隨著分子生物學(xué)的興起和向各方面的滲透，生物科學(xué)的各分支學(xué)科也經(jīng)歷著興衰更替的變化。從目前的發(fā)展?fàn)顩r來看，在基因組研究中，利用常規(guī)研究技術(shù)及單一組學(xué)研究方法在沖擊文章的過程中，對于技術(shù)的新穎性及物種生物學(xué)問題挖掘的深入性還是有所欠缺的，因此在組學(xué)整合的前提下，可嘗試引用*新分子生物學(xué)研究技術(shù)，以為沖擊高分文章“添磚加瓦”。如下小編就通過一些文章案例為大家進(jìn)一步介紹下在破譯某物種基因組密碼的基礎(chǔ)上，怎樣利用新興生物學(xué)研究技術(shù)，如基因編輯，單細(xì)胞測序技術(shù)及表觀遺傳學(xué)研究等對某物種生物學(xué)性狀進(jìn)行深度挖掘。
01 基因編輯（CRISPR/Cas9）
基因編輯（gene editing），又稱基因組編輯（genome editing）或基因組工程（genome engineering），是一種新興的相對√確的對某生物體基因組特定目標(biāo)基因進(jìn)行修飾的一種基因工程技術(shù)。其中CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，則是對靶向基因進(jìn)行特定DNA修飾的技術(shù)，也是用于基因編輯中前沿的方法。以CRISPR-Cas9基礎(chǔ)的基因編輯技術(shù)在一系列基因治療的應(yīng)用領(lǐng)域都展現(xiàn)出極大的應(yīng)用前景，而在動(dòng)植物研究中也初露鋒芒。
CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)原理圖
技術(shù)應(yīng)用：基因組De novo(PacBio CCS+ONT+ALLHiC）+?CRISPR-Cas9基因編輯
文中在對同源四倍體紫花苜蓿（Medicago sativa?L.）基因研究中，首先利用了70 GB，~22x PacBio CCS數(shù)據(jù)進(jìn)行基因組組裝，組裝獲得紫花苜?；蚪M大小3154 Mb，Contig N50=459 kb, 然后利用ALLHiC進(jìn)行同源染色體組群的劃分，最后通過Hi-C互作熱圖、遺傳圖譜共線性、ONT數(shù)據(jù)回比、BUSCO完整性、轉(zhuǎn)錄組對基因組完整性等進(jìn)行評估。同源四倍體紫花苜?；蚪M的破譯對這一重要牧草后續(xù)的分子生物學(xué)研究具有重要意義。
圖1 ?紫花苜?；蚪Mcircos圖
圖2 紫花苜蓿Hi-C互作熱圖
進(jìn)一步利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)對紫花苜蓿(Medicago sativa L.)中PDS基因（八氫番茄紅素合酶基因）和PALM1基因（編碼Cys(2)His(2) zinc finger transcription factor鋅指轉(zhuǎn)錄因子；在二倍體蒺藜苜蓿M. truncatula中，其對復(fù)合葉形態(tài)發(fā)生具有重要作用）進(jìn)行改造，進(jìn)一步確定不同單倍型變異對紫花苜蓿白化和矮化及葉復(fù)合形態(tài)表型性狀的影響。
圖3 CRISPR/Cas9介導(dǎo)的紫花苜?；蚓庉嬔芯?/h5>
圖4 紫花苜蓿MsPALM1的基因編輯研究
文章中利用了基因組三代測序技術(shù)，獲得染色體級別的紫花苜?；蚪M的同時(shí)，攻克了同源多倍體物種基因組組裝難題，組裝獲得了4個(gè)單倍型紫花苜?；蚪M，為后續(xù)基因編輯研究做了重要的鋪墊，進(jìn)而通過新技術(shù)CRISPR/Cas9基因編輯對控制相應(yīng)表型性狀基因進(jìn)行改造，對于紫花苜蓿后續(xù)分子生物學(xué)研究具有重要而深遠(yuǎn)的意義。
02單細(xì)胞測序技術(shù)（10x Genomics）
單細(xì)胞測序，簡而言之，就是獲取單個(gè)細(xì)胞遺傳信息的測序技術(shù)，其中10 X Genomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序平臺具有廣泛的應(yīng)用。該技術(shù)利用微流控、油滴包裹和barcode標(biāo)記等技術(shù)來實(shí)現(xiàn)高通量的細(xì)胞捕獲技術(shù)，能夠一次性分離、并標(biāo)記500–10000個(gè)單細(xì)胞，從而獲得每個(gè)細(xì)胞的3’端的轉(zhuǎn)錄組信息。主要用于細(xì)胞分型和標(biāo)記因子的鑒定，從而實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞群體的劃分與細(xì)胞群體間基因表達(dá)差異的檢測，此外該技術(shù)還可以預(yù)測細(xì)胞分化與研究發(fā)育軌跡，在當(dāng)下疾病、免疫、腫瘤領(lǐng)域以及組織、器官、動(dòng)植物發(fā)育研究中發(fā)揮越來越重要的作用。
10x Genomics技術(shù)工作原理圖
技術(shù)應(yīng)用：基因組De novo(PacBio +Hi-C）+10xGenomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序
文中首先利用三代利用~80×PacBio RS+~100×Hi-C輔助組裝等策略測序并拼裝了準(zhǔn)染色體水平的高質(zhì)量安德愛勝蚓基因組，組裝獲得基因組大小1.3 Gb（Scaffold N50≈111Mb），基因組完整性92.1%(BUSCO)，鑒定了31,817個(gè)蛋白編碼基因，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，蚯蚓基因組中重復(fù)序列LINE2轉(zhuǎn)座元件可能在蚯蚓再生中扮演重要調(diào)控角色。
圖 5 蚯蚓基因組組裝
進(jìn)一步利用10xGenomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序深度解析蚯蚓再生機(jī)制，蚯蚓再生早期72小時(shí)后損傷愈合部位細(xì)胞的高比例組分是干細(xì)胞，且多能干細(xì)胞在蚯蚓再生早期過程中具有重要作用。此項(xiàng)研究提供了一些蚯蚓再生的候選分子細(xì)胞學(xué)機(jī)制。
圖6?蚯蚓再生過程表型組分析
圖7?蚯蚓再生過程單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究
文章中利用了三代測序技術(shù)及Hi-C輔助基因組組裝技術(shù)，獲得染色體級別的蚯蚓基因組，基因組組裝連續(xù)性一般，但結(jié)合基因組序列信息及單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究解析了土壤生態(tài)系統(tǒng)重要成員無脊椎動(dòng)物蚯蚓再生的分子細(xì)胞學(xué)機(jī)制，提出蚯蚓能夠作為研究再生生物學(xué)或者再生醫(yī)學(xué)的一個(gè)新的模型。
03表觀遺傳學(xué)研究
三代Nanopore DNA甲基化檢測原理（Michael C Schatz，et al. 2018.）
PacBio對粳稻Nip與秈稻93-11基因組更新：利用PacBio對Nip和93-11進(jìn)行測序及Illumina平臺進(jìn)行g(shù)ap填充和誤差校正后，Nip基因組大小為380.7 Mb（contig N50=16.97 Mb），93-11基因組大小為396 Mb（contig N50=9.64 Mb）；進(jìn)一步通過SMRT（單分子實(shí)時(shí)測序系統(tǒng)Single MoleculeReal Time）測序數(shù)據(jù)，在Nip和93-11中分別檢測出704875個(gè)和784912個(gè)6mA位點(diǎn)。
圖8 水稻中6mA甲基化分析
文章中進(jìn)一步通過RNA-seq分析表明在Nip和93-11中，在6mA位點(diǎn)有大量的高表達(dá)基因甲基化，大量未甲基化基因在低水平表達(dá)。6mA甲基化基因的表達(dá)水平顯著高于非6mA基因；Nip對冷和鹽脅迫表現(xiàn)出更大的耐受性，而93-11對熱脅迫表現(xiàn)出更大的耐受性。6mA水平的變化在Nip和93-11之間表現(xiàn)出顯著的差異。水稻6mA含量與耐冷性呈負(fù)相關(guān)，與耐鹽性和耐熱性呈正相關(guān)。
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