RRBS測序輔助同卵雙胞胎EWAS-BMI關(guān)聯(lián)研究及肥胖表觀遺傳機(jī)制研究【成功案例】

2019年5月，青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)者發(fā)表了有關(guān)同卵雙胞胎肥胖表觀調(diào)控的研究，該研究中簡化甲基化測序由百邁客生物科技有限公司完成，詳情如下。

英文題目：DNA methylome profiling in identical twin pairs discordant for body mass index

發(fā)表雜志：International Journal of Obesity

影響因子：5.151

合作單位：青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院

【研究背景】

糖尿病和心血管疾病是發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家的常見病癥，對生活質(zhì)量和死亡率有很大影響。這些病癥通常與肥胖有關(guān)，其體重指數(shù)（BMI）是一個(gè)重要的衡量指標(biāo)。以體重除以身高的平方來計(jì)算的體重指數(shù)（BMI，kg/m²）是體重和肥胖的簡單指標(biāo)。BMI已經(jīng)被廣泛使用，傳統(tǒng)的流行病學(xué)研究揭示其與環(huán)境因素的關(guān)聯(lián)，包括職業(yè)、收入和許多其他因素。重要的是，雙胞胎研究高遺傳率預(yù)計(jì)高達(dá)90％，表明遺傳因素對BMI變異的貢獻(xiàn)很大。

在過去的十年中，全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）發(fā)現(xiàn)了常見的遺傳多態(tài)性與復(fù)雜疾病和健康特征（包括BMI）相關(guān)的罕見遺傳變異。但是，與預(yù)估的高遺傳率（40-70％）相比，報(bào)道的遺傳多態(tài)性僅解釋了有限比例的BMI變異（2-21％）。已經(jīng)使用DNA甲基化分析進(jìn)行了大規(guī)模表觀基因組關(guān)聯(lián)研究（EWAS），但是僅報(bào)道了少數(shù)顯著的基因組位點(diǎn)。有限的發(fā)現(xiàn)可能是由于部分控制不良的混雜因素，包括遺傳和環(huán)境因素。由于同卵雙胞胎（MZ）共享基因組成，MZ雙胞胎對于疾病或性狀不一致，可作為高度遺傳性疾病或表型EWAS研究的理想樣本。作者基于計(jì)算機(jī)模擬研究表明，EWAS中不一致的雙胞胎研究具有高度豐富的統(tǒng)計(jì)檢力，特別是對具有高遺傳基礎(chǔ)的疾病。作者采用RRBS（簡化甲基化）測序?qū)?0對BMI不同的同卵雙胞胎進(jìn)行了EWAS研究，討論了肥胖潛在病因。

【研究方法】

• 樣本選擇：30對同卵雙胞胎，包括15對男性和15對女性，無藥物治療，無診斷疾病（如癌癥，心血管疾病，2型糖尿病，精神疾病等），年齡39-72，BMI18.9-37.7。收集全血樣本。
• 測序技術(shù)：簡化甲基化測序（RRBS）。
• 驗(yàn)證：Mid-aged Danish Twin (MADT) cohort ?229對樣本表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行基因驗(yàn)證。

【研究結(jié)果】

1、樣本情況

表1展示了樣本相關(guān)人體測量和生化變量的結(jié)果。最后一列是每個(gè)變量的對內(nèi)相關(guān)性。大多數(shù)變量具有相當(dāng)高的和/或顯著相關(guān)性，一些顯示低或不顯著的對內(nèi)相關(guān)性（例如GLU，TG）。下圖顯示了每對雙胞胎的BMI測量值。所有雙胞胎都與對角線保持距離，表明BMI測量中的對內(nèi)不一致。同時(shí)，圖中的總體模式還表明如表1中報(bào)告的BMI的弱配對內(nèi)相關(guān)性（r = 0.307，p = 0.099）。在男性（實(shí)點(diǎn)）和女性（空點(diǎn)）雙胞胎中沒有觀察到BMI不一致的性別特異性模式。

2、單個(gè)位點(diǎn)EWAS關(guān)聯(lián)分析

基于單個(gè)位點(diǎn)的EWAS分析，鑒定出136個(gè)CpG（p <1e-04），其中30個(gè)CpG（p <1e-05），2個(gè)CpG（p <1e-06）。 沒有位點(diǎn)達(dá)到全基因組顯著性（定義為FDR <0.05），最低FDR = 0.195。 圖中顯示了每個(gè)CpG位點(diǎn)的p值與其染色體位置的曼哈頓圖（圖a）和針對隨機(jī)預(yù)期p值分布繪制的預(yù)估p值的Q-Q圖（圖b）。最顯著CpG?p值表明與隨機(jī)分布的偏差及其陰影區(qū)域的95％置信區(qū)間（圖b），說明這些CpG與BMI的非隨機(jī)關(guān)聯(lián)。

3、生物學(xué)通路分析

采用biomaRt，38487個(gè)CpG中（P<0.05），23,863個(gè)CpG注釋到2542個(gè)功能基因，基于GSEA在BioCarta 基因集, KEGG 基因集和Reactome基因集富集分析。富集通路相關(guān)基因包括參與編碼細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）相關(guān)蛋白，包括ECM糖蛋白、膠原蛋白和蛋白多糖；以及參與神經(jīng)元系統(tǒng)和發(fā)育生物學(xué)的基因。富集結(jié)果也涉及神經(jīng)元功能通路，涉及參與化學(xué)突觸傳遞，軸突導(dǎo)向和NGF信號傳導(dǎo)（神經(jīng)生長因子）的基因。38,487（p < 0.05）個(gè)CpGs采用GREAT分析其富集的調(diào)控區(qū)域。結(jié)果表明15個(gè)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p < 1.072e-10）的生物學(xué)功能聚類，涉及膠質(zhì)細(xì)胞再生正負(fù)調(diào)節(jié)（FE:2.49， FE:2.03）、脂質(zhì)合成負(fù)調(diào)節(jié)（ FE:2.61）、甲狀腺發(fā)育 （FE:2.83）、視網(wǎng)膜桿細(xì)胞發(fā)育（FE: 3.54）等。

4、基因組區(qū)域注釋及利用MADT表達(dá)數(shù)據(jù)驗(yàn)證

采用comb-p矯正p，鑒定出11個(gè)FDR<0.1的DMR，其中9個(gè)FDR<0.05，位于染色體1、2、3、5、6、9、10和18 。4個(gè)有意義的 DMRs (從chr 1:1103393-1103564，chr 1:990300-990641；chr 6:1594287-1594438；?chr 10:102026134-102026689 )包含了有顯著意義的CpGs 。4個(gè)DMR位于基因間區(qū)，其余7個(gè)注釋在9號染色體LINC01503（RNA基因）、5號染色體DPYSL3（與非酒精性脂肪肝相關(guān)）, 1號染色體CHD5和AGRN（有研究孕婦體重指數(shù)對新生兒血液DNA甲基化的影響）, 2號染色體C1QL2, 10號染色體CWF19L1, 及6號染色體 AKAP12。圖中展示了11個(gè)DMR的甲基化模式，除了圖f和j的DMR與BMI呈負(fù)相關(guān)外，其余9個(gè)DMR與BMI呈正相關(guān)。采用Danish雙胞胎的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，檢驗(yàn)了與11個(gè)DMR相關(guān)的7個(gè)基因表達(dá)水平與BMI的相關(guān)性。LINC01503和AKAP12有顯著意義。

【小結(jié)】

雖然單CpG位點(diǎn)EWAS沒有鑒定出顯著性位點(diǎn)，但是功能富集分析結(jié)果表明了一些有意義的基因。比如由于BMI不一致引起的DNA甲基化改變可能與發(fā)育相關(guān)，可能涉及早期事件如低出生體重。10條富集的通路都與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)有關(guān)，在細(xì)胞外基質(zhì)中，脂肪組織中的過量沉積會惡化胰島素敏感性。DMR相關(guān)基因也有報(bào)道與肝臟脂肪沉積相關(guān)。未有顯著性位點(diǎn)結(jié)果與樣本量較少及BMI高遺傳判斷也有關(guān)系。同時(shí)研究結(jié)果也表明，基于BMI不一致的雙胞胎樣本研究表觀遺傳學(xué)，可能會高度重視早期生活事件對成年BMI的表觀遺傳學(xué)影響，需謹(jǐn)慎將調(diào)查結(jié)果推廣到非雙胞胎人群。

參考文獻(xiàn)

Li W, Zhang D ,Wang W, et al. DNA methylome profiling in identical twin pairs discordant for body mass index. International Journal of Obesity, 2019.