Nanopore全長轉錄組測序繪制癌細胞系LARP1 isoform表達譜

研究背景

La相關蛋白（La-related proteins，LARP）是與癌癥相關的RNA結合蛋白（由LARP 1、1B、3、4A、4B、6和7組成）的進化保守家族。LARP1具有致癌性，且腫瘤組織較高水平的LARP1蛋白與卵巢癌、大腸癌和前列腺癌的不良預后相關。LARP1 包含兩個 RNA 結合域，一個保守的La module，由La domain 和一個臨近的RNA 識別基序 (RNA recognition motif，RRM) 組成的RNA結合域，和一個C端“ DM15結構域”。LARP1與poly-A結合蛋白（poly-A binding protein，PABP）形成復合物，與超過3000個mRNA結合，包括5?TOP-motif轉錄本，已知此類轉錄本可編碼核糖體機器。據(jù)估計，人類基因組僅包含19,000–21,000個蛋白質編碼基因，但合成了70,000多種蛋白質，這可以通過pre-mRNA的選擇性剪接/可變剪接加工產生多個成熟的mRNA轉錄產本來解釋。因此，每個基因具有編碼多種蛋白質同工型(isoform)的潛力，這種機制增加了蛋白質組的復雜性。然而，基因通常僅主要表達一種蛋白質，表明加工并釋放到細胞質中的mRNA經(jīng)過選擇或“審查”過程。

使用LARP1各個區(qū)域的抗體進行的蛋白質印跡WB實驗產生了大約150/130kDa的雙鏈帶，這被解釋為代表了2種LARP1亞型。為了探索這一點，作者系統(tǒng)地進行了一系列計算機、轉錄組、生化和細胞分析，以闡明LARP1在癌癥和正常細胞中的真實表達情況。

技術方法

1、公共polyA方式建庫轉錄組數(shù)據(jù)集分析LARP1 isoform表達譜：測序數(shù)據(jù)特異比對到長LARP1同工型的外顯子1，沒有reads比對到SI-LARP1的外顯子1；

2、Nanopore全長轉錄組測序（RNA-direct）繪制LARP家族基因isoform landscape：2種細胞系，人HEK-293 T和OVCAR-8；每個樣本約1.7-2Mb 長reads，約2G數(shù)據(jù)量；LARP3表達最高，LI-LARP1被鑒定為主要表達的LARP1亞型；

3、特異性引物擴增及sanger測序驗證SI-LARP1和LI-LARP1 isoform表達情況：501-MEL(黑色素瘤細胞系)和OVCAR-8細胞中只表達LI-LARP1；

4、NCI-60幾種癌細胞系隨機引物及oligo dT反轉錄qPCR驗證SI-LARP1和LI-LARP1 isoform表達：長LARP1 isoform（LI-LARP1）在廣泛的癌癥和正常細胞中是主要表達的形式，而SI-LARP1 mRNA（如果表達的話）以低水平和不成熟的形式存在。

5、isoform特異性多肽檢測：凝膠遷移實驗觀察2種isoform與內源性LARP1遷移模式；體外過表達及pull down實驗鑒定2種isoform特異性多肽；免疫沉淀-質譜分析內源性LARP1中2種isoform特異性多肽占比；

6、短isoform表達抑制的調控機制分析：公共數(shù)據(jù)庫中DNA甲基化數(shù)據(jù)以及H3K27ac chip-seq數(shù)據(jù)分析可能的表觀調控機制；DNA甲基化酶抑制劑5-氮胞苷處理檢測SI-LARP1 mRNA和蛋白表達；siRNA特異性敲除2種isoform分析各自表達改變對于細胞活性和凋亡的影響；pull down實驗分析與PABP（poly A結合蛋白）的結合互作；TSS區(qū)保守性分析2種isoform可能的功能差異；

研究結果

1、LARP1在癌細胞中的isoform landscape

圖1A為NCBI基因數(shù)據(jù)庫中列出的9種不同的LARP1經(jīng)驗證的isoform。LARP1典型轉錄本為NM_015315.5，編碼1019個氨基酸（NP_056130.2）的蛋白質，在此處稱為“ SI-LARP1”。UniProtKB數(shù)據(jù)庫引用了另一個比較長的轉錄本NM_033551.3作為LARP1的規(guī)范形式，它對應于1096個氨基酸蛋白（NP_291029.2），在此稱為“LI-LARP1” 。SI-LARP1蛋白與LI-LARP1不同，它缺少前77個氨基酸，并且氨基酸M1至N67不同。

圖1

二代短reads polyA轉錄組公共數(shù)據(jù)分析：為了研究LARP1在細胞中的表達譜，作者使用了可公開獲得的RNA測序數(shù)據(jù)集。共計從198個組織、128個細胞系和54個原代細胞系中提取了371個包含poly-(A)的RNA測序數(shù)據(jù)集，并將其reads與包含所有預測的LARP1 isoform的hg38：Chr5 154700000至154850000染色體區(qū)域比對(圖2A)。首先關注測序reads與第一個外顯子的比對，兩個LARP1亞型不同的區(qū)域。發(fā)現(xiàn)測序數(shù)據(jù)特異比對到長LARP1同工型的外顯子1，沒有reads比對到SI-LARP1的外顯子1。2個isoform間共享的第2-19號外顯子已完全被測序數(shù)據(jù)所覆蓋。

圖2A

Nanopore全長轉錄組測序：為了進一步了解LARP1 isoform的表達，在HEK-293 T和OVCAR-8細胞(永生化的人類胚胎腎細胞和卵巢癌細胞系)中分別進行了牛津納米孔測序技術（ONT全長轉錄組測序）(圖2B-D)。這種RNA直接測序技術可以檢測長讀長轉錄本isoform，并可以無PCR偏倚地定量轉錄本豐度。與人類基因組（Hg38）比對，并使用IGV可視化。在HEK-293T細胞中，檢測到總共2,038,842個轉錄本，而在OVCAR-8細胞的樣品中僅檢測到1,834,870個轉錄本。(根據(jù)百邁客的項目經(jīng)驗大概每個樣本2G多的數(shù)據(jù)量)作者對所有比對到7個LARP家族成員的轉錄本進行表達定量，校正各樣本數(shù)據(jù)量差異將其標準化為TPM(transcripts per million，每百萬轉錄本)（圖2B）。在LARP家族成員中，LARP3的轉錄本表達量最高(TPM=194)。相反，其他LARPs的表達值TPM遠低于50，其中LARP1B和LARP4B的表達最低。且與前人研究一致，致癌性LARP1在OVCAR-8癌細胞(TPM 52)中的表達水平高于HEK-293 T細胞(TPM 38)中的表達水平。為了分析LARP1 sioform在這些細胞中的表達，作者使用Sashima圖（圖2C）可視化剪接位點。使用這種RNA直接測序的nanopore全長轉錄組方法，在2個測試的細胞系中均未檢測到SI-LARP1。盡管LARPs的表達水平低于其他基因，例如GAPDH（在OVCAR-8細胞中TPM高達6396），因此LI-LARP1被鑒定為主要表達的LARP1亞型。作者還觀察到5′截短的LARP1轉錄本積累，LARP1B的3種isoform共表達（NM-018078，NM_178043，NM-032239），LARP6的2種isoform共表達（NM_197958，NM_018357）（圖2D）。對于其他LARP，能夠確認ONT測序檢測到的主要轉錄本與經(jīng)典isoform相對應。

圖2 B-D

特異性引物擴增及sanger測序驗證實驗：為了驗證ONT全長轉錄組測序發(fā)現(xiàn)的LI-LARP1是主要isoform，作者設計了2對特異性引物，以通過PCR檢測短或長LARP1 isoform或2種總和（使用保守的exon 7上的引物，此處稱為“總LARP1”）（圖3）。設計對應于每個LARP1 isoform外顯子1的正向引物和下游外顯子的外顯子連接處的反向引物。這些引物有效性通過重組SI-LARP1或LI-LARP1表達后的成功擴增得到證實。設計用于檢測總LARP1的引物，以在所有預測的isoform共有的第7外顯子上退火。結果發(fā)現(xiàn)LI-LARP1在501-MEL(黑色素瘤細胞系)和OVCAR-8細胞中表達，但未檢測到SI-LARP1的PCR擴增產物（圖3A）。對所有PCR產物進行測序以驗證所需的擴增子。接下來，設計了對長LARP1 isoform(LI-LARP1)的開放閱讀框具有特異性的引物，并通過cDNA文庫中的PCR進行了擴增，PCR產物的sanger測序結果揭示了LI-LARP1預測的完整核苷酸序列，包括其特定的外顯子1（圖3B）。值得注意的是，所有試圖擴增SI LARP1 isoform編碼序列的嘗試均告以失敗，表明該isoform在得到的cDNA文庫中不存在。

圖3上 S1 / S2和L1 / L2分別代表檢測SI-LARP1或LI-LARP1的引物對。T代表使用組成性表達的外顯子7退火的引物對檢測到的總RNA。HK代表管家基因OAZ1。

2、長LARP1 isoform在NCI-60癌癥細胞系中占主導地位

為了確定LI-LARP1是否在更廣泛的癌細胞系中表達，作者用qRT-PCR檢測了NCI-60癌細胞系(美國國立癌癥研究(NCI)規(guī)定的60種用于藥物篩選的癌細胞系，包括黑素瘤、腎癌、卵巢癌、腦癌、白血球增多癥、乳腺癌、非小細胞肺癌和前列腺癌細胞系)（圖3C）。盡管樣品之間LI-LARP1的表達差異高達37倍，但在所有細胞系中均可檢測到。然而，所有系中SI-LARP1表達均低于檢測閾值（cT值<35）。并測量NCI的5種癌細胞系（MCF-7、OVCAR-8、SK-OV-3、501-MEL和HEK-293T）中的SI和LI-LARP1表達驗證了這些發(fā)現(xiàn)（圖3D）。在所有五個細胞系中，LI LARP1的水平至少比SI-LARP1高1000倍。由于SI-LARP1的表達水平接近或低于檢測極限，因此作者探討了其余檢測到的轉錄本是否為人工產物。成熟的mRNA的標志是存在3?poly-（A）尾，這是其核輸出所必需的。從OVCAR-8、SK-OV-3、501-MEL和HEK-293T中提取的總RNA使用隨機或寡聚（dT）引物進行反轉錄（圖3E）。隨著隨機引物與RNA庫中任何類型的轉錄本退火，PCR擴增還將檢測未加工完成的mRNA種類。相反，寡聚（dT）引物導致多聚腺苷酸化(帶polyA)的mRNA發(fā)生特定的逆轉錄。使用基因特異性引物測量2個cDNA文庫中SI-和LI-LARP1 isoform的水平。將表達水平使用管家基因OAZ1標準化，計算相對表達量。作者發(fā)現(xiàn)完全加工和多聚腺苷酸化的SI-LARP1 mRNA的水平低于檢測極限，表明SI-LARP1 mRNA表達但未完全加工成成熟的聚腺苷酸化的mRNA。

圖3下? C中每根柱子上深灰色代表SI-LARP1，其他顏色代表LI-LARP1。

總之，長LARP1 isoform（LI-LARP1）在廣泛的癌癥和正常細胞中是主要表達的形式，而SI-LARP1 mRNA（如果表達的話）以低水平和不成熟的形式存在。

3、在4種不同的人類細胞系中鑒定長isoform特異性多肽

如前所述，SI-和LI-LARP1具有由不同外顯子1序列編碼的獨特N末端（圖4A）。2個外顯子均在框內終止，因此外顯子選擇不影響LARP1的下游閱讀框和氨基酸組成。較長的isoform多了77個氨基酸長的多肽鏈，并導致預測的蛋白質比短isoform大8.4 kDa。當2種形式都被外源表達時，在SDS凝膠電泳時僅觀察到遷移模式的微小差異（圖4B）。比較外源表達的SI-LARP1和LI-LARP1與內源性LARP1的凝膠遷移模式，發(fā)現(xiàn)內源性LARP1與LI-LARP1共遷移，表明LI-LARP1的蛋白質產物占主導地位。

圖4 A-B

為了驗證這一點，首先，在OVCAR-8細胞中異位表達了2種LARP1 isoform，并使用針對共表達的Xpress標簽的抗體從粗蛋白裂解物中免疫沉淀富集LARP1蛋白（圖4C）–pull down實驗。隨后，使用胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶對樣品進行溶液消化后，Shotgun LC MS/MS質譜分析以鑒定對應于SI-或LI-LARP1 isoform的N端特異性肽段。鑒定了從序列位置45和46產生的3種肽（質量為N46SVALAAAPR：485.2773 Th（m/z）; K45NpSVALAAAPR：549.3257 Th（m/z）; K45NSAVALAAAPR：589,3085 Th（m/z ））作為SI-LARP1的唯一特征（圖4D）。相反，對于LI-LARP1，鑒定了由與外顯子1對應的蛋白質序列產生的152個肽。第二步，免疫沉淀富集OVCAR-8、501-MEL、SK-OV-3和HEK-293T細胞的內源LARP1，并進行質譜分析，使用監(jiān)督自動算法檢測預先指定的isofrom特異性肽（圖4E-F）。LARP1的肽覆蓋率范圍為內源性免疫沉淀蛋白的24-44％。盡管在所有4個細胞系中都鑒定出了與LI-LARP1 N端相對應的獨特肽，但我們無法在任何樣品中鑒定出對SI-LARP1亞型具有特異性的任何肽。這些結果與觀察到的不存在對應于SI-LARP1的mRNA相一致。

圖4 C-F

4、短isoform啟動子區(qū)被高甲基化而啟動子活性被抑制

接下來，作者研究了調節(jié)SI-LARP1表達的機制。轉錄活性與染色質狀態(tài)相關，其特征在于組蛋白修飾、開放染色質和特異性轉錄因子結合。因此，作者使用了3個公開可用的數(shù)據(jù)集來預測短和長LARP1 isoform的啟動子活性（圖5A）。SI-LARP1的預測轉錄起始位點TSS位于GRCh38.p13：154,712,843，而LI-LARP1的TSS處于SI-LARP1的第一個內含子內，位置為GRCh38.p13：154,755,377?；?個參數(shù)來判斷轉錄活性：首先，使用ChIP-seq數(shù)據(jù)來識別H3K27ac標記，該標記代表H3組蛋白的賴氨酸27的乙?；?，從而導致轉錄增強；其次，使用來自人類甲基化芯片的數(shù)據(jù)來鑒定CpG甲基化，其與基因沉默相關，反之，它們的去甲基化激活基因表達；第三，使用多變量隱馬爾可夫模型（HMM）整合ChIP-seq數(shù)據(jù)，預測了9種人類細胞系的區(qū)段化染色質狀態(tài)。所有數(shù)據(jù)均與GRCh37/hg19進行比對，并使用UCSC基因組瀏覽器進行分析（圖5A）。作者發(fā)現(xiàn)SI LARP1 TSS區(qū)的CpG甲基化水平較高，但H3K27AC標記較低，表明啟動子活性降低。相反，LI-LARP1 TSS區(qū)的CpG甲基化水平較低，而H3K27AC標記較高，表明存在一個活躍的啟動子位點。對于SI-LARP1而言，在人類胚胎干細胞中觀察到啟動子活性的唯一顯著增加?？傮w而言，LI-LARP1的啟動子區(qū)域處于開放的染色質狀態(tài)，這表明該區(qū)域具有較高的啟動子活性，而SI-LARP的啟動子受到表觀遺傳抑制。

圖5 A-B

為證實CpG甲基化對SI-LARP1啟動子的抑制作用，使用5-氮胞苷(5-Aza，胞苷的化學類似物，DNA甲基轉移酶抑制劑)通過去甲基化來重新激活其表達（圖5B）。為此，將SK-OV-3、OVCAR-8、501-MEL和HEK-293T細胞用濃度遞增的5-Aza處理3天或5天。為了確認SI-LARP1表達的重新激活，定量PCR測量了處理過的細胞和對照細胞中SI-LARP1 mRNA的水平（圖5B），并觀察到3天后SI-LARP1的濃度依賴性增加了5倍。使用最佳濃度并延長孵育時間至5天時，發(fā)現(xiàn)OVCAR-8中的SI-LARP1 mRNA增加了20倍。但是，蛋白質印跡法沒有檢測到任何與SI-LARP1相對應的蛋白質。值得注意的是，沒有觀察到LI-LARP1 mRNA和蛋白質表達的顯著增加。這些數(shù)據(jù)表明，SI-LARP1的表達在某種程度上受到表觀遺傳調控。但是，即使在表觀遺傳學上解除抑制，SI-LARP1也不會通過細胞質翻譯機制合成為蛋白質。

接下來，作者探討了LI-LARP1的表達模式是否與SI-LARP1和內源性LARP1的表達模式相似。Hopkins等人的先前工作表明，在OVCAR-8和SK-OV-3細胞中使用能夠同時靶向SI-LARP1和LI-LARP1的siRNA瞬時敲低LARP1與細胞活力降低和凋亡增加有關。為了驗證該觀察結果可歸因于LI-LARP1，設計了2種siRNA：靶向LI-LARP1 mRNA獨特的外顯子1或2種isoform普遍存在的外顯子13。與對照scramble siRNA處理的OVCAR-8細胞相比，2種siRNA均導致細胞活力降低。使用針對外顯子13的siRNA可以成功消除了LARP1蛋白質印跡雙鏈體中較低的蛋白帶（其大小約為130 kDa），這表明該條帶對應于LARP1的未知的N端截短的變體。

此外，已充分確定的是，LARP1與PABP（poly A結合蛋白）相互作用，使靶mRNA的5’和3’UTR緊密相鄰。為了證明LI-LARP1可與PABP互作，作者對內源性和異位表達的LARP1進行pull down實驗，發(fā)現(xiàn)SI-LARP1和LI-LARP1都能夠結合PABP。

圖5 C

接下來，作者對SI-LARP1是否可以發(fā)揮獨特的功能作用感興趣。為此分析了2種LARP1亞型的TSS區(qū)保守水平（圖5C）。作者假設，進化保守將暗示選擇性壓力，因此每種亞型的作用不同。為了解釋LARP1亞型的進化保守性，使用UCSC基因組瀏覽器在脊椎動物（鳥類、魚類、兩棲動物、爬行動物、哺乳動物）亞門上生成了100個可用LARP1序列的多序列比對。出乎意料的是，LI-LARP1外顯子1在整個亞科中都具有很強的保守性，但SI-LARP1外顯子1的保守性僅存在于胎盤動物分支中，其中包括人類和其他靈長類動物。這表明它可能在胎盤哺乳動物的進化晚期獲得了功能性作用。相比之下，LI-LARP1的保守性跨多個進化分支表明作用更為古老。

小結

作者先前發(fā)表的研究預測了LARP1的10個潛在替代啟動子，并且與大多數(shù)編碼基因具有多種isoform但只有一種表達的蛋白的證據(jù)相符。盡管表達的isoform的進化保守表明其具有保守的生物學功能，但未表達的isoform的作用仍存在爭議。盡管有些人假設它們是轉錄噪聲，但另一些人則認為需要它們調節(jié)蛋白質功能、相互作用或定位或生成進化試驗場允許功能和結構域進化的。確實，本研究表明SI-LARP1的外顯子1在胎盤哺乳動物小分支中是高度保守的，這表明它提供了不同于LI-LARP1的功能性和進化優(yōu)勢。此外，僅在人類胚胎干細胞中檢測到SI-LARP1 mRNA可能表明在胚胎發(fā)育中起作用。SI-LARP1和亞細胞定位的確切作用需要在未來的研究中解決。

參考文獻

Schwenzer H, Abdel Mouti M, Neubert P, et al. LARP1 isoform expression in human cancer cell lines [published online ahead of print, 2020 Apr 14]. RNA Biol. 2020;1‐11. doi:10.1080/15476286.2020.1744320