RNA-seq&ATAC-seq揭示TRIM28參與HIV-1潛伏感染機制【成功案例】

2019年新年伊始，百邁客與中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院合作發(fā)表了RNA-seq & ATAC-seq多組學(xué)文章，研究了人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)潛伏感染的分子機制，文章發(fā)表在Elife雜志上，詳情如下：

研究背景

HIV-1潛伏感染是利用抑制性聯(lián)合抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(combined antiretroviral therapy，cART)后實現(xiàn)治愈的一個主要障礙，其在體內(nèi)存在病毒儲藏庫，需要終身的聯(lián)合抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療。潛伏感染的靜息CD4⁺?T細(xì)胞不能產(chǎn)生足以被免疫系統(tǒng)識別的病毒抗原，因此很難被根除。作為功能性治療策略之一的“shock and kill”策略已經(jīng)引入并在這些年中得到廣泛應(yīng)用。然而，一些感染細(xì)胞含有非誘導(dǎo)型前病毒，其很難被LRA重新激活。進(jìn)一步闡明HIV-1潛伏期的機制將有助于我們更好地了解病毒儲藏庫的形成和維持，并開發(fā)新的治療干預(yù)措施。

（“Shock and kill”即“先激活后絕殺”策略，是利用藥物激活潛伏在T細(xì)胞內(nèi)的艾滋病毒使其暴露，隨后通過增強免疫系統(tǒng)或者抗病毒藥物消滅攜帶有病毒的宿主細(xì)胞。其中，“Shock”策略中很重要的就是潛伏期逆轉(zhuǎn)劑（Latency reversing agents，LRA）的研發(fā)；“kill”即對激活后的HIV病毒進(jìn)行殺傷，用的是用自體過繼免疫療法，如CTL反應(yīng)和抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）。）

表觀遺傳調(diào)控有助于建立和維持HIV-1潛伏感染：比如組蛋白脫乙酰酶、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶等”writer”在HIV-1長末端重復(fù)序列（LTR）上作抑制性表觀遺傳標(biāo)記，由”reader”蛋白蛋白HP1γ和L3MBTL1進(jìn)一步維持；miR-28等microRNAs和NEAT1等lncRNA，這些非編碼RNA能夠靶向病毒RNA和病毒蛋白，以介導(dǎo)HIV潛伏感染的轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。

重新激活潛伏HIV-1的另一個障礙取決于轉(zhuǎn)錄控制：轉(zhuǎn)錄起始水平，HIV-1潛伏期由轉(zhuǎn)錄因子（包括NF-κB、Sp1、AP-1、NFAT和TFIIH）缺陷以及轉(zhuǎn)錄抑制因子（包括LSF、YY1和CTIP2）的積累所貢獻(xiàn)。然而，細(xì)胞周期蛋白Cyclin T1的表達(dá)在潛伏感染的細(xì)胞中下調(diào)，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶 CDK9也是無活性的。

雖然許多工作揭示了HIV-1潛伏期的表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，但仍存在一些重要問題：1、可能有一個多功能因素負(fù)責(zé)這兩種機制；2、啟動子近端暫停的機制尚未完全闡明3、P-TEFb如何被適當(dāng)隔離、釋放并靶向HIV-1啟動子；4、尚未找到能夠有效重新激活潛伏HIV-1的強大逆轉(zhuǎn)劑LRA。

研究方法

• siRNA文庫高通量篩選：鑒定HIV-1抑制和潛伏的細(xì)胞靶蛋白，TZM-BL細(xì)胞系（一種攜帶有熒光素酶報告基因的傳代細(xì)胞系,并且該報告基因受HIV-1 tat原件調(diào)控，只有在HIV-1 Tat蛋白存在的情況下才能有效表達(dá)。）
• RNA-seq：用PHA刺激來自兩個健康供體的新鮮分離的CD4 + T細(xì)胞2天或不進(jìn)行處理，鑒定HIV-1潛伏相關(guān)基因
• ChIP實驗：TZM-bl和J-Lat 10.6細(xì)胞系鑒定TRIM28結(jié)合區(qū)域，以及后續(xù)各個組蛋白修飾或蛋白的chip鑒定
• SUMO-MS：TRIM28 SUMO化候選底物
• 蛋白功能閾缺失實驗：探究TRIM28的功能及重要功能域
• 共定位實驗：超分辨率的連續(xù)隨機光學(xué)重建顯微鏡（cSTORM）3D共定位及結(jié)構(gòu)光顯微鏡(SIM)共定位
• ATAC-seq：J-Lat 10.6或TZM-bl細(xì)胞系，研究TRIM28缺失后HIV-1啟動子的染色質(zhì)可及性
• 賴氨酸突變實驗及逆轉(zhuǎn)突變實驗以及SUMO-MS等：鑒定特異性SUMO化位點
• 細(xì)胞毒性相關(guān)實驗：細(xì)胞毒性測定、細(xì)胞活性測定、細(xì)胞數(shù)計數(shù)和細(xì)胞增殖測定
• 等

研究結(jié)果

1、TRIM28抑制HIV-1表達(dá)并導(dǎo)致HIV-1潛伏期

為了確定可能導(dǎo)致HIV-1抑制和潛伏的細(xì)胞靶點，作者定制了siRNA文庫在ZM-bl細(xì)胞系中進(jìn)行高通量篩選，該文庫靶向細(xì)胞核內(nèi)的幾種細(xì)胞途徑的182個基因，包括chromatin binding, epigenetic modification, chromatin remodeling, ubiquitination, SUMOylation 和 chromosome organization。分析敲除各靶標(biāo)基因后熒光素酶的表達(dá)水平變化（以siNC為對照），許多蛋白質(zhì)對應(yīng)的熒光素酶表達(dá)升高，表明這些蛋白限制HIV-1啟動子的活性，最明顯包括HP1α、GLP、SUZ12和CYLD，其已被鑒定為抑制HIV-1轉(zhuǎn)錄。其中，兩個較少見的SUMO化途徑基因TRIM28和SUMO4敲低后，顯著上調(diào)了HIV-1啟動子活性。

通過實驗發(fā)現(xiàn)si-TRIM28過表達(dá)抑制了HIV-1啟動子活性的基礎(chǔ)水平，并以劑量依賴的方式挽救了HIV-1抑制；當(dāng)與HIV-1 Tat和TNFα組合過表達(dá)時，上調(diào)更顯著；TRIM28在多種細(xì)胞系和原代細(xì)胞中普遍表達(dá)。為搜索HIV-1潛伏相關(guān)基因，作者利用RNA-Seq比較未刺激和PHA刺激的原代CD4⁺?T細(xì)胞中的基因表達(dá)作為補充實驗，TRIM28在未刺激的原代CD4⁺?T細(xì)胞中高表達(dá)，并在PHA激活后下調(diào)。當(dāng)活化的CD4⁺?T細(xì)胞恢復(fù)到靜止?fàn)顟B(tài)時，TRIM28的表達(dá)再次上調(diào)。為了測試TRIM28是否有助于HIV-1潛伏，在HIV-1潛伏細(xì)胞系J-Lat 10.6以及其他HIV潛伏細(xì)胞系模型（J-Lat 6.3/8.4/9.2和15.4）中敲低了TRIM28，發(fā)現(xiàn)TRIM28的缺失上調(diào)了HIV-1的表達(dá)。此外，當(dāng)補充廣泛定義的LRA：組蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制劑SAHA或BET結(jié)構(gòu)域抑制劑JQ-1時，HIV-1重新激活增強得更高。

 

 

先前已鑒定TRIM28通過募集HDAC1以使HIV-1整合酶去乙?；瘉硪种艸IV-1整合。在TZM-bl和J-Lat 10.6細(xì)胞系中進(jìn)行TRIM28的染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實驗，以研究其與整合的HIV-1 DNA的可能關(guān)聯(lián)。結(jié)果表明：TRIM28在HIV-1 LTR上顯著富集，不受TNFα信號傳導(dǎo)的影響。接下來，探究了TRIM28缺失是否會影響HIV-1 LTR的表觀遺傳狀態(tài)，敲除TRIM28后H3K9me2和H3K9me3顯著減少，以及H3K4me3和H3K9Ac顯著增加，也誘導(dǎo)H3K27me3輕微下調(diào)，表明TRIM28通過控制抑制性表觀遺傳修飾來抑制HIV-1表達(dá)并導(dǎo)致HIV-1潛伏期。

2TRIM28 SUMO化許多轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)移酶

接下來，作者通過構(gòu)建TRIM28不同區(qū)域的缺失突變體探究該蛋白功能。TRIM28是一種多功能蛋白，含有7個不同的結(jié)構(gòu)域：由鄰近的植物同源域（PHD）SUMO化的C-末端溴結(jié)構(gòu)域（BR），以SUMOylation依賴性方式募集SETDB1和NuRD復(fù)合物；N端三聯(lián)體基序RBCC區(qū)域由RING指結(jié)構(gòu)域（RING）、2個B-box domians（BB）和卷曲螺旋域（CC）組成。 TRIM28的RING起分子間SUMO E3連接酶的作用，而PHD對分子內(nèi)SUMO E3連接酶活性很重要。

HP1BD、NHD或BR缺失突變體，尤其是具有分子內(nèi)SUMO E3連接酶活性的PHD突變體，沒有能夠顯著地挽救抑制作用；RING或RBCC結(jié)構(gòu)域缺失突變體完全中止了再抑制，這可能是由于Krüppel相關(guān)的盒結(jié)構(gòu)域鋅指（KRAB-ZNFs）結(jié)合能力的喪失；而僅含有RBCC的突變體（TRIM28-RBCC）仍然恢復(fù)了抑制作用。野生型TRIM28能夠拯救抑制性表觀遺傳標(biāo)記H3K9me3和H3K27me3并抑制活性表觀遺傳標(biāo)記H3K9乙酰化，然而，沒有RING或PHD結(jié)構(gòu)域的突變體僅能夠挽救部分抑制標(biāo)記。因此，作者假設(shè)TRIM28可利用RING結(jié)構(gòu)域SUMO化對HIV-1表達(dá)至關(guān)重要的細(xì)胞蛋白。

為了鑒定由TRIM28 SUMO化的候選底物，作者進(jìn)行了全局位點特異性SUMO化質(zhì)譜（SUMO-MS），鑒定了1,329個SUMO化蛋白，并構(gòu)建了相互作用置信度為0.7的STRING互作網(wǎng)絡(luò)，MCODE分析發(fā)現(xiàn)STRING核心網(wǎng)絡(luò)可以聚類成12個亞群。GO分析發(fā)現(xiàn)細(xì)胞和代謝過程是SUMO化蛋白可能參與的前兩個生物過程。通過k-means聚類特異性地將轉(zhuǎn)移酶和轉(zhuǎn)錄因子聚類，并用STRING分析進(jìn)行可視化，發(fā)現(xiàn)許多候選蛋白對于HIV-1表達(dá)是關(guān)鍵的，例如JUN、JUNB、JUND、mTOR、STAT3、Cyclin T1（CCNT1）和CDK9。將SUMO化蛋白鑒定的顯著性閾值調(diào)低到10^-8，CDK9仍然排名靠前。作者在體外驗證了全局位點特異性SUMO-MS的可靠性。

3、CDK9由TRIM28 SUMO化

前面siRNA文庫篩選中，SUMO4缺失比其他SUMO旁系同源物缺失更顯著上調(diào)HIV-1啟動子活性。當(dāng)與HIV-1 Tat過表達(dá)組合時，上調(diào)更顯著，其現(xiàn)象與TRIM28實驗中觀察到的相似。SUMO4的敲低或敲除也能夠在J-Lat 10.6中重新激活潛在的假HIV-1。原代CD4⁺?T細(xì)胞被PHA刺激后，SUMO4的表達(dá)下調(diào)，恢復(fù)到靜止期后達(dá)SUMO4表達(dá)恢復(fù)到基礎(chǔ)水平。

接下來探究了SUMO4是否可以影響TRIM28的功能和HIV-1啟動子的表觀遺傳狀態(tài)：SUMO4敲低后，超過一半的TRIM28從HIV-1 LTR中丟失，表明TRIM28在HIV-1 LTR上的富集可能是部分SUMOylation依賴性的；SUMO4敲低后H3K9me、H3K9me2和H3K9me3在HIV-1 LTR上顯著降低，以及H3K9甲基化’writer’ SETDB1和’reader’ HP1α顯著降低；H3K9乙酰化和H3K4me3的顯著上調(diào)和HDAC1的下調(diào)，這與先前報道TRIM28以SUMO化依賴性方式募集SETDB1、HP1α和HDAC1一致；H3K27me3在HIV-1 LTR上也降低。一些多梳抑制復(fù)合物2（PRC2）組分如EZH2和SUZ12（H3K27me3的主要’writer’）可能被SUMO4 SUMO化，導(dǎo)致修飾功能的增強。

作者進(jìn)一步研究SUMO4在TRIM28介導(dǎo)的CDK9 SUMO 經(jīng)中的作用來鑒定其潛在的機制。通過CDK9與SUMO1、SUMO2和SUMO4共同過表達(dá)實驗，發(fā)現(xiàn)CDK9主要由SUMO1和SUMO4 SUMO化。補充過表達(dá)TRIM28后，SUMO-CDK9量變得更豐富。然而，如果僅用TRIM28共表達(dá)CDK9但沒有SUMO E2 酶UBC9時，SUMO化水平?jīng)]有增加，這表明TRIM28介導(dǎo)的SUMO化是UBC9依賴性的。當(dāng)TRIM28表達(dá)逐漸增加時，SUMO-CDK9 化水平以劑量依賴性增加。體外SUMO化測定表明，僅當(dāng)將SUMO4、E1 SAE1/UBA2，E2 UBC9和TRIM28一起提供到SUMO化反應(yīng)緩沖液中時，SUMO4與CDK9結(jié)合。在HeLa細(xì)胞中敲除TRIM28后，SUMO化的CDK9減少。前面的siRNA文庫篩選實驗中表明，幾種SUMO特異性蛋白酶(SENP)抑制HIV-1表達(dá)，尤其是SENP3，用TRIM28共表達(dá)SENP3，發(fā)現(xiàn)SENP3阻止了TRIM28介導(dǎo)的CDK9 SUMO化。作者在原代CD4⁺?T細(xì)胞中證實了以上結(jié)論?？傊?，TRIM28介導(dǎo)SUMO4與CDK9的結(jié)合，其被SENP3逆轉(zhuǎn)。

4、TRIM28 RING結(jié)構(gòu)域在結(jié)合和SUMO化CDK9中起關(guān)鍵作用

為了確定TRIM28是否與CDK9結(jié)合，作者使用超分辨率的連續(xù)隨機光學(xué)重建顯微鏡（cSTORM）來研究分辨率為20nm二者間的三維（3D）共定位。TRIM28存在于細(xì)胞核中，與點狀SUMO4共定位。放大視圖和3D-cSTORM，發(fā)現(xiàn)SUMO4蛋白被TRIM28富集并形成大斑點。CDK9存在于細(xì)胞核內(nèi)的分散點中，但仍發(fā)現(xiàn)CDK9與TRIM28共定位。與SUMO4類似，CDK9蛋白被TRIM28富集并包圍TRIM28。近80％的TRIM28斑點或復(fù)合物與94％的SUMO4斑點共定位，88％的TRIM28斑點或復(fù)合物與76％的CDK9斑點共定位。

免疫共沉淀（Co-IP）實驗發(fā)現(xiàn)即使在RNase存在下CDK9也與TRIM28結(jié)合。為了鑒定TRIM28的哪個區(qū)域與CDK9結(jié)合，構(gòu)建各種TRIM28缺失突變體以富集CDK9：RING結(jié)構(gòu)域缺失中止了CDK9的結(jié)合以及CDK9的SUMO化。實驗表明外源表達(dá)的TRIM28也與CDK9共定位?？傊?，研究表明RING和PHD都具有E3連接酶活性并富集UBC9。

 

5、TRIM28 SUMO化時抑制CDK9功能

進(jìn)一步探究CDK9的功能是否受TRIM28介導(dǎo)的SUMO化的影響。首先，ATAC-Seq探究TRIM28缺失后HIV-1啟動子的染色質(zhì)可及性。在J-Lat 10.6或TZM-bl細(xì)胞系中TRIM28缺失時，基因組中大多數(shù)增加的可及區(qū)域位于啟動子和遠(yuǎn)端基因間區(qū)域上。GO分析和COG分析表明，染色質(zhì)可及性變化發(fā)生在與各種生物過程和細(xì)胞組分相關(guān)的基因中，大多數(shù)受影響的功能基因具有DNA或蛋白質(zhì)結(jié)合能力和催化活性。

作者也對HIV-1基因組的染色質(zhì)可及性是否受到TRIM28缺失的影響進(jìn)行了分析，將ATAC-seq數(shù)據(jù)以HIV-1參考基因組進(jìn)行分析，轉(zhuǎn)座標(biāo)簽密度所指示的可及區(qū)域在HIV-1 LTR上增加，這表明啟動子活性顯著增強。且敲除TRIM28或SUMO4后HIV-1 LTR上CDK9和Ser2超磷酸化RNAP II顯著富集，這與TRIM28或SUMO4缺失重新激活HIV-1表達(dá)的結(jié)果一致。

Co-IP實驗發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期蛋白Cyclin T1僅與野生型CDK9結(jié)合形成正性轉(zhuǎn)錄延伸因子P-TEFb復(fù)合物，而不是SUMO化的CDK9。為了研究TRIM28介導(dǎo)的CDK9 SUMO化是否影響CDK9的激酶活性，進(jìn)行了體外CDK9 SUMO化測定和CDK9激酶活性測定：發(fā)現(xiàn)當(dāng)TRIM28 SUMO化CDK9時，CDK9的激酶活性顯著降低。不添加TRIM28，CDK9的激酶活性不受影響，盡管已添加其他SUMO化組分。

總之，TRIM28介導(dǎo)的SUMO化損害了CDK9與Cyclin T1的結(jié)合能力和CDK9對RNAP II的激酶活性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄延伸功能障礙。

6、SUMO4對CDK9的Lys44\Lys56\Lys68殘基SUMO化

接下來作者試圖鑒定應(yīng)該在CDK9?賴氨酸殘基上發(fā)生的SUMO化位點。賴氨酸突變實驗結(jié)果：CDK9-K0R突變體含有所有賴氨酸變?yōu)榫彼岬耐蛔?，完全中止了CDK9被SUMO化的能力；其他CDK9突變體仍然能夠通過TRIM28進(jìn)行SUMO化，這表明在整個CDK9序列中可能存在多個SUMOylation位點。采用基于CDK9-K0R全突變體的逆轉(zhuǎn)突變策略，發(fā)現(xiàn)CDK9上的幾個賴氨酸顯著SUMO化。其中，多個SUMO化位點與CDK9 C-末端自身磷酸化位點相鄰，據(jù)報道這些位點是Tat-P-TEFb與TAR RNA高親和力結(jié)合所必需的，即?SUMO化可以通過阻止相鄰的磷酸化來降低結(jié)合能力。

為了進(jìn)一步確定哪些位點確實僅被TRIM28 SUMO化，作者敲除了內(nèi)源性TRIM28并測試了上述鑒定候選位點的SUMO化潛力，發(fā)現(xiàn)Lys44、Lys56和Lys68的SUMO 化信號在缺乏內(nèi)源性TRIM28時完全消失，進(jìn)一步支持這些位點被TRIM28特異性SUMO化。直接分析富集的SUMO-CDK9的靶特異性SUMO-MS也證實了該結(jié)果。Lys44的乙?；瞧浼っ富钚运匦璧?，其他2個SUMO化位點Lys56和Lys68在CDK9和細(xì)胞周期蛋白T1的相互作用區(qū)域內(nèi)。SUMO蛋白是多肽大分子，它的存在可以形成空間位阻，從而阻止P-TEFb復(fù)合物的形成。

7、TRIM28缺失重新激活HIV-1感染者細(xì)胞中潛伏HIV-1

為了驗證TRIM28是否可以成為開發(fā)新LRA的安全靶標(biāo)，首先對Hela細(xì)胞、Jurkat細(xì)胞以及從感染者分離的靜息CD4⁺?T細(xì)胞中評估了缺失TRIM28相關(guān)的可能毒性：細(xì)胞毒性測定、細(xì)胞活性測定、細(xì)胞數(shù)計數(shù)和細(xì)胞增殖測定。結(jié)果表明TRIM28缺失對細(xì)胞活性和增殖無害。

之后作者試圖確定TRIM28的敲低是否在接受抑制性cART療法至少6個月的HIV-1感染者的靜息CD4⁺T細(xì)胞中重新激活潛伏的HIV-1。基于細(xì)胞內(nèi)HIV-1 RNA的定量，表明用αCD3/αCD28刺激顯著誘導(dǎo)HIV-1的表達(dá)。TRIM28敲低重新激活了與HDAC抑制劑SAHA相似量的HIV-1 RNA表達(dá)。在將TRIM28敲低與SAHA組合后，重新激活效果更顯著。同樣，SUMO4敲低和SAHA添加的組合使用可以重新激活比單獨使用更多的HIV-1 RNA表達(dá)。雖然TRIM28單獨缺失重新激活相似數(shù)量的具有SAHA的遺傳多樣化HIV-1表達(dá)，但TRIM28敲低和SAHA的組合重新激活了更多遺傳多樣化的HIV-1表達(dá)。

為了確定重新激活的HIV-1是否具有復(fù)制能力，用PHA激活的健康個體分離的CD4⁺?T共培養(yǎng)了HIV-1感染個體的PHA刺激的、SAHA誘導(dǎo)的或TRIM28敲低的靜息CD4⁺?T細(xì)胞。p24抗原的累積產(chǎn)生表明重新活化的HIV-1病毒顆粒具有復(fù)制能力。TRIM28的敲低在所有3個樣品中重新激活了具有復(fù)制能力的病毒。類似地，SAHA與TRIM28敲低的組合重新激活了更多具有復(fù)制能力的病毒顆粒。這些結(jié)果表明TRIM28有助于HIV-1感染個體的HIV-1潛伏，靶向TRIM28對HIV-1感染的CD4⁺?T細(xì)胞具有良好的適用性。

作者發(fā)現(xiàn)TRIM28不僅可以作為定義明確的表觀遺傳學(xué)adaptor，還可以作為SUMO E3連接酶與SUMOylate P-TEFb復(fù)合物一起發(fā)揮作用，從而顯著抑制HIV-1的表達(dá)并導(dǎo)致HIV-1潛伏。提出了TRIM28介導(dǎo)的HIV-1潛伏模型：在活躍狀態(tài)下，P-TEFb復(fù)合物被HIV-1 Tat募集至部分轉(zhuǎn)錄的HIV-1 RNA反式激活反應(yīng)元件（TAR）。 P-TEFb催化亞基CDK9使RNAP II的Ser2殘基超磷酸化，促進(jìn)RNAP II轉(zhuǎn)錄HIV-1 RNA的持續(xù)性；在潛伏狀態(tài)下，TRIM28被募集到HIV-1 LTR并在Lys44、Lys56和Lys68 SUMO化CDK9，導(dǎo)致CDK9激酶活性的抑制和其與細(xì)胞周期蛋白T1的隔開，沒有Ser2的超磷酸化，RNAP II啟動子近端暫停在LTR。因此，潛伏狀態(tài)由TRIM28介導(dǎo)的CDK9功能障礙和TRIM28介導(dǎo)的核小體nuc-1的抑制性表觀遺傳修飾維持，核小體nuc-1恰好位于HIV-1啟動子的下游。

參考文獻(xiàn)：

Ma X, Yang T, Luo Y, et al. TRIM28 promotes HIV-1 latency by SUMOylating CDK9 and inhibiting P-TEFb.Elife. 2019 Jan 17;8. pii: e42426.

 

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