【文獻(xiàn)精讀】Nat Rev Genet綜述｜基因組三維空間結(jié)構(gòu)：染色質(zhì)互作數(shù)據(jù)的分析統(tǒng)計(jì)和計(jì)算方法

目前，對基因表達(dá)調(diào)控的研究主要是以基因及其調(diào)控元件的線性關(guān)系為基礎(chǔ)，然而，基因不僅僅以簡單的線性形式存在，越來越多的證據(jù)表明染色質(zhì)之間的相互作用在基因表達(dá)調(diào)節(jié)方面也起重要作用，即基因的表達(dá)調(diào)控存在三維空間網(wǎng)絡(luò)，基因表達(dá)可被遠(yuǎn)程調(diào)控元件所調(diào)控。

基于3C的技術(shù)方法產(chǎn)生了大量的全基因組相互作用數(shù)據(jù)。本文（發(fā)表于2013年Nat Rev Genet）簡述了主要的實(shí)驗(yàn)方法，更多篇幅用于描述最近開發(fā)的染色質(zhì)互作數(shù)據(jù)集的分析、計(jì)算和建模方法。在此討論3種方法：第1種方法，其目的僅僅在于識別比預(yù)期更頻繁互作的一對或一組基因座，比如染色質(zhì)環(huán)loop或特定的共定位事件，分析基因座間互作頻率以鑒定更高階的染色體結(jié)構(gòu)域；另外2種方法分別為距離約束建模（restraint-based modeling）和聚合體（polymer）建模，使用包括基線互作和非特異性互作在內(nèi)的所有互作數(shù)據(jù)來構(gòu)建染色體空間模型的集合。之后，3D模型可以用來鑒定染色體空間組織的更高階結(jié)構(gòu)特征和DNA元件，以估計(jì)折疊過程中細(xì)胞內(nèi)的染色質(zhì)動(dòng)力學(xué)以及細(xì)胞間的可變性。在此，作者討論了這些方法的應(yīng)用，包括如何確定染色體空間組織的原理，揭示新的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，并將這些結(jié)構(gòu)與基因表達(dá)和調(diào)控聯(lián)系起來。

一、實(shí)驗(yàn)技術(shù)——染色質(zhì)構(gòu)象捕獲及其衍生技術(shù)

染色質(zhì)構(gòu)象捕獲（chromosome conformation capture, 3C）技術(shù)原理是：（1）利用甲醛固定細(xì)胞核內(nèi)的相互作用的染色質(zhì)位點(diǎn)；（2）利用限制性內(nèi)切酶將DNA切成片段狀；（3）再用DNA連接酶對片段末端進(jìn)行連接，從而捕獲含有相互接觸DNA片段；（4）利用PCR 或者測序的方法檢測DNA片段的連接位點(diǎn)，獲得染色質(zhì)不同位點(diǎn)相互接觸的頻率；（5）數(shù)據(jù)分析，推斷出染色質(zhì)的空間位置信息，從而得到染色質(zhì)相互作用位點(diǎn)的圖譜。

不同的3C衍生技術(shù)的區(qū)別在于捕獲的連接片段檢測和定量方式：

3C：經(jīng)典的3C實(shí)驗(yàn)中，通過基因座特異性引物PCR檢測單個(gè)連接產(chǎn)物，大多數(shù)3C通常僅能分析幾十到幾百Kb染色質(zhì)之間的相互作用，通量低，費(fèi)時(shí)費(fèi)力——one vs one；

4C（“circular 3C”或“3C-on-Chip”）：使用反向PCR產(chǎn)生單基因座的全基因組相互作用圖，研究已知DNA片段（bait）與全基因組未知DNA片段之間的互作——one vs all；

5C（Chromosome conformation capture carbon copy）：基于3C的基本原理，結(jié)合連接介導(dǎo)的擴(kuò)增 （ligation-mediated amplification，LMA）來增加3C檢測的通量，識別兩組大量位點(diǎn)之間并行的數(shù)百萬個(gè)相互作用，例如一組啟動(dòng)子和一組遠(yuǎn)端調(diào)控元件之間的互作——many vs many。

Hi-C（High-throughput chromosome conformation capture）：用于對整個(gè)基因組所有位點(diǎn)間進(jìn)行無偏差的作用分析的3C衍生技術(shù)，該技術(shù)有一個(gè)獨(dú)特的步驟，即限制性酶切消化后用生物素標(biāo)記的核苷酸補(bǔ)平缺口，有助于選擇性純化用于測序的連接產(chǎn)物。Hi-C提供了一個(gè)真正全基因組范圍的相互作用圖譜（該圖譜的分辨率取決于測序的深度，常規(guī)測序數(shù)據(jù)量，即幾億reads時(shí)，小鼠或人類基因組中的染色質(zhì)互作的檢測分辨率為100Kb）——all vs all。

此外，還有將3C與染色質(zhì)免疫沉淀結(jié)合，以研究與特定蛋白結(jié)合的基因座之間互作的技術(shù)：

ChIP-loop（chromatin immunoprecipitation-loop assay）：常見的是ChIP-3C，以過量的限制性內(nèi)切酶將染色質(zhì)-蛋白質(zhì)交連物酶切消化后，用所研究蛋白質(zhì)的特異抗體進(jìn)行免疫沉淀，然后再連接酶切產(chǎn)物，后續(xù)步驟和3C相同——one vs one；

ChIA-PET（chromatin interaction analysis by paired-end tag sequencing）：對感興趣的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)之間的遠(yuǎn)程互作進(jìn)行全基因組分析——all vs all。

二、研究染色質(zhì)的空間組織形式

源于成像技術(shù)的見解

利用各種改進(jìn)的成像技術(shù)進(jìn)行的詳細(xì)研究揭示了染色體在整個(gè)細(xì)胞核內(nèi)的幾個(gè)組織原則：

1）在許多生物體的間期細(xì)胞中，染色體不易混合，而是占據(jù)它們自己的獨(dú)立區(qū)域；

2）染色體區(qū)域接觸的地方，可以形成交織的區(qū)域，為位于不同染色體基因座之間的潛在功能性互作提供機(jī)會；

3）轉(zhuǎn)錄事件在整個(gè)細(xì)胞核中并非廣泛地發(fā)生，而是發(fā)生在富含RNA聚合酶Ⅱ和轉(zhuǎn)錄以及RNA加工的其它組分的區(qū)域。這意味著積極轉(zhuǎn)錄的基因傾向于共同定位；

4）基因組的轉(zhuǎn)錄失活片段也傾向于彼此相關(guān)聯(lián)，并且常常位于核周邊、核仁周圍或果蠅中的亞核結(jié)構(gòu)上，如多梳體。

這些發(fā)現(xiàn)表明細(xì)胞核在空間和功能上可以劃分不同區(qū)域，基因座的亞核定位與基因表達(dá)相關(guān)。

染色質(zhì)構(gòu)象捕獲及其衍生技術(shù)（3C-based technologies）

成像技術(shù)的缺點(diǎn)：不易全面分析完整基因組的三維折疊，且分辨率達(dá)不到Kb水平。

基于3C及衍生技術(shù)，克服了成像技術(shù)的缺點(diǎn)，能夠以足夠的分辨率在全基因組范圍內(nèi)研究染色體折疊，以及涉及的基因和調(diào)控元件。詳細(xì)介紹見上述實(shí)驗(yàn)技術(shù)——染色質(zhì)構(gòu)象捕獲及其衍生技術(shù)。

3C、4C、5C和Hi-C數(shù)據(jù)集互作圖示例：

三、解析染色質(zhì)互作數(shù)據(jù)

這些3C及其衍生技術(shù)報(bào)告了細(xì)胞群體中兩個(gè)基因座空間上緊密接近的頻率，但未區(qū)分功能性與非功能性的位點(diǎn)間關(guān)聯(lián)，也未揭示導(dǎo)致其共定位的機(jī)制?？臻g上緊密接近包括以下幾種情況：1）Direct interaction：兩個(gè)基因座之間直接、特異性接觸的結(jié)果（由結(jié)合它們的蛋白質(zhì)復(fù)合物介導(dǎo)）；2）Interaction with the same sub-nuclear structures：成對基因座與相同亞核結(jié)構(gòu)間接共定位的結(jié)果（例如核纖層，核仁、或轉(zhuǎn)錄工廠等）。3）Bystander interaction：在某些細(xì)胞中，由于鄰近的某些遠(yuǎn)程互作或其他約束因素決定的染色質(zhì)纖維的堆積和折疊的造成的非特異性接觸，或者由于擁擠核中的隨機(jī)（非特異性）碰撞導(dǎo)致的非特異性接觸。4）Baseline(polymer) interaction：染色質(zhì)纖維非常長，而且柔韌，染色體具有聚合體性質(zhì)，因此，即使在沒有任何特定高階結(jié)構(gòu)的情況下，這個(gè)特征在很大程度上也決定了基因座間相互作用的頻率。

染色質(zhì)纖維的√確三維結(jié)構(gòu)在其它同類細(xì)胞之間甚至是高度可變的，并且在細(xì)胞內(nèi)局部區(qū)域（大約Mb大?。┦莿?dòng)態(tài)的。這解釋了為什么全面的染色質(zhì)互作數(shù)據(jù)集通常顯示一個(gè)基因座幾乎與基因組中的任何其它基因座具有互作的概率。檢測到的每個(gè)染色質(zhì)互作或連接產(chǎn)物實(shí)例，表示群體中單個(gè)細(xì)胞中的一對基因座的互作。因此，3C互作頻率數(shù)據(jù)代表細(xì)胞固定時(shí)，存在空間上緊密接近的基因座所在的那部分細(xì)胞，并且只有在基因組折疊顯示出巨大的細(xì)胞間異質(zhì)性時(shí)才能解釋該數(shù)據(jù)。這些突出了全面染色質(zhì)互作數(shù)據(jù)集的復(fù)雜性質(zhì)：互作數(shù)據(jù)表示大量細(xì)胞群體間相互作用的總和，并且在每個(gè)細(xì)胞中染色體構(gòu)象由作用于染色質(zhì)纖維的許多不同約束決定。

目前，分析染色體構(gòu)象的挑戰(zhàn)正在從開發(fā)用于生成日益全面和定量數(shù)據(jù)集的實(shí)驗(yàn)方法轉(zhuǎn)變?yōu)闃?gòu)建分析工具以解釋相互作用數(shù)據(jù)。 作者闡述的第一種方法是用來識別點(diǎn)對點(diǎn)的成環(huán)互作，例如， 啟動(dòng)子和基因調(diào)控元件之間的互作。

四、定位調(diào)控元件的靶基因

鑒定成環(huán)互作

后生動(dòng)物基因組中，每個(gè)基因被大量元件包圍。一個(gè)主要問題是：決定特定時(shí)間哪些元件調(diào)控特定基因的原理是什么?；谧罱甑膯蝹€(gè)基因的詳細(xì)分析，以及最近更全面的全基因組范圍的研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，調(diào)控元件與其靶基因進(jìn)行通信的主要機(jī)制是通過染色質(zhì)成環(huán)（chromatin looping），這使得線性距離很遠(yuǎn)的基因座可以在空間上密切接近。

單基因座研究中，經(jīng)典的3C技術(shù)被用于檢測感興趣的元件之間的相互作用頻率，例如，啟動(dòng)子和延伸至數(shù)百Kb的側(cè)翼染色質(zhì)間。分析這樣的“錨定”（anchored）互作圖，可以找到比預(yù)期更頻繁地與錨定位點(diǎn)互作的遠(yuǎn)側(cè)基因座，也就是成環(huán)互作（loop interaction）。通常，相互作用頻率隨著基因組距離的增加呈指數(shù)衰減。許多研究中，loop互作指在整體衰減基線之上觀察到局部峰（peak）。3C分析本質(zhì)上是定性，并且基于互作圖的簡單視覺檢測來識別交互頻率中的peak。比較不同細(xì)胞或不同條件下獲得的互作特征，可以提供更多信息，包括統(tǒng)計(jì)定量以及當(dāng)遠(yuǎn)程互作是條件性或細(xì)胞類型特異性時(shí)的loop互作信息。

特定基因組成環(huán)互作示例

經(jīng)典示例之一：基因座位控制區(qū)（locus control region,LCR）和相距40-80Kb的一組遠(yuǎn)端β-珠蛋白基因之間的長程互作。小鼠和人類的3C研究檢測到珠蛋白表達(dá)細(xì)胞中這些元件之間的顯著互作，且這些互作在不表達(dá)這些基因的細(xì)胞中顯著較不頻繁（如大腦）。這些互作由特定的轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)，包括結(jié)合LCR和基因啟動(dòng)子的EKLF1和GATA1。此外，成環(huán)互作通過促進(jìn)RNA聚合酶Ⅱ的募集和磷酸化直接促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。染色質(zhì)成環(huán)構(gòu)成基因調(diào)控元件在基因組遠(yuǎn)距離調(diào)控基因的常見機(jī)制。

五、綜合分析Loop

5C數(shù)據(jù)loop分析
5C技術(shù)通過并行繪制多個(gè)基因座之間的互作圖譜，允許更全面地分析大量基因的染色質(zhì)成環(huán)互作。例如，最近一項(xiàng)研究中，繪制了3種人類細(xì)胞系超過600個(gè)基因啟動(dòng)子的互作圖譜，分辨率：單個(gè)限制性片段（?4Kb）。假設(shè)大多數(shù)交互不是特異的loop交互，從整個(gè)數(shù)據(jù)集中估計(jì)互作頻率的基線值，由此估計(jì)出各基因組距離的互作頻率基線。然后通過檢測顯著高于該基線的信號，以選定的p值和錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率鑒定loop互作。與經(jīng)典的3C單基因座對研究相比，這種方法統(tǒng)計(jì)學(xué)分析上更嚴(yán)格，可以鑒定該基線上的顯著peak。示例見下圖。

5C的缺陷：1）受限于用于定義預(yù)期互作頻率的模型和假設(shè)；2）被檢測的細(xì)胞群體中的實(shí)際互作頻率（發(fā)生loop互作的細(xì)胞比例）仍然是未知的，并且可能非常低，這使得很難評估這些相互作用在任何給定細(xì)胞中的功能作用。

關(guān)于loop景觀的見解

盡管5C技術(shù)存在上述缺陷，但仍舊揭示了染色質(zhì)不同區(qū)域間遠(yuǎn)程互作參與基因表達(dá)調(diào)控的普遍規(guī)律。Sanyal等人發(fā)現(xiàn)了基因啟動(dòng)子和遠(yuǎn)端基因座之間有數(shù)千個(gè)重要的遠(yuǎn)距離loop互作，強(qiáng)調(diào)了許多基因啟動(dòng)子通過染色質(zhì)環(huán)與遠(yuǎn)端元件互作的觀點(diǎn)。普遍規(guī)律如下：1）許多染色質(zhì)成環(huán)事件是活性基因啟動(dòng)子和類似于活性增強(qiáng)子的遠(yuǎn)端元件之間的細(xì)胞類型特異性互作，這與這些染色體結(jié)構(gòu)在基因活化中的作用一致；2）其中一類豐富的遠(yuǎn)程互作即是啟動(dòng)子區(qū)與絕緣蛋白CTCF結(jié)合位點(diǎn)之間成環(huán)；3）通常認(rèn)為調(diào)控元件可以調(diào)節(jié)*鄰近的基因，但是成環(huán)互作經(jīng)常跳過一個(gè)或多個(gè)基因，這表明基因和元件的線性排列是它們之間功能和結(jié)構(gòu)互作的較差預(yù)測因子；4）基因和調(diào)控元件之間的關(guān)系并不唯一：一個(gè)基因可以與多個(gè)遠(yuǎn)端元件互作，同時(shí)一個(gè)元件也可以與多個(gè)基因互作。

此外，研究發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子周圍的成環(huán)互作模式不對稱：啟動(dòng)子可與位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游或下游的遠(yuǎn)端元件互作，但成環(huán)互作常見于上游?120Kb。不對稱原因尚不清楚，但是可能暗示某種方向性。從這些研究可以看出，染色體是由遠(yuǎn)距離互作驅(qū)動(dòng)的高度復(fù)雜的三維網(wǎng)絡(luò)。同時(shí)提出了新的問題：介導(dǎo)它們的蛋白質(zhì)以及這些成環(huán)互作如何促進(jìn)基因調(diào)控。

六、拓?fù)湎嚓P(guān)結(jié)構(gòu)域（topologically associating domains, TAD）

5C和Hi-C等技術(shù)，以不偏倚的方式對感興趣的基因組區(qū)域或整個(gè)基因組中的所有相互作用進(jìn)行分析，從而鑒定染色體的結(jié)構(gòu)特征。后生動(dòng)物基因組的一個(gè)突出特征是形成各種類型的染色體結(jié)構(gòu)域。果蠅、小鼠和人類染色體的研究發(fā)現(xiàn)，染色體由離散的拓?fù)湎嚓P(guān)結(jié)構(gòu)域（TAD）組成，其大小為數(shù)百Kb（見下圖中每個(gè)綠色橫線對應(yīng)的三角形，TAD染色質(zhì)局部相互作用較為強(qiáng)烈的一個(gè)作用單元）。

包含小鼠X染色體失活中心的4.5Mb區(qū)域的高分辨率5C互作圖揭示了一系列大的結(jié)構(gòu)域。位于這些TADs內(nèi)的基因座往往頻繁地相互作用，但它們與位于其領(lǐng)域之外的基因座的相互作用要少得多，即TAD內(nèi)部的相互作用強(qiáng)，不同TAD間的相互作用弱。這種特征使研究人員能夠通過分析分辨率較低的全基因組Hi-C互作圖與隱馬爾可夫模型方法結(jié)合，來識別整個(gè)人類和小鼠基因組中的TAD。TADs是染色體的通用結(jié)構(gòu)模塊，人類和小鼠的基因組都由2000多個(gè)TAD組成，覆蓋了90％以上的基因組。

TAD是由遺傳編碼的邊界元件定義的。刪除X染色體失活中心中兩個(gè)TAD之間的邊界，導(dǎo)致兩個(gè)側(cè)翼TAD的部分融合（并非完全融合），這表明激活了一個(gè)新的邊界。全基因組研究發(fā)現(xiàn)TAD邊界富含CTCF結(jié)合位點(diǎn)，盡管CTCT也經(jīng)常結(jié)合TAD內(nèi)部基因座。TAD的邊界除了富集 CTCF的結(jié)構(gòu)域，還有大量的持家基因、tRNAs、SINE 反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子等 DNA 元件。建立TAD邊界的機(jī)制仍不明確。

（CTCF, CCCTC binding factor，絕緣子結(jié)合蛋白，CTCF基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子，與絕緣子的活性相關(guān)，CTCF與靶順式元件的結(jié)合可阻斷增強(qiáng)子和啟動(dòng)子的相互作用，從而將增強(qiáng)子的活性限制在一定的功能區(qū)域。）

TADs的存在也提示了基因和遠(yuǎn)端調(diào)控元件之間可能發(fā)生的loop互作會存在限制，loop互作局限于位于相同TAD內(nèi)的元件。事實(shí)上，小鼠基因組中的初步分析表明增強(qiáng)子-啟動(dòng)子相互作用在TAD內(nèi)特別頻繁。也就是，TAD在調(diào)控基因表達(dá)方面具有主要作用，將基因限制于某些特定的遠(yuǎn)端調(diào)控元件。對X染色體失活中心的TAD進(jìn)行分析表明，相同TAD內(nèi)的基因傾向于在細(xì)胞分化期間協(xié)調(diào)表達(dá)，可能是因?yàn)樗鼈児蚕硐嗤囊唤M基因調(diào)控元件。 TADs的存在可以為長期觀察到一種現(xiàn)象提供染色質(zhì)結(jié)構(gòu)層面的解釋，這種現(xiàn)象即相鄰基因通常在多種細(xì)胞類型中表達(dá)相關(guān)。

七、補(bǔ)充內(nèi)容：基因組隔間（Genome compartments）

哺乳動(dòng)物基因組的染色體內(nèi)和染色體間相互作用圖揭示了一種相互作用模式，可以近似分為兩個(gè)隔間（A和B，或稱區(qū)室/隔室），它們沿著染色體交替，并且具有約5Mb的特征尺寸。A隔間優(yōu)先與整個(gè)基因組中的其它A隔間相互作用。 同樣，B隔間與其它B隔間相關(guān)聯(lián)。隔間信號可以通過互作圖的特征向量擴(kuò)展來量化。 A / B室信號不是簡單的雙相（僅代表兩種狀態(tài)），而是連續(xù)的，并且與轉(zhuǎn)錄活性指標(biāo)，如DNA可及性、基因密度、復(fù)制時(shí)間、GC含量和幾個(gè)組蛋白標(biāo)記相關(guān)。A-隔間主要是常染色質(zhì)-轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域，B-隔間則主要是聚集在一起的異染色質(zhì)（轉(zhuǎn)錄失活區(qū)域）。

Compartment的發(fā)現(xiàn)：Lieberman-Aiden 等（2009）在研究人染色質(zhì)互作時(shí)發(fā)現(xiàn)，在分辨率為1 Mb時(shí)，得到的染色質(zhì)相互作用矩陣圖中，由于染色質(zhì)不同區(qū)間互作強(qiáng)度不同產(chǎn)生了明顯的“格子圖案”模型（plaid pattern），見下圖，從而將染色質(zhì)大致分成2部分，A 隔間和B隔間。

圖片引自Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome[J]. science, 2009, 326(5950): 289-293，互作矩陣中顏色表示每對1Mb基因座染色質(zhì)間互作相關(guān)性系數(shù)（紅色：1，藍(lán)色：-1）。

TAD不同于較大的A和B隔間。：1）對胚胎干細(xì)胞、腦組織和成纖維細(xì)胞的分析表明，大部分的TAD在不同組織間保持不變，而A隔間和B隔間是活性和非活性染色質(zhì)的組織特異性結(jié)構(gòu)域，其與細(xì)胞類型特異性基因表達(dá)模式相關(guān)；2）A隔間和B隔間通常為幾Mb，并沿著染色體形成活性區(qū)域和非活性區(qū)域交替模式，相比之下，TAD較?。ㄖ兄导s為400-500Kb），可以是活性的或無活性的，并且相鄰的TAD不一定具有相反的染色質(zhì)狀態(tài)。 因此，TADs似乎是染色體的硬件特征，并且一組相鄰TADs形成A隔室和B隔室。

未完待續(xù)：后面的部分著重闡述構(gòu)建染色質(zhì)的3D模型構(gòu)建方法，即前面引言所述的另外2種方法：距離約束建模（restraint-based modeling）方法和聚合體（polymer）建模方法，由于篇幅所限，暫不列在本次解讀中。

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