷哪些外顯子是連接在一起的問題。
• 針對同時發(fā)生多個外顯子跳躍和內(nèi)含保留等復(fù)雜轉(zhuǎn)錄本鑒定更是無能為力。

• 利用二代短序列測序來檢測融合基因存在一些問題：基因組重復(fù)序列以及多比對率比較高使得檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。
• 二代測序技術(shù)中為了研究APA已經(jīng)開發(fā)了不下于10種實驗技術(shù)方法，比如polyA-seq，雖然其可以提取準(zhǔn)確的polyA位置，但oligo(dT)引物可能結(jié)合到轉(zhuǎn)錄本內(nèi)部的連續(xù)A序列，導(dǎo)致假陽性率高，后續(xù)需要RNA Pol II結(jié)合等額外實驗驗證這些連續(xù)A序列確實是由APA引起的；而如果不進(jìn)行專門的polyA-seq，普通的二代轉(zhuǎn)錄組測序?qū)PA檢測效能低下，只能鑒定到約0.003％含有polyA的reads，并且短3’UTR通常嵌在長的UTR中，因此具有短3’UTR的isoform通常被轉(zhuǎn)錄組裝工具忽視。[ref5]
• nanopore三代全長測序無需對各轉(zhuǎn)錄本打斷和拼接，poly(A)會出現(xiàn)在測序結(jié)果中，并且可以得到從5’到3’的完整全長轉(zhuǎn)錄本，其多比對率也比較低，因此能夠準(zhǔn)確鑒定轉(zhuǎn)錄本水平各結(jié)構(gòu)變異。

使用三種納米孔建庫方式（PCR-cDNA、direct-cDNA和direct-RNA）數(shù)據(jù)和典型的短讀長cDNA技術(shù)制備酵母轉(zhuǎn)錄組文庫進(jìn)行比較：

a）在所有情況下，納米孔長讀長數(shù)據(jù)集的GC偏好都比短讀長數(shù)據(jù)集低。

b）與短讀長測序數(shù)據(jù)相比，納米孔長讀長測序數(shù)據(jù)的長度偏倚都較小。

綜上，nanopore全長轉(zhuǎn)錄組測序受基因的GC含量和長度偏好更小。

——圖片來源于Oxford Nanopore Technologies官方白皮書The value of full-length transcripts without bias。

ONT平臺目前我司下機(jī)數(shù)據(jù)堿基質(zhì)量Q值平均約在10左右，即堿基平均錯誤率為10^(-1)=10%左右，但這是單堿基錯誤率；

比對時用的是全長序列和參考基因組或參考轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比對，序列越長比對時對于堿基錯配度容忍越高，因此不會對表達(dá)定量有影響；

當(dāng)然由于比二代單堿基錯誤率高，故而百邁客將SNP和InDel檢測分析內(nèi)容去除了，因此想從RNA水平檢測snp/indel的客戶可能考慮做二代轉(zhuǎn)錄組測序。其實目前不乏使用nanopore測序數(shù)據(jù)檢測snp的文章，如NC|nanopore全基因組重測序鑒定人類基因組非同義新生SNP。

下面列舉了2個百邁客真實項目的數(shù)據(jù)質(zhì)量表，大家可以參考。

ONT全長轉(zhuǎn)錄組測序一條reads即代表該轉(zhuǎn)錄本表達(dá)一次，而二代短reads需要非常多條才能覆蓋一個轉(zhuǎn)錄本；oxford nanopore公司官方白皮書中數(shù)據(jù)顯示：當(dāng)相同數(shù)量的轉(zhuǎn)錄本被覆蓋達(dá)95%時，ONT所需要的reads數(shù)比Illumina約少50倍，所需要堿基數(shù)約少7倍。

故而2G ONT數(shù)據(jù)能達(dá)到6G Illumina檢測效果；

——圖片來源于Oxford Nanopore Technologies官方白皮書The value of full-length transcripts without bias。

針對同一樣本進(jìn)行的飽和度分析顯示，2G ONT全長除表達(dá)量極低的（CPM<1）其他轉(zhuǎn)錄本都達(dá)到飽和了，和二代Illumina 6G除表達(dá)量極低FPKM<1外的基因檢測也飽和了，且前者更早趨向飽和；

目前已發(fā)表的人鼠文獻(xiàn)中ONT全長測序的數(shù)據(jù)量大多也不到2G，比如文獻(xiàn)精讀|nanopore全長轉(zhuǎn)錄組測序揭示B細(xì)胞表面受體廣泛的轉(zhuǎn)錄變異。

應(yīng)用于慢性淋巴細(xì)胞白血病

英文題目：Full-length transcript characterization of SF3B1 mutation in chronic lymphocytic leukemia reveals downregulation of retained introns
發(fā)表雜志：Nature Communications
發(fā)表時間：2020.03
影響因子：11.878
使用Nanopore分別對慢性淋巴細(xì)胞白血?。–LL）分離的SF3B1野生型，突變株和正常組B細(xì)胞樣本進(jìn)行全長轉(zhuǎn)錄組測序?；贜anopore的全長cDNA測序可以檢測轉(zhuǎn)錄本全長，通過算法優(yōu)化，相對于短序列，可以更準(zhǔn)確的檢測3′末端剪切，內(nèi)含子保留，分辨生產(chǎn)性異構(gòu)體和非生產(chǎn)性異構(gòu)體。該研究證明了Nanopore測序在癌癥和可變剪切中的潛在使用價值。

應(yīng)用于精神疾病

英文題目：Long-read sequencing reveals the complex splicing profile of the psychiatric risk gene CACNA1C in human brain
發(fā)表雜志：Mol. Psychiatry
發(fā)表時間：2020.03
影響因子：11.973
在人腦中，與精神分裂癥相關(guān)的基因組區(qū)域富集了在神經(jīng)發(fā)育過程中表現(xiàn)出不同異構(gòu)體使用的基因，本文通過ONT全長轉(zhuǎn)錄組技術(shù)研究疾病相關(guān)的CACNA1C亞型，有可能提供既有效又無外周副作用的新型精神藥物。

應(yīng)用于阿爾茨海默病

英文題目：Deleterious ABCA7 mutations and transcript rescue mechanisms in early onset Alzheimer’s disease
發(fā)表雜志：Acta Neuropathol
發(fā)表時間：2017.09
影響因子：14.251
阿爾茨海默?。ˋD）是一種起病隱匿的進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。本文研究了ABCA7 PTC突變在一個大型早發(fā)性AD對照隊列中的患病率和疾病外顯性，并用ONT全長轉(zhuǎn)錄組檢查了其對轉(zhuǎn)錄水平的影響。揭示了不同程度的NMD和轉(zhuǎn)錄修飾事件，可能影響ABCA7的劑量、疾病的嚴(yán)重程度，并可能為AD的治療干預(yù)創(chuàng)造機(jī)會。

應(yīng)用于多囊腎病

英文題目：Human-Specific Abnormal Alternative Splicing of Wild-Type PKD1 Induces Premature Termination of Polycystin-1
發(fā)表雜志：Journal of The American Society of Nephrology
發(fā)表時間：2018.10
影響因子：9.274
常染色體顯性遺傳性多囊腎病的主要形式是由編碼多囊蛋白-1(PC1)的基因雜合突變引起的，通過ONT全長轉(zhuǎn)錄組測序等方法確認(rèn)存在多種剪接形式。研究發(fā)現(xiàn)，在雜合子個體中，低水平的全長PC1可能會將多囊蛋白信號降低到臨界的“成囊”閾值以下。

應(yīng)用于乳腺癌

英文題目：Nanopore sequencing of full-length BRCA1 mRNA transcripts reveals co-occurrence of known exon skipping events
發(fā)表雜志：Breast Cancer Res
發(fā)表時間：2017.11
影響因子：4.988
本研究探索了納米孔測序技術(shù)在檢測整個BRCA1 mRNA轉(zhuǎn)錄本以及對框內(nèi)和框外剪接事件進(jìn)行準(zhǔn)確分類方面的應(yīng)用。研究鑒定了32個完整的BRCA1亞型，其中包括18個新的亞型，還發(fā)現(xiàn)已知的BRCA1外顯子跳躍事件，如Δ(9，10)和Δ21。這些發(fā)現(xiàn)對預(yù)測剪接轉(zhuǎn)錄本的翻譯框架具有重要意義，對解釋剪接變異體的臨床意義也很重要。

應(yīng)用于肺癌

英文題目：Long read sequencing reveals a novel class of structural aberrations in cancers:identification and characterization of cancerous local amplifications
bioRxiv
本研究中利用ONT全長轉(zhuǎn)錄組和ONT重測序技術(shù)在肺癌基因組中識別和表征結(jié)構(gòu)畸變，揭示了由局部重復(fù)、倒位和微缺失的復(fù)雜組合組成的獨特結(jié)構(gòu)畸變CLCL，進(jìn)一步分析并發(fā)現(xiàn)，即使在關(guān)鍵的癌癥相關(guān)基因中，這些突變也發(fā)生在體內(nèi)，這些突變可能闡明了致癌性事件和治療策略仍然難以捉摸的患者的分子病因。

應(yīng)用于細(xì)胞表面受體

英文題目：Nanopore long-read RNAseq reveals widespread transcriptional variation among the surface receptors of individual B cells
發(fā)表雜志：Nature Communications
發(fā)表時間：2017.07
影響因子：12.121
短reads RNAseq解析復(fù)雜isoform的能力有限，因為它無法測序RNA分子的全長cDNA拷貝。作者研究了使用長讀取單分子Oxford Nanopore測序儀的RNAseq是否能夠在不犧牲準(zhǔn)確的基因表達(dá)定量的情況下，鑒定和定量復(fù)雜的isoform。在小鼠B1a細(xì)胞中鑒定了數(shù)千個未注釋的轉(zhuǎn)錄起始和終止位點，以及數(shù)百個可變剪接事件，鑒定了在B1a細(xì)胞中表達(dá)的數(shù)百種基因，這些基因顯示出多種復(fù)雜的isoform，包括幾種B細(xì)胞特異性表面受體。本研究表明，可以在單細(xì)胞水平上識別和定量復(fù)雜的isoform。