2021?年?5?月?11?日，華南農(nóng)業(yè)大學與北京百邁客生物科技有限公司合作的鴨腸道菌群研究的文章在Science of the Total Environment（IF 7.96）在線發(fā)表，該文章使用全長16S擴增子測序技術(shù)研究了砷誘導下導致的腸道微生物菌群失調(diào)和腸道屏障損傷，并揭示了砷誘導的鴨肝臟和空腸炎癥是由LPS/TLR4/NF-kB信號通路和NLRP3炎癥小體的激活引起的。以下是對該文章的詳細解讀。
文章信息
英文主題：Arsenic exposure induces intestinal barrier damage and consequent activation of gut-liver axis leading to inflammation and pyroptosis of liver in ducks
中文主題：砷暴露引起鴨腸道屏障損傷進而激活腸-肝軸導致肝臟炎癥和細胞凋亡
發(fā)表期刊：Science of the Total Environment
影響因子：7.96
發(fā)表時間：2021?年?5?月
研究亮點
? 砷會引起鴨肝臟和腸道毒性，帶來生態(tài)風險
? 砷暴露導致腸道微生物群失調(diào)和屏障損傷
? 砷可通過?TLR4/NF-κB?和?NLRP3 通路觸發(fā)炎癥反應
? 砷誘導的肝毒性與腸-肝軸的激活有關
研究概覽
研究方法
組織病理學研究，酶聯(lián)免疫吸附試驗?(ELISA)，定量實時?PCR (qRT-PCR)，蛋白質(zhì)印跡分析，免疫組化，免疫熒光分析，16S全長腸道微生物多樣性測序分析
摘要
砷元素廣泛存在于自然界中，砷及砷化合物是常見的有毒有害類污染物，常見于受污染的土壤、河流和地下水中。然而，關于三氧化二砷?(ATO)?對水禽的腸-肝軸和隨之而來的肝毒性的影響的研究很少。在此，我們研究了?ATO?對鴨腸和肝臟的影響，并探討了腸肝軸在?ATO?誘導的肝毒性和腸道毒性中的作用。結(jié)果表明，ATO?暴露會導致腸道損傷、肝臟炎癥細胞浸潤和囊泡脂肪變性。此外，暴露于?ATO?的鴨子的腸道微生物群落顯示出顯著降低的α多樣性和細菌群落的改變。并且，ATO?暴露顯著降低了腸道屏障相關蛋白（Claudin-1、MUC2、ZO-1?和?Occludin）的表達，導致腸道通透性增加和脂多糖水平升高。同時，ATO?暴露還上調(diào)肝臟和空腸中與細胞凋亡相關的指數(shù)水平，并增加促炎細胞因子的產(chǎn)生（IFN-γ、TNF-α、IL-18?和?IL-1β）。我們進一步的機制研究表明，ATO?誘導的肝臟和空腸炎癥是由?LPS/TLR4/NF-κB?信號通路和?NLRP3?炎癥小體的激活引起的?？傊?，這些結(jié)果表明ATO暴露可引起肝臟和空腸炎癥和細胞凋亡，間接腸肝軸通路可能在ATO誘導肝毒性的潛在機制中起重要作用
研究背景
砷廣泛分布于農(nóng)業(yè)土壤和地下水中，在全球許多地區(qū)，土壤和河水中的砷濃度超過了世界衛(wèi)生組織規(guī)定的標準限值（<10?μg/L）。據(jù)報道，在一些亞洲國家，飲用水中的砷含量已達到?150-440?微克/升。由于砷在土壤/植物/動物-人類食物鏈中的運輸和積累，砷暴露變得越來越普遍。大約?80%?的無機砷在攝入后被胃腸道吸收。近幾十年來，許多報告描述了砷誘導的動物免疫毒性、腎毒性、生殖毒性和其他不良反應。此外，近期關于砷毒性的其他研究表明，砷暴露可通過氧化損傷引起雞的肝毒性和腸道毒性，但很少有重點研究砷對水禽腸道和肝臟的影響。鴨子是人類飲食中的重要成分和蛋白質(zhì)來源，然而，由于受砷污染的水和飲食攝入，水禽比其他家禽更容易受到砷毒性的影響，這可能導致人類食用的農(nóng)產(chǎn)品（例如鴨肉和雞蛋）中存在砷殘留。因此，研究鴨在砷暴露期間腸道和肝臟的變化尤為重要。
腸道是營養(yǎng)消化和吸收的主要器官，腸道微生物對免疫調(diào)節(jié)、營養(yǎng)消化和吸收以及宿主對病原體的防御至關重要。在正常生理條件下，腸黏膜免疫、上皮細胞完整性以及腸道微生物群與營養(yǎng)物質(zhì)之間復雜的相互作用維持腸道環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。越來越多的證據(jù)表明，重金屬暴露對腸道功能有不利影響。據(jù)報道，鎘可通過增加小鼠腸道通透性和降低腸道微生物豐富度來損害腸道組織。此外，另一項研究表明，銅暴露顯著影響鯉魚肝功能的生化指標，并抑制腸上皮緊密連接蛋白（ZO-1?和?Occludin）的表達。這些研究表明，重金屬暴露會干擾腸道微生物群，從而導致代謝紊亂并增加腸炎和脂肪肝等疾病的風險。
肝臟是腸道微生物及其產(chǎn)物易位的第一個目標。因此，腸肝軸在肝臟疾病的發(fā)病機制中具有重要意義。研究表明，腸道菌群可通過增加脂多糖（LPS）誘導肝損傷，主要通過激活?TLR4/NF-κB?信號通路誘導肝臟炎癥和脂質(zhì)積累。此外，腸道屏障破壞引起的腸道通透性增加也可能是肝病發(fā)生的重要因素。值得注意的是，一些研究人員已經(jīng)表明肝臟和腸道炎癥與重金屬暴露密切相關。最近的一些報道也表明腸道炎癥的發(fā)生可能與?NLRP3?炎癥小體和?IκB/NF-κB?信號通路的激活有關。然而，據(jù)我們所知，砷引起的肝臟和腸道炎癥的激活機制仍不確定。因此，砷是否通過激活?NF-κB?信號通路和?NLRP3?炎癥小體導致鴨腸道損傷，并通過腸-肝軸激活引起肝臟炎癥和細胞凋亡需要進一步研究。
本研究采用組織病理學技術(shù)、實時定量?PCR、蛋白質(zhì)印跡分析和全長?16S rRNA?高通量測序技術(shù)研究砷誘導腸道和肝臟損傷的潛在機制及其對鴨腸道微生物組成的影響。本研究的結(jié)果可能有助于更好地了解砷誘導家禽肝臟和腸道毒性的潛在機制，并為未來的研究奠定基礎。
研究結(jié)果
ATO?暴露對空腸組織病理學的影響
為了評估對?ATO?暴露的潛在腸道形態(tài)學改變，H&E?染色用于檢測腸道組織病理學變化，PAS?染色用于檢測?ATO?對粘蛋白層和杯狀細胞數(shù)量的影響。組織病理學改變（H&E染色）見圖1A，對照組空腸組織形態(tài)正常，邊界清晰，上皮細胞排列整齊。然而，用?8 mg/kg ATO?處理的鴨子表現(xiàn)出通過腸絨毛頂端上皮脫落和絨毛長度顯著減少的空腸損傷（P < 0.01）。與對照組相比，隱窩深度（黑色箭頭）沒有明顯變化（P > 0.05）（圖?1C-D）。PAS?染色產(chǎn)生了類似的結(jié)果。如圖1B所示，未處理組的腸黏膜覆蓋著一層厚厚的連續(xù)黏蛋白層和許多紫紅色的杯狀細胞（紅色箭頭）。然而，暴露于?8 mg/kg ATO?后，粘蛋白層變薄，杯狀細胞數(shù)量顯著減少。此外，與對照組和?4 mg/kg ATO?組相比，8 mg/kg ATO?治療組的?SIgA?水平也顯著降低（P < 0.05?或?P < 0.01，圖?1E），而?DAO?含量則為隨著?ATO?水平的增加，顯著升高（P < 0.05，圖?1F）。結(jié)果表明，砷會引起空腸損傷，從而影響營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收。
ATO暴露對空腸和血清砷含量的影響
如圖?1G-H?所示，鴨空腸和血清中砷濃度呈劑量依賴性增加。與對照組相比，所有ATO治療組血清和空腸組織中砷含量均顯著升高（P < 0.001）。此外，8 mg/kg ATO?組的砷水平顯著高于?4 mg/kg ATO?治療組（P < 0.01?或?P < 0.001）。
ATO暴露對腸道屏障功能的影響
為了研究?ATO?暴露是否通過破壞腸道屏障來增加組織毒性，我們評估了腸道屏障標志物。圖?2A-D?顯示了腸道屏障相關基因和蛋白質(zhì)。與對照組相比，8 mg/kg ATO組Occludin、ZO-1、Claudin-1和MUC2的mRNA水平顯著下調(diào)（P < 0.05或P < 0.001）。此外，8 mg/kg ATO?組中?Occludin?和?ZO-1?的?mRNA?水平顯著低于?4 mg/kg ATO?組（P < 0.05?或?P < 0.001）。同樣，與對照組相比，所有?ATO?治療組的?Occludin?蛋白水平顯著降低（P < 0.05?或?P < 0.01）。與對照組和4 mg/kg ATO組相比，8 mg/kg ATO組的ZO-1蛋白水平也明顯降低（P < 0.001）。同時，MUC2?抗體的免疫熒光顯示?ATO?降低了鴨空腸組織中的?MUC2?熒光強度（圖?2E-F）。
ATO暴露對肝臟組織病理學和生化指標的影響
如圖?3A?所示，外觀學檢測顯示?8 mg/kg ATO?組的肝臟表面有許多白色結(jié)節(jié)性病變。同樣，組織病理學結(jié)果顯示，與對照組相比，8 mg/kg ATO?組的肝臟有炎癥細胞浸潤（黑色箭頭）和囊泡脂肪變性（紅色箭頭）（圖?3B）。此外，增加的血清?AST、ALT、TC?和?TG?水平證實?8 mg/kg ATO?組的鴨有嚴重的肝損傷和脂肪變性（P < 0.05?或?P < 0.01?或?P < 0.001，圖?3C-F）。值得注意的是，8 mg/kg ATO?治療組的血清?LPS?水平顯著高于對照組和?4 mg/kg ATO?組（P < 0.01，圖?3G）。
ATO暴露對腸道菌群多樣性的影響
在目前的微生物多樣性分析中，我們使用?PacBio?平臺對八個腸道內(nèi)容物樣本進行全長?16S rRNA?基因擴增，獲得了?102,583?個原始?CCS?序列（范圍?= 10,078?至?14,498）。剔除低質(zhì)量?CCS?序列后，對照組和?8 mg/kg ATO?組分別獲得了平均?54,518±747?和?45,050±1675?的高質(zhì)量?CCS?序列。補充表?S2?提供了有關?CCS?序列的詳細信息。基于?97%?的序列相似性，在兩組中鑒定出?340?個?OTU，對照組和?ATO?組分別包含?43?個和?15?個獨特的?OTU（圖?4A）。
α?和?β?多樣性分析都用于評估對照組和?ATO?治療組之間腸道細菌群落多樣性的差異。如圖?4B?所示，NMDS?分析用于分析各組之間的?β-多樣性，ATO?治療組和對照組之間的腸道微生物群分布分別與每組聚類。此外，物種稀釋性曲線趨于相對平坦，說明測序數(shù)量和深度符合后續(xù)分析的要求（圖4C）。腸道微生物種群的α多樣性通過群落豐度（ACE）和多樣性指數(shù)（香農(nóng)指數(shù)）來反映。與對照組相比，ATO?暴露顯著降低了?ACE?和香農(nóng)指數(shù)（P < 0.05，圖?4D-E），這表明?ATO?暴露顯著改變了鴨腸道微生物的豐富度和多樣性。
我們進一步分析了空腸微生物群在門、屬和種水平上的變化。在門水平（圖?4G），Metastats?分析顯示可檢測門的豐度在對照組和?8 mg/kg ATO?組之間沒有顯著差異。值得注意的是，在誘導?ATO?后，鴨的腸道微生物群落中無法檢測到兩種細菌門（疣菌門和酸桿菌門）。此外，進一步使用Metastats分析來比較兩組之間的屬水平差異。如圖?4F?所示，ATO?暴露顯著降低了?Merdimonas、Blautia、Globicatella、Weissella、消化鏈球菌、Sellimonas?的相對豐度（P < 0.05）。在物種水平上，從所有樣本中鑒定出?36?個物種（圖?4I），并且相比于ATO?處理組，?Merdimonas_faecis、Blautia_sp、Eubacterium_ventriosum、Globicatella_sanguinis、Weissella_paramesenteroides?和?Peptostreptococcus_anaerobius?的相對豐度在對照組更高?(P < 0.05，圖?4J)。
ATO暴露對空腸組織NLRP3炎癥小體活化的影響
為了評估?ATO?誘導的炎癥小體激活是否與腸道損傷有關，我們檢查了炎癥小體激活標志物的表達水平。從圖?5A?可以看出，NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β?和?IL-18?的?mRNA?表達水平隨著?ATO?水平的增加而升高，與對照相比，8 mg/kg ATO?組和?4 mg/kg ATO?組出現(xiàn)顯著差異?（P < 0.05?或?P < 0.01?或?P < 0.001）。同時，NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β?和?IL-18?的蛋白質(zhì)濃度在?8 mg/kg ATO?組中也顯著增加（P < 0.01?或?P < 0.001，圖?5B-C）。這些基因和蛋白質(zhì)的變化在熱圖中直觀地顯示出來（圖?5D）。這些結(jié)果表明，ATO?處理引發(fā)了鴨空腸組織中?NLRP3?炎癥小體的激活和細凋亡。
ATO暴露對空腸組織IκB/NF-κB信號通路的影響
為了進一步確認?ATO?是否在空腸組織中誘導炎癥反應，通過?qRT-PCR?和蛋白質(zhì)印跡分析確定了空腸組織中?IκB/NF-κB?信號通路相關基因和蛋白質(zhì)的水平，如圖?6?所示。與對照組相比，8 mg/kg ATO?治療組中?NF-κB、IFN-γ?和?TNFα?的?mRNA?水平顯著升高，伴隨著?IκB?水平的降低（P < 0.05?或?P < 0.01，圖?2）。6A)。此外，ATO暴露下IFN-γ、TNFα、p-NF-κB/NF-κB和p-IκB/IκB蛋白水平也上調(diào)，8 mg/kg ATO組的變化為與對照組和?4 mg/kg ATO?組相比最明顯（P < 0.05?或?P < 0.01?或?P < 0.001，圖?6B-C）。這些基因和蛋白質(zhì)的變化通過熱圖直觀地顯示出來（圖?6D）。此外，免疫組織化學染色結(jié)果顯示，8 mg/kg ATO?處理組的細胞核中呈陽性棕色顆粒，表明?p-NF-κB?在細胞核中表達（圖?6E）。這些數(shù)據(jù)表明，8 mg/kg ATO?處理的鴨的空腸組織發(fā)炎，并且?IκB/NF-κB?信號通路被激活。
ATO?誘導肝臟炎癥反應和細胞凋亡
為了進一步研究?ATO?暴露對鴨肝炎癥反應的影響，我們檢測了?TLR4/NF-κB?相關基因的?mRNA?水平。如圖?7A?所示，與對照組和?4 mg/kg ATO?組相比，8 mg/kg ATO?組中?TLR4、NF-κB、IFN-γ?和?TNF-α?的?mRNA?水平顯著上調(diào)（?P < 0.05?或?P < 0.01），而?IκB mRNA?水平顯著下調(diào)（P < 0.05）。此外，與對照組相比，治療組的?TLR4、p-NF-κB/NF-κB、p-IκB/IκB、TNFα?和?IFN-γ?蛋白水平顯著升高（P < 0.05?或?P < 0.01或?P < 0.001；圖?7C, F)。與?4 mg/kg ATO?組相比，8 mg/kg ATO?組的?p-NF-κB/NF-κB?和?IFN-γ?蛋白水平顯著增加（P < 0.05?或?P < 0.01?圖?7C，F(xiàn)）。為了探索?ATO?誘導肝損傷的機制，我們進行了進一步的實驗以確定肝損傷是否與細胞凋亡有關。如圖?7B?所示，與對照組相比，8 mg/kg ATO?暴露后?NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β?和?IL-18?的?mRNA?表達顯著增強（P < 0.05?或P < 0.01?或?P < 0.001)。類似地，與對照組和?4 mg/kg ATO?組相比，8 mg/kg ATO?治療組的?NLRP3?和?Caspase-1?的蛋白質(zhì)水平顯著增加（P < 0.01?或?P < 0.001；圖?7D-E，G）。此外，與對照組相比，8 mg/kg ATO?組的?GSDMD、IL-1β?和?IL-18?的蛋白質(zhì)水平顯著增加（P < 0.05?或?P < 0.01；圖?7D-E）。因此，暴露于?8 mg/kg ATO?會在鴨肝組織中引起顯著的炎癥反應和細胞凋亡。
結(jié)論
我們的結(jié)果表明砷暴露會損害腸道屏障功能并導致鴨空腸炎癥損傷。同時，過量的砷可通過觸發(fā)?LPS/TLR4/NF-κB?信號通路和?NLRP3?炎癥小體來誘導肝臟炎癥和細胞凋亡。腸-肝軸的間接通路可能在?ATO?誘導的肝毒性和腸道毒性的潛在機制中起重要作用。該研究為水禽過量砷暴露的毒性研究提供了基礎，并為深入了解砷的毒性機制提供了依據(jù)。
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