在中心法則中，RNA處于重要的中央樞紐地位，轉(zhuǎn)錄組作為生信科研中的“萬金油”，幾乎可以與所有的組學(xué)產(chǎn)品聯(lián)合分析。轉(zhuǎn)錄組代表了基因表達(dá)的中間狀態(tài)，可以反映諸如轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的機(jī)理；蛋白組代表生物體直接功能執(zhí)行狀態(tài)，可以反應(yīng)轉(zhuǎn)錄本真實(shí)的表達(dá)情況；而代謝組可以反映生物體表型的狀態(tài)變化。轉(zhuǎn)錄組+蛋白組+代謝組的多組學(xué)分析可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)從“因”和“果”兩個(gè)層面來探究生物學(xué)問題，相互間進(jìn)行驗(yàn)證，從海量的數(shù)據(jù)中篩選出關(guān)鍵基因、蛋白質(zhì)及代謝通路，解釋生物過程的復(fù)雜性和整體性，提高文章的水平。今天小編通過一篇案例的解析，帶領(lǐng)大家進(jìn)入多組學(xué)聯(lián)合分析的新視野。
英文題目：Multiomics Analysis Reveals New Insights into the Apple Fruit Decline under High Nitrogen Conditions
中文題目：多組學(xué)聯(lián)合分析揭示了高氮條件下蘋果果實(shí)品質(zhì)下降的新見解
發(fā)表期刊：Journal of agricultural and food chemistry
影響因子：5.279
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33945277/
研究背景
水果質(zhì)量是消費(fèi)者偏好的最重要指標(biāo)，包括各種質(zhì)量特征，如水果顏色、甜度、風(fēng)味和健康價(jià)值。水果的甜度取決于各種糖和糖醇的濃度和組成。此外，次生代謝產(chǎn)物，特別是黃酮類化合物，被認(rèn)為是人類日常消費(fèi)的重要物質(zhì)，可以降低癌癥和心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。
在中國，過量施用氮肥已成為一種普遍現(xiàn)象，蘋果樹種植中施氮量已達(dá)600?800 kg/hm2，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過蘋果樹的需求。雖然高氮對(duì)提高產(chǎn)量和單果重有積極作用，但過量的氮會(huì)影響C?N平衡，對(duì)可溶性糖、類黃酮等果實(shí)品質(zhì)指標(biāo)產(chǎn)生負(fù)面影響。以往的研究主要集中在氮脅迫對(duì)蘋果葉片的影響上，而高氮對(duì)蘋果果實(shí)初級(jí)代謝和次級(jí)代謝影響的研究相對(duì)較少。本研究通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和廣靶代謝組學(xué)的聯(lián)合分析，探索過量氮營養(yǎng)與初級(jí)和次級(jí)代謝物積累之間的關(guān)系，特別是C-N平衡中碳水化合物、氨基酸和黃酮類化合物的變化，并為提高蘋果果實(shí)品質(zhì)提供新的見解。
材料方法
實(shí)驗(yàn)材料：紅富士蘋果（7齡；中國東北部山東省煙臺(tái)市）。對(duì)照組CK：正常尿素處理組（300 kg N/hm2，每棵樹435 g尿素）；實(shí)驗(yàn)組MHN：中高氮處理組（600 kg N/hm2，每棵樹870 g尿素）；實(shí)驗(yàn)組HN：高氮處理組（800 kg N/hm2，每棵樹1160 g尿素）。在開花后183天進(jìn)行13C標(biāo)記。
理化指標(biāo)測定：氮含量（凱氏定氮法）；15N和13C豐度（DELTAV advantage同位素比值質(zhì)譜儀）；Ndff和13C分布率；可溶性固形物（糖量計(jì)）和可溶性糖的含量（蒽酮比色法）；總游離氨基酸（茚三酮比色法）和可溶性蛋白質(zhì)含量（Bradford法）。
組學(xué)研究：RNA-seq；TMT標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組；廣靶代謝組
主要結(jié)果與分析
1. 生理分析
Ndff是指各器官從肥料中吸收的15N相對(duì)于各器官總N的貢獻(xiàn)率，它反映了各器官吸收和調(diào)節(jié)15N的能力。與對(duì)照相比，MHN和HN使果實(shí)、一年生枝條和葉片的Ndff值增加，并隨施氮量的增加而增加（圖1A），表明了果實(shí)對(duì)15N的吸收和調(diào)節(jié)最大，MHN和HN提高了新生器官對(duì)15N的吸收和調(diào)節(jié)能力。與對(duì)照相比，MHN和HN降低了果實(shí)的13C分布率，增加了營養(yǎng)器官（一年生枝和葉）的13C分布率（圖1B），且MHN和HN果實(shí)中15N積累增加，而13C的積累減少。因此，MHN和HN提高了果實(shí)對(duì)15N的吸收和調(diào)節(jié)能力，減少了13C從營養(yǎng)器官向果實(shí)的分配。另外，MHN和HN使果實(shí)可溶性糖和總黃酮含量分別降低16.05%和19.01%（圖1I，J），表明高氮條件下蘋果果實(shí)品質(zhì)惡化。此外，與對(duì)照相比，MHN和HN增加了總游離氨基酸（圖1K）和可溶性蛋白質(zhì)（圖1L）的含量。CK和HN果實(shí)生理指標(biāo)上不存在顯著差異，因此選擇這兩個(gè)處理的果實(shí)樣品進(jìn)行后續(xù)的組學(xué)研究。
圖1 蘋果生理指標(biāo)
2. 轉(zhuǎn)錄組分析
結(jié)果顯示204個(gè)基因上調(diào)，545個(gè)基因下調(diào)，KEGG分析顯示差異基因（DEGs）主要參與碳水化合物代謝、氨基酸代謝和其他次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成（圖2B）。此外，共鑒定出91種轉(zhuǎn)錄因子（TF），涵蓋26個(gè)TF家族（圖2C）?？偟膩碚f，大多數(shù)TF在高氮水平下下調(diào)。AP2-EREBP、MYB和bHLH是相對(duì)較大的TF家族。結(jié)果表明，這些顯著變化的TFs在高氮脅迫下起著重要作用。
圖2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析
3. 蛋白質(zhì)組分析
共獲得5340個(gè)蛋白質(zhì)，與對(duì)照相比，795個(gè)DEPs在HN中顯示出顯著變化，其中422個(gè)蛋白上調(diào)，373個(gè)蛋白下調(diào)。GO富集分析顯示氧化作用?還原過程和應(yīng)激反應(yīng)富含更多的蛋白質(zhì)，而下調(diào)的蛋白質(zhì)富集程度更高（圖3A）。KEGG分析發(fā)現(xiàn)C代謝、丙酮酸代謝、糖酵解/糖異生、三羧酸（TCA）循環(huán)、次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成和氨基酸生物合成途徑顯著富集（圖3B）。MapMan分析結(jié)果顯示許多DEP參與主要和次要CHO代謝、糖酵解、TCA循環(huán)、氨基酸代謝和次級(jí)代謝，并且大多數(shù)這些蛋白質(zhì)被發(fā)現(xiàn)下調(diào)（圖3C）。
圖3 蛋白組分析
4. 廣靶代謝組學(xué)分析
共鑒定到36個(gè)上調(diào)代謝物和47個(gè)下調(diào)代謝產(chǎn)物（圖4B），包括類黃酮，碳水化合物、氨基酸和衍生物等（圖4C）。KEGG富集分析表明差異代謝物（DAMs）主要在氨基酸生物合成、次生代謝產(chǎn)物生物合成、C代謝和類黃酮生物合成富集。碳水化合物中D-果糖6-磷酸和Dglucono-1,5-內(nèi)酯的下調(diào)倍數(shù)最大，氨基酸和衍生物中，有四種下調(diào)，六種上調(diào)，其中高精氨酸的上調(diào)倍數(shù)最大。此外，結(jié)果還表明果實(shí)中積累的黃酮類化合物較少，且氮含量較高，尤其是鼠李素-3-O-蘆丁苷和蘆丁。
圖4 HN與CK的代謝組學(xué)分析
5. 初級(jí)代謝的聯(lián)合分析
C代謝包括淀粉和蔗糖代謝、糖酵解和TCA循環(huán)。高氮總體下調(diào)了C代謝中蛋白質(zhì)（Susy、scrK和HK）的豐度和碳水化合物（蔗糖、葡萄糖和海藻糖）的積累。相反，糖酵解中間產(chǎn)物卻明顯積累，如甘油-P、甘油酸-3P和磷酸烯醇式丙酮酸。這表明蛋白質(zhì)（ALDO、gapN和ENO）與這些中間代謝物之間存在負(fù)相關(guān)。糖酵解亞型的增加表明，高氮加速了C在呼吸途徑中的流動(dòng)。氨基酸與碳代謝密切相關(guān)，是氮分配的主要形式。氨基酸生物合成途徑中的大多數(shù)蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)（脊索酸變位酶除外），而大多數(shù)氨基酸及其中間產(chǎn)物表達(dá)上調(diào)（圖5）。以前的研究表明，隨著氮供應(yīng)的增加，非結(jié)構(gòu)性碳水化合物中的一部分C被并入氨基酸和蛋白質(zhì)中。以氨基酸形式的氮增加，使氮儲(chǔ)存更具成本效益。因此，C向N代謝的轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致高氮條件下碳水化合物減少的一個(gè)重要因素，這使得水果中氨基酸和總氮含量的顯著增加。甘油酸-3P和磷酸烯醇式丙酮酸的增加是氨基酸生物合成所需C骨架增加的重要指標(biāo)。
圖5 C代謝和氨基酸生物合成途徑
6. 次級(jí)代謝聯(lián)合分析
參與苯丙烷生物合成途徑的蛋白質(zhì)（4CL、CCR、C3′H和UGT72E）下調(diào)，下游代謝物東莨菪堿也顯示下調(diào)趨勢。相反，苯丙烷代謝的另一個(gè)分支的代謝產(chǎn)物（松柏醛和松柏醇）顯著上調(diào)，這可能是由于苯丙烷途徑分支之間的代謝通量重新定向，以應(yīng)對(duì)高氮脅迫并維持苯丙烷代謝的動(dòng)態(tài)平衡。黃酮類化合物來源于苯丙烷代謝途徑，由C代謝誘導(dǎo)。參與類黃酮生物合成的基因（CCR、TCEA、F3H、DFR、ANS、BZ1和CYP75B1）和蛋白質(zhì)（PGT1、F3H和ANR）表達(dá)下調(diào)。類似地，參與類黃酮生物合成途徑的代謝物（根皮素、劍麻素、橙皮素-7-葡萄糖苷、三葉草素、槲皮苷、蘆丁等）顯示出下調(diào)趨勢，其中，蘆丁的表達(dá)下調(diào)幅度最大（圖6）。在類黃酮生物合成途徑中，發(fā)現(xiàn)許多TF可調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。此外，在高氮條件下，C在初級(jí)和次級(jí)代謝中的分布可能是類黃酮生物合成下降的原因。
圖6 苯丙素和類黃酮的生物合成途徑
7. 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析
基于Pearson相關(guān)分析（系數(shù)>0.9，P<0.05），篩選與初級(jí)代謝和次級(jí)代謝相關(guān)的基因、蛋白質(zhì)和代謝物（圖7）。獲得5個(gè)hub基因和3個(gè)hub蛋白，其中MD07G1172700（編碼PAL）包含在次級(jí)代謝中，MD05G1222800（編碼argD）、MD16G1227200（編碼leuC）、MD01G1174400（編碼GLUD1_2）、MD02G1207200（編碼tktA）、PFK、gapN，而HK則包含在初級(jí)代謝中。這些hub基因和蛋白質(zhì)之間存在著相對(duì)較多的正相關(guān)節(jié)點(diǎn)。
圖7 參與初級(jí)和次級(jí)代謝途徑的基因、蛋白質(zhì)和代謝物的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)
總結(jié)
高氮增加了果實(shí)對(duì)15N的吸收和調(diào)節(jié)能力，降低了C在果實(shí)中的分配率，從而導(dǎo)致蘋果果實(shí)的總N增加，總C和C/N比率降低。高氮破壞了蘋果C?N平衡，降低了蘋果果實(shí)的可溶性糖和總黃酮含量，進(jìn)而使果實(shí)品質(zhì)惡化。基于多組學(xué)分析，揭示了高氮對(duì)初級(jí)代謝和次級(jí)代謝互作網(wǎng)絡(luò)。高氮調(diào)節(jié)了蘋果果實(shí)中基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)，抑制了碳水化合物和黃酮類化合物的積累，更多的碳骨架被用來合成氨基酸及其衍生物并轉(zhuǎn)移到氮代謝中。本研究揭示了高氮導(dǎo)致蘋果果實(shí)糖和類黃酮含量下降的機(jī)理，并獲得了關(guān)鍵候選基因和蛋白質(zhì)。
參考文獻(xiàn)
Wang F , Ge S , Xu X , et al. Multiomics Analysis Reveals New Insights into the Apple Fruit Quality Decline under High Nitrogen Conditions[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2021, 69(19).
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