文章題目：Comparison Between theFecal Bacterial Microbiota of Healthy and Diarrheic Captive Musk Deer
合作單位：北京林業(yè)大學
雜志名稱：Frontiers in Microbiology
影響因子：4.019
麝（shè）
研究背景
麝（shè）（Noschus noschiferus?Linnaeus），又稱為麝獐、香獐，種類少，麝的前肢短，后肢長，蹄小耳大，雌雄都無角，雄性有發(fā)達獠牙。麝棲居于山林，多在拂曉或黃昏后活動，聽覺、嗅覺均發(fā)達。雄麝臍香腺囊中的分泌物干燥后形成的香料即為麝香，是一種十分名貴的藥材，也是極名貴的香料。麝的數量急劇下降，因為人們?yōu)榱双@得麝香而不斷獵殺它們。
我國森林麝的養(yǎng)殖主要分布在兩個地區(qū)：陜南秦嶺山區(qū)和四川西部山區(qū)。自1958年以來，中國一直在試驗森林麝（Moschus berezovskii）養(yǎng)殖，并在過去幾十年中在許多方面取得了重大進展。養(yǎng)殖麝的最初目標是減少野生麝鹿資源的壓力，以獲得有價值的麝香。隨著野生麝數量的急劇減少，人工繁殖的麝種群也將構成一種重新引入的重要來源。然而，人工繁殖的森林麝種群長期受到健康不穩(wěn)定和疾病發(fā)病率高等因素的影響。腹瀉是人工繁殖的森林麝中最常見的疾病之一。在一些麝養(yǎng)殖場中，嚴重的腹瀉可導致死亡，腹瀉的死亡率達到30％。因此，近年來，腹瀉已成為人工繁殖麝的疾病預防和控制的重點，雖然相關研究仍然缺乏。
大量研究表明，哺乳動物腸道疾病的發(fā)生與腸道微生物的群落結構密切相關。腸道微生物是構成宿主內微生物的主要部分。已經證明腸道微生物群落能夠幫助結腸發(fā)酵，刺激免疫系統，防御病原體入侵和改善能量獲取，對宿主的健康和營養(yǎng)有重要作用。因此，腸道微生物的群落動態(tài)是保證寄主生理穩(wěn)態(tài)的重要因素。當正常的微生物群受到外源有害微生物的影響時，其自我平衡將被破壞，這可能導致消化紊亂甚至誘發(fā)宿主疾病。本研究通過利用高通量16S-rRNA基因測序技術，全面分析和比較健康和腹瀉森林麝糞便微生物群落的組成和結構，旨在為預防和控制麝香鹿的腹瀉提供了科學的理論依據，對改善圈養(yǎng)麝鹿的健康狀況具有重要意義。
材料與方法
1、試驗材料：選擇了4-6歲的成年森林麝鹿，包括8只健康麝（HMD）（編號H1-H8），8只輕度腹瀉麝（MMD）（編號M1-M8），和5只嚴重腹瀉的麝（SMD）（編號S1-S5）。共收集了21份糞便樣本。2、試驗方法：Illumina HiSeq 2500?，16SV3+V4
結果與分析
FIGURE 1 |?Boxplotand rarefaction curves of operational taxonomic units (OTUs).
2、健康和腹瀉的森林麝之間微生物多樣性的差異分析
麝鹿糞便樣本中Alpha多樣性指數（Ace，Chao 1，Simpson和Shannon）（圖2）和健康和腹瀉的樣本β多樣性指數統計結果顯示：HMD和MMD之間的Ace、Chao 1、Simpson和Shannon指數存在顯著差異（P <0.05）。MMD和SMD之間沒有顯著性差異。HMD和SMD的比較發(fā)現有顯著性差異（P <0.05）。
FIGURE 2 | Boxplot ofAlpha-diversity indices. Alpha diversity indexes are composite indexesreflecting abundance and consistency.
β多樣性用于分析物種組成的時間和空間變化，反映群體間細菌群落是否存在差異。NMDS圖顯示了微生物群落的不同，并揭示了腹瀉和健康麝鹿之間的獨特結構（圖3）。
FIGURE 3 | Non-metricmultidimensional scaling (NMDS) analysis.
組間和組內β距離在箱型圖中顯示（圖4），結果表明HMD和MMD組（圖4A）之間以及HMD和SMD組之間細菌群落的極顯著差異（圖4B）（?P <0.01）。
FIGURE 4 | Box plot ofInter-group and Intra-group Beta distance (ANOSIM Analysis).
3、核心微生物組成及相對豐度
物種分類柱狀圖是表示HMD、MMD和SMD樣本中物種的組成及對應物種在該樣本中的相對豐度。HMD、MMD和SMD樣本中在門水平和屬水平相對豐度前10的物種如圖5所示。無論是否存在腹瀉的樣本中，厚壁菌和擬桿菌都是主要的優(yōu)勢菌。然而，健康森林麝的糞便中厚壁菌的相對豐度明顯高于腹瀉麝。厚壁菌是構成食物中纖維素分解代謝并將纖維素降解為宿主揮發(fā)性脂肪酸的主要細菌類型。此外，厚壁菌門還可以調節(jié)體內免疫反應，抑制病原體的侵襲和預防腸道炎癥。腹瀉麝腸道中厚壁細胞豐度的減少可能會同時降低該物種的消化生理功能。另外，β多樣性的比較顯示，健康和腹瀉森林麝的細菌群落差異極顯著，這與麝的異常消化生理功能有關。HMD、MMD和SMD三組不同樣本之間共有OTU和特有OTU數量如圖6所示。
FIGURE 5 | Histogram of relativeabundance. The x-axis represents groups and the y-axis represents relativeabundance presented as percentage.
FIGURE 6 | Venn diagram.
4、健康與腹瀉森林麝的顯著差異分析及功能基因預測
LefSe分析表明（圖7），在屬的水平上，MMD組與HMD和SMD組之間顯著性差異較大的菌種為埃希氏菌?–?志賀氏菌。埃希氏菌屬?–?志賀氏菌是常見的病原體，其主要的傳播途徑包括：受感染對象的糞便、食物和含有細菌的水。該病原體可引起結腸粘膜炎癥，導致腹痛、腹瀉和形成粘膜糞便等癥狀。因此，用于喂養(yǎng)麝的食物和水以及糞便管理是減輕輕度腹瀉的關鍵。另外，SMD組與HMD和MMD組之間顯著性差異較大的菌種為梭桿菌。梭桿菌是炎癥性微生物，它可抑制體內T細胞應答并促進炎性因子的表達。比較MMD組和SMD組，可以推測Fusobacterium可能在輕度腹瀉的背景下增殖并成為主要病原體。因此，森林麝的腸道生理紊亂與其主要病原體的類型是存在一定的相關性的。
FIGURE 7 | LefSe analysis.
使用PICRUSt軟件通過比對16S測序數據獲得的物種組成信息，推測樣本中的功能基因組成，從而分析不同樣本或分組之間在功能上的差異（圖8）。與HMD相比組，免疫疾病代謝途徑中功能基因的豐度在腹瀉森林麝中顯著增加。腸道微生物的存在可以刺激宿主免疫系統的發(fā)育，增強宿主免疫功能，禁止病原微生物入侵。而腸道微生物引起的腹瀉可以影響宿主的免疫能力，從而增加對免疫疾病的易感性。此外，它還可能對宿主中生物系統的細胞免疫過程和代謝途徑產生影響。更加深入的研究還需以宏基因組分析來確認基因功能信息的準確性。
FIGURE 8 | (A) The abundance ratio ofdifferent functions between HMD and MMD. (B) The abundance ratio of differentfunctions between HMD and SMD.
結論
腸道微生物的群落結構與組成較為復雜，腹瀉森林麝鹿糞便中微生物種類較健康麝多，由許多潛在的原因導致的。除了我們此項研究的細菌病原體外，還可能是由于病毒、腸易激綜合征（IBS）等因素導致。因此該項目更深一步的研究還要根據宏基因組測序手段來進行研究。本研究通過利用高通量16S-rRNA基因測序技術，全面分析和比較健康和腹瀉森林麝糞便微生物群落的組成和結構，旨在為預防和控制麝香鹿的腹瀉提供了科學的理論依據，對改善圈養(yǎng)麝鹿的健康狀況具有重要意義。
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參考文獻：
YimengL , Xiaolong H , Shuang Y , et al. Comparison Between the Fecal BacterialMicrobiota of Healthy and Diarrheic Captive Musk Deer[J]. Frontiers inMicrobiology, 2018, 9:300-.
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