空間轉(zhuǎn)錄組+基因組數(shù)據(jù)聯(lián)合分析揭示乳腺原位癌的異質(zhì)性

文章題目：Genomic profiling reveals heterogeneous?populations of ductal carcinoma in situ of?the breast

中文題目：基因組分析揭示乳腺原位癌的異質(zhì)性群體

期刊：Communications Biology

影響因子：6.6

DOI：10.1038/s42003-021-01959-9

導(dǎo)讀

對大部分患者來說，乳腺導(dǎo)管原位癌（DCIS）不會發(fā)展為浸潤性導(dǎo)管癌，在當(dāng)前的臨床標(biāo)準(zhǔn)下，這些患者經(jīng)常被過度治療。雖然有各種候選標(biāo)記物可用，但尚未建立用于描述風(fēng)險類別的相關(guān)標(biāo)記物。在本研究中，作者分析了431例DCIS患者的臨床特征，并對21例患者進行了全外顯子組測序分析，對72例患者進行了靶向深度測序分析。確定了年齡<45歲、HER2擴增和GATA3突變可能影響復(fù)發(fā)。PIK3CA突變陰性和PgR陰性也被認(rèn)為是危險因素?？臻g轉(zhuǎn)錄組分析進一步顯示GATA3功能障礙上調(diào)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和血管生成，隨后PgR下調(diào)。這些結(jié)果揭示了DCIS中異質(zhì)細(xì)胞群的存在，并為DCIS分類和優(yōu)化治療提供了預(yù)測性標(biāo)記。

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方法

外顯子組文庫構(gòu)建和全外顯子組測序

從21例DCIS（原發(fā)性腫瘤）患者和4例IDC（復(fù)發(fā)性腫瘤）患者中選擇福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）組織樣本。同時對每位患者制作相應(yīng)的冰凍切片，染色確定DCIS和正常上皮組織中的區(qū)域。

全外顯子組測序中基因組風(fēng)險因子的選擇

為了提高基于臨床評估區(qū)分低風(fēng)險和高風(fēng)險DCI標(biāo)準(zhǔn)的準(zhǔn)確性，作者嘗試識別基因組因素。評估了21例DCIS患者，他們是隨機選擇的，具有匹配的固有亞型和相對較高的復(fù)發(fā)率。對匹配的正常乳腺組織進行測序（平均深度×109.1），以區(qū)分體細(xì)胞突變的種系變異。獲得的變異圖如圖1a所示。

GATA3和PIK3CA突變是隊列中最常見的突變，分別出現(xiàn)在4例（19%）和5例（24%）患者中。在4例GATA3突變患者中，3例出現(xiàn)IDC復(fù)發(fā)。GATA3突變陽性與GATA3突變陰性復(fù)發(fā)的優(yōu)勢比（OR）為5.5（95%CI=0.63–76.7）。為了進一步研究GATA3突變在復(fù)發(fā)中的意義，對復(fù)發(fā)腫瘤患者的樣本進行額外分析，以確定與配對原發(fā)性DCI相比的突變狀態(tài)。

結(jié)果

全外顯子靶向測序

獲得的突變圖如圖2所示。總共有40名（56%）和36名（50%）患者分別攜帶GATA3和PIK3CA突變。與上述結(jié)果一致，GATA3突變與復(fù)發(fā)呈正相關(guān)（OR=7.8；95%CI=1.17~88.4），而PIK3CA突變往往與復(fù)發(fā)呈負(fù)相關(guān)（OR=0.45；95%可信區(qū)間=0.12~1.7）。在測試的180個基因中，沒有一個比這兩個因素更能作為預(yù)測標(biāo)記。對于PgR蛋白表達，低PgR表達再次與復(fù)發(fā)相關(guān)（OR=25.6；95%可信區(qū)間=3.64–142.2）。結(jié)果表明在11例中的8例中發(fā)現(xiàn)了GATA3突變，盡管ER陽性，但PgR較低。

DCIS患者的分子解剖分析

為了確定所識別的高危標(biāo)記物的分子病因，調(diào)查了另外三名具有代表性的新鮮冰凍標(biāo)本患者?；颊逜患有帶有GATA3突變（圖2，*1）和微侵襲的DCIS，病變被認(rèn)為是真正的DCIS?；颊連患有PgR低表達的DCIS（圖2，*2）和微侵襲，病變被視為真正的DCIS?；颊逤患有PIK3CA突變的DCIS（圖2，*3），沒有任何微侵襲，病變被認(rèn)為可能是假DCIS（低風(fēng)險DCIS）。

含有GATA3突變的DCIS病變的STseq

首先，利用空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)——10X基因組學(xué)Visium平臺，通過STseq分析了患者A標(biāo)本的空間基因表達。該患者在術(shù)前病理診斷中被診斷為DCIS，但在術(shù)后病理診斷中發(fā)現(xiàn)有微侵襲部位。因此，DCIS病變被確定為IDC的真正前兆。平均深度為×2391.4的面板測序分析顯示該樣本含有GATA3突變（外顯子4:c.865dupG:p。C288fs，變異等位基因頻率[VAF]=7%）。在較高的VAF（外顯子5:c.T1035A:p。N345K，VAF=26.1%），表明新出現(xiàn)的GATA3突變用PIK3CA突變覆蓋了DCIS的基本特征。

PgR低表達但無GATA3突變的DCIS病變的STseq

接下來，作者將患者B作為PgR低表達的例外患者進行研究，盡管沒有GATA3突變（圖2，*2）。從平均深度×3030.6的靶向測序中，檢測到PIK3CA突變（外顯子21:c.A3140T:p。H1047L，VAF=40%），而即使在這個足夠的測序深度，也沒有檢測到GATA3突變。因此，從分子水平來看，該患者的預(yù)后良好。然而，術(shù)后病理檢查顯示微侵襲，表明DCIS病變是IDC的真正前兆。免疫組化分析顯示該患者ER陽性，PgR陰性。

DCIS和PIK3CA突變

最后，將患者C的病例分析為可能的假DCIS病例，不太可能發(fā)展為IDC（低風(fēng)險DCIS）。該患者特征為PIK3CA突變，GATA3突變或下調(diào)缺失，無微侵襲，術(shù)后無復(fù)發(fā)。該患者的DCIS病變包含兩個PIK3CA突變（外顯子10:c.G1633A:p。E545K，外顯子10:c.A1634G:p。E545G，兩種突變的VAF=25%）。

對于Visium分析，收集了799133428個測序讀數(shù)，測序飽和度為86.2%。分析點的數(shù)量（直徑55μm）為2043個，其中包含7469個唯一分子標(biāo)識符（UMI）讀數(shù)的中位數(shù)和每個點2928個檢測基因的中位數(shù)。如圖3A的中間板所示，癌細(xì)胞斑點被分為三組，通過非分層k-均值聚類（K＝9），表明DCIS病變中存在異質(zhì)性。此外，可能代表癌細(xì)胞周圍微環(huán)境的非癌點被分為四類。在代表病理學(xué)鑒定的癌細(xì)胞的總共422個點中，通過分析Visium讀數(shù)在46個點中檢測到GATA3突變讀數(shù)（圖3b）。幸運的是，在該患者中，GATA3突變位于轉(zhuǎn)錄本的3′端，因此可以通過Visium讀數(shù)來表示。為了研究攜帶GATA3突變（spots）的細(xì)胞是否是克隆性的，檢測了46個攜帶GATA3突變的點的VISUM讀數(shù)上的GATA3突變位點。突變完全存在于同一位點（外顯子4:c.865dupG:p。C288fs），表明它們是單克隆來源。使用TCC R檢測了GATA3突變的斑點之間的差異表達基因（DEG）?？偣矙z測到1468個DEG（錯誤發(fā)現(xiàn)率[FDR]<0.05，圖3c，左面板）。如圖1d所示，在具有GATA3突變的斑點中觀察到PgR表達下調(diào)（P=0.02901；t檢驗；圖3c，右面板）。為了預(yù)測檢測到的DEG的功能結(jié)果，使用Metascape進行了路徑分析(http://metascape.org/)28.發(fā)現(xiàn)了9條與11種癌癥特征相關(guān)的關(guān)鍵途徑。

與突變陰性點的結(jié)果相比，GATA3突變的癌點受影響（圖3d）。特別是，關(guān)鍵基因和關(guān)鍵途徑包括EMT和血管生成。重要的是，具有表達變化的關(guān)鍵基因是那些被鑒定為對異常GATA3功能作出反應(yīng)的基因，如VIM和FN1（圖3e）。這些結(jié)果表明GATA3突變在DCIS進展過程中出現(xiàn)，并伴有惡性特征。據(jù)報道，增加的VIM表達發(fā)生在管腔癌細(xì)胞的GATA3突變下游24；因此，在這些斑點中觀察到的GATA3突變可能代表惡性發(fā)展過程中先前的基因改變。相反，在沒有GATA3突變的斑點中，DEG主要富集于雌激素反應(yīng)、緊密連接和mTORC1的信號通路，表明這些斑點中的細(xì)胞獲得了允許細(xì)胞轉(zhuǎn)化的最小變化。

Visium分析發(fā)現(xiàn)了異質(zhì)基因表達，這取決于癌區(qū)和非癌區(qū)細(xì)胞的位置。PgR表達下調(diào)，盡管觀察到高ER表達（圖4a，上圖），與免疫染色結(jié)果一致（圖4a，下圖）。針對DCIS細(xì)胞中基因表達的變化，手動選擇了188個位于導(dǎo)管內(nèi)區(qū)域的形態(tài)學(xué)斑點。這些斑點的無監(jiān)督分層聚類確定了三個明顯的聚類（圖4b，左面板）。在空間上，不同的簇對應(yīng)于不同的區(qū)域（圖4b，中間面板）。重要的是，簇1的48個斑點（紅色）與DCIS細(xì)胞的位置重疊，DCIS細(xì)胞根據(jù)其形態(tài)即將入侵（由圖4b右面板中的紅色箭頭指示）。同時，簇2（有色綠色）的101個斑點位于同一導(dǎo)管的中心，并被視為不侵入基質(zhì)的細(xì)胞（由圖4B的中間板中的綠色斑點指示）。簇1和簇2之間的差異表達分析確定了2747個DEG（FDR<0.05，圖4c，左）。有趣的是，GATA3表達在簇1中顯著下調(diào)（圖4c，右圖）。盡管該基因未發(fā)生突變，但該患者的GATA3功能異?？赡馨l(fā)生在基因水平。根據(jù)基因富集和通路分析的結(jié)果，該患者始終觀察到以GATA3為中心的基因表達變化，如患者A所觀察到的（圖4d，e）。共有21條途徑和18個癌癥特征，包括EMT和血管生成途徑受到影響。如對患者A所觀察到的，在未侵入間質(zhì)的第2組中，DEG主要代表雌激素反應(yīng)相關(guān)基因?？傊?，在這名患者身上，我們得出結(jié)論，GATA3通過其表達的變化發(fā)揮關(guān)鍵作用。即使沒有基因組突變，GATA3的異常表達也可能在某些患者中導(dǎo)致相同的結(jié)果。

通過全外顯子組測序，平均深度為×134.8。Visium分析揭示了一種單調(diào)的基因表達模式，與該癌的形態(tài)學(xué)單克隆結(jié)構(gòu)一致（圖5a，左面板）。事實上，這些斑點通過非層次聚類大致分為兩個簇（圖5a，中間和右側(cè)面板）。它們幾乎與形態(tài)學(xué)確定的癌細(xì)胞和非癌細(xì)胞（基質(zhì)細(xì)胞）完全重疊。因此，使用DEG分析比較了癌細(xì)胞中的347個斑點（藍(lán)色斑點）和基質(zhì)細(xì)胞中的151個斑點（橙色斑點），并確定了癌斑點中508個上調(diào)的DEG（FDR<0.05）。加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）顯示，與非癌點相比，癌點中只有兩個主要節(jié)點（模塊）發(fā)生改變（圖5b，上面板）。進行了子網(wǎng)絡(luò)分析，以確定樞紐基因（圖5b，中間和下部面板）。hub基因的途徑富集分析顯示，參與雌激素反應(yīng)和p53途徑的基因在模塊1中富集（圖5c，補充數(shù)據(jù)5），這與在患者A和B中觀察到的良性出現(xiàn)斑點的特征相同，表明該病變中沒有發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。

討論

在本研究中，將GATA3突變確定為DCI分類的潛在標(biāo)記。ER陽性DCIS患者的PIK3CA突變陰性和PgR蛋白陰性也被認(rèn)為是危險因素。傳統(tǒng)的臨床病理因素對于預(yù)測IDC發(fā)生的風(fēng)險也至關(guān)重要，包括年齡(≥45歲與<45歲）和HER2狀態(tài)（陰性與陽性）。在缺乏HER2靶向治療的情況下，HER2擴增是眾所周知的IDC預(yù)后不良因素。然而，HER2擴增的頻率在DCIS和IDC33–37之間有所不同，HER2擴增是否是DCIS的風(fēng)險因素仍有爭議。HER2陽性率/年齡的HR≥45歲與2歲消極/年齡≥45年為1.54（95%可信區(qū)間=0.31-7.65，P=0.595）。HER2陰性/年齡<45歲與HER2陰性/年齡的HR比較≥45為2.43（95%可信區(qū)間=0.78-7.52，P=0.125）。相反，HER2陽性/年齡<45歲與HER2陰性/年齡的HR≥45為11.03（95%可信區(qū)間=3.54-34.4，P<0.0001）。盡管交互試驗的P值為0.121，但這些結(jié)果可能表明年齡與HER2擴增之間存在交互作用。還發(fā)現(xiàn)PIK3CA突變的DCIS細(xì)胞沒有任何導(dǎo)致惡性轉(zhuǎn)化的基因組或轉(zhuǎn)錄組改變。未來，DCIS的臨床研究(包括正在進行的試驗12 14)可能會提供一種準(zhǔn)確的算法，使用包括本研究提出的標(biāo)記物在內(nèi)的標(biāo)志物來區(qū)分高風(fēng)險和低風(fēng)險DCIS，從而避免不必要的治療。

參考文獻

Nagasawa S, Kuze Y, Maeda I,?et al. Genomic profiling reveals heterogeneous populations of ductal carcinoma in situ of the breast. Commun Biol. 2021 Apr 1;4(1):438.

 

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