2019年04月18日，Genome Biology在線發(fā)表了中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所與北京百邁客生物科技有限公司共同合作文章“Whole genomes and transcriptomes reveal adaptation and domestication of pistachio” 中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所研究員吳東東為本文通訊作者，中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所曾琳，北京百邁客公司大項(xiàng)目負(fù)責(zé)人韓鳳鳴，戴鶴為共同第一作者。本文繪制了開(kāi)心果的基因組草圖，并對(duì)其進(jìn)行了大規(guī)模的基因組重測(cè)序并進(jìn)行了比較基因組分析，表明，開(kāi)心果的應(yīng)激適應(yīng)可能與細(xì)胞色素P450和幾丁質(zhì)酶基因家族的擴(kuò)增有關(guān)。尤其重要的是，比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明茉莉酸（JA）生物合成途徑在開(kāi)心果耐鹽性中起著重要作用。此外，研究人員對(duì)93個(gè)栽培種和14個(gè)野生種（P. vera）基因組及35個(gè)親緣關(guān)系密切的野生黃連木屬基因組進(jìn)行了重測(cè)序，以提供對(duì)種群結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性和馴化的見(jiàn)解與思路。
研究背景
隨著農(nóng)業(yè)面積的減少和人口的增長(zhǎng)，糧食危機(jī)正成為一個(gè)日益嚴(yán)重的問(wèn)題。沙漠約占地球陸地表面積的三分之一，是貧瘠的環(huán)境，幾乎沒(méi)有降水，通常有干燥和堿性土壤，因此對(duì)大多數(shù)植物和動(dòng)物的生活條件都很不利。然而，一些沙漠地區(qū)仍可以種植一些作物。洞察這些物種的環(huán)境適應(yīng)和經(jīng)濟(jì)特征，有助于在不同的沙漠地區(qū)種植和繁殖這些作物，這可能有助于緩解世界糧食危機(jī)。
開(kāi)心果（p.vera，2n=30，圖1a）雙子葉植物綱、無(wú)患子目和漆樹(shù)科，是起源于中亞和中東的腰果家族成員。它是一種沙漠植物，對(duì)鹽漬土有很高的耐性。開(kāi)心果最近成為第五大堅(jiān)果作物，除了具有經(jīng)濟(jì)、營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值外，對(duì)非生物脅迫也有很強(qiáng)的適應(yīng)能力，被認(rèn)為是一種能耐受干旱和鹽堿脅迫的物種，是干旱和鹽堿區(qū)重新造林的理想選擇。
盡管基因組測(cè)序的快速發(fā)展有助于發(fā)現(xiàn)許多作物馴化和改良的遺傳基礎(chǔ)，但關(guān)于開(kāi)心果的研究卻很少。據(jù)估計(jì)，開(kāi)心果的基因組大小約為600 MB，雜合率高。Moazzzam Jazi等人利用全基因組轉(zhuǎn)錄組，通過(guò)對(duì)照和鹽處理兩個(gè)開(kāi)心果品種的比較，發(fā)現(xiàn)了耐鹽性相關(guān)的標(biāo)記物和應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制。
在本研究中，為了更好地了解開(kāi)心果馴化的分子進(jìn)化歷史，研究人員組裝了開(kāi)心果的基因組草圖，并對(duì)107個(gè)全基因組進(jìn)行了重測(cè)序，包括93個(gè)馴化和14個(gè)野生的開(kāi)心果以及35個(gè)不同野生黃連木屬物種。整合基因組和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示，擴(kuò)張的基因家族（如細(xì)胞色素P450和幾丁質(zhì)酶）和茉莉酸（JA）生物合成途徑可能參與應(yīng)激適應(yīng)。比較群體基因組分析顯示，開(kāi)心果大約在8000年前被馴化，馴化的關(guān)鍵基因可能是那些涉及樹(shù)木和種子大小的基因，這些基因經(jīng)歷了人工選擇。這些基因組序列應(yīng)該有助于未來(lái)的研究，以了解沙漠作物的農(nóng)業(yè)和環(huán)境相關(guān)特性的遺傳基礎(chǔ)。
材料方法
開(kāi)心果（P.vera）二代測(cè)序denovo：
測(cè)序材料：開(kāi)心果栽培種“Batoury”；Illumina Hiseq 2500[包括兩種類(lèi)型小片段文庫(kù)（270 bp和500 bp）]和六種類(lèi)型 mate-pair文庫(kù)（3 kb、4 kb、8 kb、10 kb、15 kb和17 kb）；PacBio sequel
重測(cè)序：107個(gè)開(kāi)心果（93個(gè)馴化+14個(gè)野生）、35個(gè)不同野生黃連木屬物種；Illumina；
轉(zhuǎn)錄組：A：鹽處理：Ohadi（根：salt treatment 3 rep vs control 3 rep；葉：salt treatment 3 rep vs control 3 rep）；B：野生型和馴化型：Ohadi和Sarakhs[根：Sarakhs (wild 3 rep) vs Ohadi (control 3 rep)；葉：Sarakhs (wild 3 rep) vs Ohadi (control 3 rep)]；
注：Ohadi與Sarakhs分別代表Pistacia vera的不同品系，Ohadi被認(rèn)為是馴化型，Sarakhs是野生型）。
研究結(jié)果
1.?開(kāi)心果的基因組進(jìn)化
利用Illumina Hiseq 2500平臺(tái)組裝了569.12 Mb的開(kāi)心果基因組草圖，Contig N50為20.69kb和Scaffold N50為768.39 Kb。為了提高連續(xù)性，進(jìn)一步通過(guò)PacBio sequel系統(tǒng)組裝了671 MB的基因組草圖，ContigN50為75.7 Kb，Scaffold N50為949.2 Kb?；蚪M質(zhì)量與先前報(bào)道的植物基因組相一致，有助于一些令人信服的數(shù)據(jù)分析。裝配尺寸略大于估計(jì)的基因組尺寸，這可能是與開(kāi)心果的高雜合度（1.72%）有關(guān)。轉(zhuǎn)座因子占開(kāi)心果基因組的70.7%，其中46.75%為L(zhǎng)TR（長(zhǎng)末端重復(fù)轉(zhuǎn)座）。CEGMA分析表明，96.94%的核心蛋白編碼基因被恢復(fù)。BUSCO評(píng)估表明有94.51%完整的基因模型。
作者首先進(jìn)行了比較基因組研究，以評(píng)估該物種的古歷史。利用9個(gè)植物基因組單拷貝家族基因的系統(tǒng)基因組分析表明，開(kāi)心果在58百萬(wàn)年前從柑橘中分離并在105百萬(wàn)年前從毛果楊中分離出來(lái)。4DTV結(jié)果表明，開(kāi)心果基因組在其與這些物種的分化之后沒(méi)有經(jīng)歷譜系特異性的全基因組復(fù)制。文中還通過(guò)將開(kāi)心果基因組與基礎(chǔ)被子植物無(wú)油樟基因組進(jìn)行共線性分析，表明每個(gè)無(wú)油樟區(qū)域最多有三個(gè)開(kāi)心果區(qū)域，而每個(gè)開(kāi)心果區(qū)域最多有兩個(gè)毛果楊區(qū)域（圖1b）。共線性分析支持這樣一個(gè)結(jié)論：開(kāi)心果中沒(méi)有發(fā)生譜系特異性基因組復(fù)制，但它們與真雙子葉植物中發(fā)生的γ復(fù)制相同，而毛果楊經(jīng)歷了譜系特異性基因組復(fù)制事件。
圖1 開(kāi)心果基因組進(jìn)化
2.?開(kāi)心果應(yīng)激適應(yīng)相關(guān)的擴(kuò)張基因家族
為了揭示開(kāi)心果表型（如耐鹽性）的遺傳基礎(chǔ)，利用OrthoMCL通過(guò)識(shí)別不同植物之間獨(dú)特和共同的基因家族來(lái)研究基因家族的進(jìn)化。開(kāi)心果與擬南芥、柑橘、雷蒙德氏棉、葡萄相比有9735個(gè)共有基因家族，而含有1381個(gè)基因的707個(gè)開(kāi)心果有特基因家族。對(duì)這些基因進(jìn)行GO與KEGG富集分析，并都發(fā)現(xiàn)了許多與“防御反應(yīng)”有關(guān)的基因，其中包括許多包含NB-ARC domain和NBS-LRR domain的基因。這種基因以植物抗病性著稱，對(duì)開(kāi)心果的防御反應(yīng)具有相當(dāng)重要的意義。
接下來(lái)，作者研究了開(kāi)心果基因家族的擴(kuò)張和收縮（圖1c）。由于很難從基因家族規(guī)模的收縮或與未在該參考基因組中成功組裝的基因有關(guān)，這里只分析了擴(kuò)展的基因家族。對(duì)擴(kuò)展基因家族的基因富集分析發(fā)現(xiàn)，它們?cè)诖x類(lèi)別中豐富，如萜類(lèi)、黃酮類(lèi)、倍半萜類(lèi)和生物堿的生物合成?；蚣易宓臄U(kuò)展發(fā)生在長(zhǎng)期進(jìn)化之后，并推動(dòng)了黃連木屬和柑橘屬之間的進(jìn)化差異，而不是開(kāi)心果從野外馴化的非常短期的進(jìn)化。因此，我們認(rèn)為上述基因的擴(kuò)展可能與野生黃連木中有機(jī)化合物的代謝有關(guān)。野生黃連木的植物化學(xué)篩選發(fā)現(xiàn)了許多植物化學(xué)物質(zhì)，如生物堿、黃酮、香豆素、甾醇、單寧、萜類(lèi)和倍半萜類(lèi)。
此外，豐富的術(shù)語(yǔ)“氧化還原過(guò)程”包含許多細(xì)胞色素P450基因，這些基因編碼參與多種功能復(fù)雜代謝途徑的蛋白質(zhì)，并在多個(gè)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，特別是在應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮作用。在187個(gè)細(xì)胞色素P450基因中，我們發(fā)現(xiàn)許多可能具有耐鹽功能。例如，透水性研究發(fā)現(xiàn)，CYP94家族基因表達(dá)水平的升高可減輕水稻的茉莉酸反應(yīng)，增強(qiáng)水稻的耐鹽性。在開(kāi)心果的這些擴(kuò)張基因家族中，有14個(gè)CYP94基因。大豆中，CYP82A3參與茉莉酸和乙烯信號(hào)通路，增強(qiáng)對(duì)鹽堿和干旱的抗性，開(kāi)心果擴(kuò)張基因家族中有20個(gè)CYP82基因成員。毛果楊CYP714A3的異位表達(dá)增強(qiáng)了水稻的耐鹽性，開(kāi)心果擴(kuò)張基因家族中有10個(gè)CYP714A基因。因此，一些細(xì)胞色素P450基因可能與開(kāi)心果的耐鹽性有關(guān)。
3.?RNA-seq揭示了開(kāi)心果鹽適應(yīng)的遺傳機(jī)制
進(jìn)一步研究開(kāi)心果的耐鹽性潛在遺傳機(jī)制，研究者進(jìn)行了鹽度實(shí)驗(yàn)。開(kāi)心果砧木（P.vera?L.cv.Ohadi）的葉和根在正常條件和鹽度條件下進(jìn)行RNA測(cè)序。使用Tophat-Cufflinks-Cuffdiff?pipeline，在鹽水條件下處理的植物與對(duì)照之間表現(xiàn)出差異表達(dá)，鑒定214和461蛋白質(zhì)編碼基因分別在葉和根組織中（ncontrol = 3, nsalinity = 3, corrected P < 0.05,）。基因富集分析發(fā)現(xiàn)許多差異表達(dá)基因（31個(gè)基因）參與到“氧化還原進(jìn)程”中（圖2a，b）。像比較基因組分析一樣，該類(lèi)別中的15個(gè)基因是細(xì)胞色素P450基因，特別是CYP74A（即AOS），其編碼細(xì)胞色素P450 CYP74基因家族的一個(gè)成員，其起到丙二烯氧化物合酶（AOS）的作用。這種酶催化茉莉酸酯合成中的第一步[即茉莉酸（JA）]。AOS中每千堿基外顯子的表達(dá)片段（FPKM）值在葉片中從對(duì)照中的近0增加到鹽水條件下的2163.75，在根中從對(duì)照中的1.87增加到鹽水處理的87.74。研究者還發(fā)現(xiàn)了7個(gè)差異表達(dá)的基因(ChiC, TT4, ILL6, MYB108, MYB6, PRB1, and TIFY5A)被富集到“茉莉酸反應(yīng)”中。以前的研究表明，干旱和高鹽度導(dǎo)致水稻葉片和根部JA含量增加。鹽度處理可以增加濕地物種鳶尾（Iris hexagona）中的內(nèi)源JA水平。茉莉酸酯激活植物對(duì)生物脅迫（即病原體攻擊）和非生物脅迫（即鹽）的反應(yīng)。在此，用鹽水處理增加了在葉和根中參與茉莉酸反應(yīng)的這些基因的表達(dá)水平（圖2c）。這些基因的表達(dá)增加（例如，AOS作為酶催化茉莉酸酯合成中的第一步）應(yīng)該增加茉莉酮酸酯的合成，因此，它們很可能被開(kāi)心果用于應(yīng)對(duì)鹽脅迫。
差異表達(dá)的基因富集到“幾丁質(zhì)結(jié)合”，其中四種基因編碼幾丁質(zhì)酶(CHIB, EP3, ChiC, AT2G43590)。植物幾丁質(zhì)酶涉及多種生物系統(tǒng)。植物中的一些幾丁質(zhì)酶是針對(duì)環(huán)境脅迫（如高鹽濃度，寒冷和干旱）而表達(dá)的，并且可以通過(guò)植物激素如乙烯，茉莉酸和水楊酸來(lái)上調(diào)。例如，基因ChiC編碼V類(lèi)幾丁質(zhì)酶，其表達(dá)可由茉莉酸和擬南芥鹽度引起的脅迫來(lái)誘導(dǎo)。研究者的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明，編碼幾丁質(zhì)酶的基因和參與JA生物合成途徑的基因可能有助于開(kāi)心果適應(yīng)鹽水環(huán)境。
?圖2 鹽處理下開(kāi)心果的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析
4.?不同野生種間混和
為了研究開(kāi)心果的種群歷史和適應(yīng)性進(jìn)化，研究者對(duì)107個(gè)開(kāi)心果基因組進(jìn)行重測(cè)序，包括93個(gè)品種和14個(gè)野生開(kāi)心果，平均測(cè)序深度為6-8X。作者還重新測(cè)序了來(lái)自不同近緣種的35個(gè)基因組，包括P.mutica，P.khinjuk，P.integerrima和P. palaestina。用stringent GATK pipeline，發(fā)現(xiàn)14.77百萬(wàn)個(gè)單基因變異位點(diǎn)，其中2.42百萬(wàn)個(gè)在基因區(qū)。使用鄰近法和最大似然法的系統(tǒng)發(fā)育分析清楚地分離了5種不同的種群，即?P.vera, P.mutica, P. khinjuk, P. integerrima, and P. palaestina。通過(guò)TreeMix程序在一些物種之間檢測(cè)到漸滲的信號(hào)，這表明雜交可能在自然界中的不同近親之間發(fā)生，并且與植物中被發(fā)現(xiàn)的普遍雜交一致。然而，從其他開(kāi)心果物種到馴化的開(kāi)心果沒(méi)有檢測(cè)到漸滲，這種現(xiàn)象來(lái)源于野生的P. vera（圖3）。
?圖3 不同野生種間的基因漸滲
5.?開(kāi)心果兩步馴化歷程
基于重測(cè)序數(shù)據(jù)，研究人員推測(cè)了這些物種的有效群體大小的變化，并發(fā)現(xiàn)在 Pleistocene期間發(fā)生了瓶頸事件，且在 ~200 kyr前，有效群體大小增加。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示馴化和野生開(kāi)心果之間的分離（圖4a）。利用δaδi推算野生和馴化開(kāi)心果的分化時(shí)間在 ~8000年前，這與早在公元前6750年就表明開(kāi)心果種子是一種常見(jiàn)的食物這一考古記錄相似。為了深入了解開(kāi)心果種質(zhì)之間的遺傳關(guān)系，研究人員進(jìn)行了兩項(xiàng)經(jīng)典分析：群體結(jié)構(gòu)和主成分分析（圖4b，c）。這些分析清晰的顯示栽培種質(zhì)分為兩個(gè)群。栽培種Group I的LD最高，栽培種Group II和野生開(kāi)心果的LD衰減值相近。Group II包括 Qazvini，Italiaei和Badami
Zarand在內(nèi)的5種類(lèi)型的個(gè)體，且這些種質(zhì)被記錄為古代具有種子的材料（圖4d）。與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)一致，這三個(gè)品種含有較高比例的野生血統(tǒng)（圖4e）,這些結(jié)果支持了其兩步馴化的過(guò)程，初步馴化，然后通過(guò)作物育種進(jìn)行改良。
圖4 野生和馴化開(kāi)心果的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析
6.?開(kāi)心果馴化的遺傳機(jī)制
群體核苷酸多態(tài)性θπ分析揭示了馴化型種質(zhì)的核苷酸多態(tài)性低于野生型種質(zhì)，通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，栽培種質(zhì)中基因組上的一些區(qū)域的多態(tài)性降低，這些區(qū)域可能含有受到人工選擇的基因。此外，研究人員鑒定了栽培型和野生型樣品分化水平增加的區(qū)域。在馴化和野生的開(kāi)心果之間，在基因組上約有9.2 Mb的區(qū)域被鑒定為具有高水平的群體分化。栽培種間遺傳多樣性降低，且超過(guò)95%的閾值。遺傳多樣性減少的區(qū)域和群體分化增強(qiáng)的區(qū)域在馴化或育種過(guò)程中經(jīng)歷了選擇性清除。共計(jì)有665個(gè)基因定位在該區(qū)域。研究人員定位了受正向選擇的候選基因，其可能與馴化過(guò)程中重要的表型進(jìn)化相關(guān)。在開(kāi)心果馴化的過(guò)程中，其樹(shù)形大小經(jīng)歷了人工選擇（圖5a）。研究人員發(fā)現(xiàn)了基因SAUR55（圖5b），編碼生長(zhǎng)素應(yīng)激蛋白，在植物的生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，其在開(kāi)心果的人工選擇下進(jìn)化而來(lái)。除此之外，基于也和根的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，馴化種與野生種相比，基因SAUR55表現(xiàn)出了顯著增加的表達(dá)水平（圖5c）。這些結(jié)果與在其它作物（如水稻和小麥）中生長(zhǎng)素應(yīng)激性基因的選擇性清除的研究結(jié)果一致，并揭示了在作物馴化期間類(lèi)似特征性狀的人工選擇。果實(shí)重量是作物馴化和育種期間最重要的特征之一，包括開(kāi)心果。在栽培種中，品種成分與果實(shí)重量呈正相關(guān)（圖4e）。這支持了一個(gè)結(jié)論，在開(kāi)心果中，果實(shí)重量的人工選擇發(fā)生在馴化與人工選擇期間。研究人員指出，基因CYCD7-1在人工選擇的進(jìn)化下，野生種和馴化的栽培種之間具有高度的群體分化特征。該基因編碼D型細(xì)胞周期蛋白，控制細(xì)胞分裂及種子發(fā)育過(guò)程中的生長(zhǎng)率。CYCD7-1基因的過(guò)表達(dá)包括在胚胎和胚乳中的細(xì)胞增殖和細(xì)胞增大，其在擬南芥中導(dǎo)致種子過(guò)度生長(zhǎng)?；?em>CYCD7-1在花粉和早期發(fā)育中顯示特殊表達(dá)，但在葉和根中沒(méi)有表達(dá)。因此，有希望在未來(lái)的實(shí)驗(yàn)中比較野生型和馴化型開(kāi)心果在花粉和早起發(fā)育時(shí)期CYCD7-1基因的表達(dá)，研究人員提出在CYCD7-1基因上進(jìn)行的人工選擇可能會(huì)改變開(kāi)心果的重量。
?圖5 開(kāi)心果果樹(shù)大小的人工選擇
結(jié)論
本研究為開(kāi)心果的局部適應(yīng)和馴化提供了遺傳學(xué)基礎(chǔ)。黃連木屬物種基因組序列有助于未來(lái)的研究，以了解沙漠作物農(nóng)藝和環(huán)境相關(guān)性狀的遺傳基礎(chǔ)。
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