百邁客合作單位中山大學在化學期刊Angew. Chem. Int. Ed上發(fā)表關(guān)于偶聯(lián)臨床鐵螯合劑的線粒體靶向錸(I)配合物，以期達到同時破壞線粒體代謝和細胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)的目的，并從表觀組學揭示其抗腫瘤效果，該研究提供了一種通過干預(yù)線粒體代謝和鐵穩(wěn)態(tài)來調(diào)節(jié)癌癥表觀基因組的抗癌新策略。其中RNA-seq數(shù)據(jù)差異及功能富集分析等由百邁客完成，此外百邁客業(yè)務(wù)還包括單細胞轉(zhuǎn)錄組、空間轉(zhuǎn)錄組、單細胞ATAC&GEX、單細胞免疫組庫等，有興趣的老師可以聯(lián)系當?shù)劁N售。
英文題目：Recoding Cancer Epigenome by Intervening Metabolism and Iron Homeostasis with Mitochondria-Targeted Re(I) Complexes
中文題目：通過線粒體靶向Re(I)復合物干預(yù)代謝和鐵穩(wěn)態(tài)來記錄癌癥表觀基因組
期刊雜志：Angew. Chem. Int. Ed
影響因子：15.336
合作單位：中山大學
原文鏈接：https://international.biocloud.net/zh/article/detail/32634290
導讀
表觀遺傳修飾主要包括翻譯后組蛋白修飾、DNA甲基化修飾和RNA修飾，這些修飾通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)影響基因表達。表觀遺傳修飾機制包括修飾轉(zhuǎn)移酶、修飾識別蛋白和去修飾轉(zhuǎn)移酶，分別用于添加、識別和去除這些修飾位點。其中組蛋白去乙?；?histone deacetylases, HDACs)和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)抑制劑已被證實可用于臨床。組蛋白和RNA去甲基化酶也成為有前景的抗癌靶點。有趣的是，DNMTs和HDACs的抑制劑表現(xiàn)出協(xié)同抗癌作用，和組蛋白甲基化引導m6A修飾共轉(zhuǎn)錄，表明這些表觀遺傳修飾密切相關(guān)。三陰性乳腺癌(TNBC)以雌激素、孕激素和HER-2基因缺失為特征，因其死亡率高、預(yù)后差，是乳腺癌死亡的主要原因。最近的研究表明，表觀遺傳修飾在TNBC（三陰乳腺癌）的進展和治療中發(fā)揮重要作用。
研究表明組蛋白和RNA去甲基酶有希望成為有效的抗腫瘤靶標。表觀遺傳調(diào)節(jié)涉及到多種組蛋白、DNA和RNA修飾相關(guān)蛋白的協(xié)同作用，同時調(diào)控這些修飾有可能發(fā)揮協(xié)同抗癌作用。然而，許多表觀遺傳調(diào)節(jié)蛋白尚無有效的抑制劑/激活劑，因此，發(fā)揮這些修飾的協(xié)同作用面臨巨大挑戰(zhàn)。最近研究發(fā)現(xiàn)，干擾線粒體代謝和鐵穩(wěn)態(tài)是非常有前景的抗癌策略。線粒體代謝中的中間產(chǎn)物是組蛋白/DNA/RNA去甲基化酶的輔因子或天然的抑制劑；而鐵則是這些生物大分子Fe(II)/2-氧代戊二酸依賴性去甲基酶的活性中心。
本文設(shè)計了偶聯(lián)臨床鐵螯合劑的線粒體靶向錸(I)配合物，以期達到同時破壞線粒體代謝和細胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)的目的。其中，DFX-Re3可以將細胞中的鐵重新定位到線粒體，并干擾線粒體代謝，包括與表觀遺傳修飾密切相關(guān)的關(guān)鍵代謝物，并對三陰性乳腺癌表現(xiàn)出高選擇性殺傷效果。此外，鐵的重新定位導致Fe(II)/2-氧代戊二酸依賴性去甲基酶的下調(diào)。結(jié)果顯示，DFX-Re3可以同時提高DNA、RNA和組蛋白的甲基化水平，最終改變RNA聚合酶II的活性以及基因表達圖譜（RNA測序）。機制研究表明DFX-Re3可以誘導細胞免疫原性凋亡，并在體內(nèi)表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性。該研究提供了一種通過干預(yù)線粒體代謝和鐵穩(wěn)態(tài)來調(diào)節(jié)癌癥表觀基因組的抗癌新策略。
研究方法與材料
研究方法：
（1）線粒體靶向錸(I)配合物合成與表征，主要加入臨床鐵螯合劑脫鐵石(DFX)；
（2）DFX-Re3在 MDA-MB-231 cells中定位實驗；
（3）ICP-MS測定MDA-MB-231細胞內(nèi)鐵的分布；
（4）WB檢測DFX-Re3對甲基化組蛋白H3表達影響；
（5）通過RNA-seq檢測FX-Re3對MDA-MB-231 cells轉(zhuǎn)錄組表達譜的改變；
研究材料:
MDA-MB-231 cells（三陰乳腺癌）、MCF-7 cells(乳腺癌) 、MCF-10A cells(正常乳腺上皮細胞)
研究結(jié)果
1、線粒體靶向錸(I)配合物DFX-Re3合成與表征
文章設(shè)計了三個線粒體靶向錸(I)配合物，其中加入了一種臨床鐵螯合劑脫鐵石(DFX)，以同時干擾線粒體代謝和鐵穩(wěn)態(tài)。其中，DFX-Re3可以將細胞鐵遷移到線粒體，干擾線粒體代謝，包括與表觀遺傳修飾相關(guān)的關(guān)鍵代謝物。
圖1.線粒體靶向靶向錸(I)配合物干擾線粒體和鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)控表觀修飾
在三陰乳腺癌細胞、乳腺癌細胞、正常乳腺上皮細胞毒性實中進一步表明DFX-Re3對TNBC細胞具有選擇性細胞毒性。
表1. DFX-Re3對細胞毒性實驗
2. DFX-Re3影響線粒體代謝和關(guān)鍵表觀遺傳代謝物
基于以上研究，以活性最強的化合物DFX-Re3為模型化合物，研究其抗癌機制。共聚焦顯微鏡顯示，DFX-Re3能有效穿透MDA-MB-231細胞。DFX-Re3和MitoTracker Deep Red具有較高共定位系數(shù)（94%） 。電感耦合等離子體質(zhì)譜實驗顯示DFX-Re3在線粒體中逐漸富集，并且DFX-Re3影響表觀關(guān)鍵代謝物在線粒體中富集。DFX-Re3處理影響多種代謝途徑，包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、嘧啶代謝、嘌呤代謝和戊糖磷酸代謝。
DNA/RNA去甲基化酶和大部分組蛋白去甲基化反應(yīng)以α- kG為輔助因子，琥珀酸(SU)和富馬酸(FU)為抑制因子。SAM是組蛋白/DNA/RNA甲基轉(zhuǎn)移酶的甲基供體，SAH是反應(yīng)產(chǎn)物，是組蛋白/DNA/RNA甲基轉(zhuǎn)移酶的競爭性抑制劑。在DFX-Re3處理的細胞中，α-kG(約1.36倍)和SAH(約21.2倍)下調(diào)，而SU(約1.57倍)和FU(約4.3倍)上調(diào)。超高效液相色譜-質(zhì)譜(UHPLC-MS)顯示，DFX-Re3處理組細胞α-KG水平較對照組降低0.87倍。酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)顯示，DFX-Re3處理的細胞中SAM/SAH的比例增加了25.7倍(5 M, 6 h）。有趣的是,這些代謝物的變化都有利于甲基化水平的提高，DFX-Re3對糖酵解能力和糖酵解儲備具有明顯的劑量依賴性抑制作用。DFX-Re3不僅影響線粒體代謝平衡，還使得細胞內(nèi)整體甲基化修飾水平上調(diào)，那DFX-Re3如何影響線粒體調(diào)控表觀修飾呢？這背后的機理如何呢？繼續(xù)看下文解讀
圖2. DFX-Re3影響線粒體代謝和關(guān)鍵表觀遺傳代謝物
3. DFX-Re3調(diào)控機制
（1）ICP-MS實驗：DFX-Re3將細胞中鐵轉(zhuǎn)移到線粒體
用DFX-Re3孵育細胞后，ICP-MS顯示線粒體中鐵含量增加，而細胞質(zhì)中鐵含量減少。全細胞和細胞核中鐵含量均無明顯變化。未加DFX的Re3對鐵的亞細胞分布無明顯影響。并且，正如預(yù)期的那樣，DFX-Re3在線粒體中積累Fe產(chǎn)生大量ROS，導致細胞生存力下降。
圖3. DFX-Re3調(diào)控鐵穩(wěn)態(tài)平衡
（2）質(zhì)譜實驗：DFX-Re3使甲基化水平上升
由于DFX-Re3可以影響鐵和關(guān)鍵表觀遺傳代謝物的細胞分布，而這些代謝產(chǎn)物與Fe(II)/2-氧戊二酸依賴性去甲基化酶的活性密切相關(guān)，進一步探索DFX-Re3對甲基化水平的影響。DFX-Re3處理后，H3在5個最常見位點的甲基化水平均升高。DFX-Re3處理導致5mC增加。發(fā)現(xiàn)TNBC全基因組低甲基化，但DNA甲基化狀態(tài)改變在TNBC發(fā)生中的作用尚需進一步研究。在DFX-Re3的作用下，[34]5hmC(5-羥甲基胞嘧啶)明顯降低，這與文獻報道TET的抑制會阻止5hmC的形成相一致。在DFX-Re3處理的細胞中檢測到m6A(m6a, mRNA上最普遍的甲基化形式)的增加，這可能歸因于FTO活性的降低。
圖4. DFX-Re3調(diào)控甲基化水平
（3）WB實驗：DFX-Re3改變鐵穩(wěn)態(tài)影響修飾酶的活性
通過免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn)DFX-Re3處理后抑制甲基化組蛋白H3、JMJD2A、TET2、FTO等甲基化修飾酶的表達。細胞質(zhì)中鐵含量的降低，同時這些結(jié)果表明，鐵在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到線粒體可以增加DNA、RNA和組蛋白甲基化水平。
圖5. DFX-Re3改變鐵穩(wěn)態(tài)影響修飾酶的活性
4. RNA-seq: DFX-Re3改變細胞的轉(zhuǎn)錄組表達譜
組蛋白/DNA/ RNA甲基化可以影響染色質(zhì)狀態(tài)和基因轉(zhuǎn)錄，作者使用RNA-seq研究DFX-Re3對轉(zhuǎn)錄組的影響。實驗結(jié)果表明754個基因表達水平發(fā)生顯著變化，其中上調(diào)基因470個，下調(diào)基因284個。功能富集分析（GO、KEGG）顯示，DFX-Re3主要影響與線粒體[37]和表觀遺傳調(diào)控[38]密切相關(guān)的信號通路，包括腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)、forkhead box O, FoxO、細胞凋亡、p53、PIK3/Akt和MAPK信號通路。
基因本體分析顯示，在DFX-Re3處理后，RNA聚合酶II啟動子、染色質(zhì)、生長因子活性、細胞內(nèi)受體信號通路等均發(fā)生了顯著變化。
圖6. DFX-Re3改變細胞的轉(zhuǎn)錄組表達譜
5. DFX-Re3體內(nèi)體外功能驗證實驗：抗癌活性
在體內(nèi)和體外評估了DFX-Re3的抗癌機制。透射電鏡觀察顯示，DFX-Re3 (2 M, 24 h)處理后線粒體明顯膨脹，提示MMP缺失。濃度較高時，細胞核邊緣和中心出現(xiàn)染色質(zhì)凝聚，細胞核碎裂，提示晚期凋亡。Annexin V/碘化丙啶(PI)雙染色顯示，在DFX-Re3處理的樣品中，凋亡早期和晚期細胞比例呈劑量依賴性增加(圖S36)。DFX-Re3激活caspase 3/7, Z-VAD-FMK(泛caspase抑制劑)預(yù)處理可抑制細胞死亡率。與之前的RNA-seq結(jié)果一致，DFX-Re3可以誘導多種免疫相關(guān)基因的表達改變，DFX-Re3誘導免疫相關(guān)基因表達改變。誘導鈣網(wǎng)蛋白調(diào)控，這是免疫原性死亡的重要分子標記。這些結(jié)果表明，DFX- Re3可誘導caspase依賴的免疫原性凋亡。體內(nèi)抗腫瘤實驗中，DFX-Re3未見小鼠死亡或體重明顯減輕，治療結(jié)束時，DFX-Re3未見臟器明顯病理改變。這些數(shù)據(jù)表明，DFX-Re3在體內(nèi)具有高的抗癌作用和低的全身毒性。
圖7. DFX-Re3體內(nèi)體外抗癌活性驗證
研究結(jié)論
該作用機制研究發(fā)現(xiàn)，本設(shè)計具有以下幾個顯著優(yōu)勢：(1) DFX-Re3影響線粒體代謝中與表觀遺傳修飾相關(guān)的代謝物；(2) DFX-Re3將細胞鐵富集于線粒體并誘導線粒體產(chǎn)生大量活性氧；(3) DFX-Re3同時提高組蛋白、DNA和RNA的甲基化水平；(4) DFX-Re3改變轉(zhuǎn)錄組，尤其是RNA聚合酶II的活性；(5) DFX-Re3誘導細胞免疫原性凋亡并在體內(nèi)表現(xiàn)出很高的抗癌活性和低的全身毒性。
本研究提出了一種新的策略來編碼癌癥表觀基因組，并開發(fā)對傳統(tǒng)化療耐藥的腫瘤治療。
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