單細(xì)胞多組學(xué)揭示anti-PD-L1免疫治療聯(lián)合化療在三陰性乳腺癌中應(yīng)答關(guān)鍵的免疫細(xì)胞亞群

單細(xì)胞多組學(xué)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于腫瘤研究，但是單細(xì)胞技術(shù)在腫瘤治療前后取材，特別是治療后很多臨床樣本無(wú)法精準(zhǔn)取到相應(yīng)靶組織，今天給大家推薦的一篇文章，可以給我們帶來(lái)單細(xì)胞技術(shù)在三陰性乳腺癌單抗免疫治療以及單抗聯(lián)合紫杉醇化療的應(yīng)用，全面揭示在三陰性乳腺癌(TNBC)中，聯(lián)合化療和檢查點(diǎn)抑制劑（免疫檢查點(diǎn)阻斷ICB）單細(xì)胞水平的機(jī)制，以及取材指導(dǎo)。

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英文題目：Single-cell analyses reveal key immune cell subsets associated with response to PD-L1 blockade in triple-negative breast cancer

發(fā)表雜志：Cancer Cell

影響因子：31.7

發(fā)表日期：20211013

發(fā)表單位：中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院 北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心

研究背景

免疫檢查點(diǎn)封鎖(ICB)靶向免疫調(diào)節(jié)通路，如PD -1/ PD-L1信號(hào)通路，在部分癌癥患者中實(shí)現(xiàn)了硬腦膜反應(yīng)，盡管有了很好的臨床進(jìn)展，但I(xiàn)CB耐藥的基本機(jī)制仍不清楚。單細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展使全面表征腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的基本特性成為可能，在腫瘤微環(huán)境(TME)中已經(jīng)鑒定出廣泛的T細(xì)胞亞群。

三陰性乳腺癌(TNBC)是一種侵襲性乳腺癌(BC)亞型，治療選擇有限。盡管ICB在TNBC治療中顯示出了希望，但臨床研究觀察到了適度的反應(yīng)，促進(jìn)了ICB聯(lián)合化療的探索。在三陰性乳腺癌(TNBC)中，聯(lián)合化療和檢查點(diǎn)抑制劑（免疫檢查點(diǎn)阻斷ICB）的好處還不是很清楚。盡管ICB在TNBC治療中顯示出希望，但臨床研究觀察到保守的反應(yīng)促進(jìn)了ICB聯(lián)合化療的探索。

2021年10月14日，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院聯(lián)合北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心在國(guó)際期刊Cancer Cell上在線發(fā)表了題為“Single-cell analyses reveal key immune cell subsets associated with response to PD-L1 blockade in triple negative breast cancer”的研究論文，該團(tuán)隊(duì)結(jié)合單細(xì)胞RNA- seq、TCR-seq和ATAC-seq等技術(shù)，研究紫杉醇（paclitaxel，化療）聯(lián)合anti-PD-L1抗體阿替利珠單抗（atezolizumab 免疫治療）治療TNBC（三陰性乳腺癌）患者腫瘤微環(huán)境和外周血中的免疫細(xì)胞動(dòng)力學(xué)，揭示應(yīng)答者和無(wú)應(yīng)答者的免疫特征，紫杉醇化療聯(lián)合阿替利珠單抗免疫治療在TNBC治療中的機(jī)制和相互作用。

圖1. 文章思路和結(jié)論導(dǎo)圖

研究方法

在該課題的研究人員收集了來(lái)自22例TNBC患者（11例接受阿替利珠單抗聯(lián)合紫杉醇化療，11例接受紫杉醇單藥化療）治療前和治療后的78例配對(duì)樣本，通過(guò)整合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、T細(xì)胞受體序列測(cè)序和染色質(zhì)可及性測(cè)序，構(gòu)建了TNBC患者腫瘤微環(huán)境和外周血來(lái)源免疫細(xì)胞的高分辨率轉(zhuǎn)錄組和表觀組動(dòng)態(tài)圖譜。該研究在單細(xì)胞水平上對(duì)來(lái)自接受兩種治療方案的TNBC病人的腫瘤組織和外周血的免疫細(xì)胞動(dòng)態(tài)分析，系統(tǒng)比較了應(yīng)答患者和非應(yīng)答患者的腫瘤微環(huán)境及外周血免疫特征，闡明了免疫細(xì)胞在不同治療方案下的動(dòng)態(tài)變化，揭示了anti-PD-L1免疫治療聯(lián)合紫杉醇化療在TNBC中的作用機(jī)制。

研究結(jié)論

● 在抗PD- L1免疫治療后TNBC中發(fā)現(xiàn)動(dòng)態(tài)免疫細(xì)胞改變;

● CD8-CXCL13和CD4-CXCL13 T細(xì)胞預(yù)測(cè)PD-L1阻斷有效反應(yīng);

● 表達(dá)CXCL9的促炎巨噬細(xì)胞與CXCL13+T細(xì)胞相關(guān)；

● 紫杉醇損害由阿特珠單抗引起的應(yīng)答免疫細(xì)胞的擴(kuò)張；

● 突出了CXCL13+T細(xì)胞在有效應(yīng)對(duì)抗PD-L1療法方面的重要性，并表明通過(guò)紫杉醇療法減少這些細(xì)胞可能會(huì)損害伴隨阿特珠單抗 (Atezolizumab)進(jìn)行TNBC治療的臨床結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)材料

材料：22例TNBC患者（11例接受阿替利珠單抗聯(lián)合紫杉醇化療，11例接受紫杉醇單藥化療），一共78例樣本：治療前15例組織樣本、21例血液樣本；治療后13例組織樣本、20例血液樣本；治療進(jìn)展期2例組織，7例血液樣本。

圖2. 實(shí)驗(yàn)材料與方法

方法：scRNA-seq（10x Genomics）、scTCR-seq、scATAC-seq等

圖3. 實(shí)驗(yàn)患者取材以及預(yù)后信息

本研究通過(guò)兩種治療手段（阿替利珠單抗聯(lián)合紫杉醇化療，紫杉醇化療），在基線、治療開(kāi)始后4周和疾病進(jìn)展時(shí)共采集了78例腫瘤活檢和血液樣本。經(jīng)過(guò)高質(zhì)量的篩選，共獲得了489,490個(gè)高質(zhì)量免疫細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，包括髓系細(xì)胞、固有淋巴細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞。

研究結(jié)果

1. 晚期TNBC患者的免疫細(xì)胞動(dòng)力學(xué)

本研究納入了22例晚期TNBC患者，其中一半采用紫杉醇單藥治療，另一半采用紫杉醇加阿替利珠單抗作為一線治療。根據(jù)有無(wú)乳房腫瘤或轉(zhuǎn)移性腫瘤進(jìn)行收集樣本。腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TILs)和PD-L1已經(jīng)在紫杉醇加atezolizumab治療的腫瘤中進(jìn)行了評(píng)估，因?yàn)樗鼈冊(cè)陬A(yù)測(cè)免疫治療反應(yīng)方面很重要。盡管有反應(yīng)者表現(xiàn)出較高水平的TILs和PD-L1，但并非所有具有這些特征的患者對(duì)抗PD-L1治療均有反應(yīng)。作者團(tuán)隊(duì)利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)來(lái)表征具有不同臨床表現(xiàn)的TNBC患者的免疫特征和動(dòng)力學(xué)，在基線、治療開(kāi)始后4周和疾病進(jìn)展時(shí)，共采集78例腫瘤活檢和血樣。對(duì)活檢樣本進(jìn)行外顯子組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)它們的基因組與癌癥基因組圖譜(TCGA)中常見(jiàn)的人類乳腺腫瘤基因一致。經(jīng)過(guò)質(zhì)量篩選，獲得了489,490個(gè)高質(zhì)量免疫細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，包括髓系細(xì)胞、先天淋巴樣細(xì)胞(ILCs)、T細(xì)胞和B細(xì)胞。有趣的是，B細(xì)胞主要富集于有反應(yīng)性的腫瘤中，而髓細(xì)胞富集于聯(lián)合治療組無(wú)反應(yīng)性的腫瘤中。治療后主要免疫細(xì)胞類型的動(dòng)態(tài)變化，在兩組有效治療反應(yīng)中B細(xì)胞減少，T細(xì)胞增加。

圖4. 晚期TNBC患者不同治療方案的免疫細(xì)胞動(dòng)力學(xué)

基于Pi分析，發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞是最顯著的免疫細(xì)胞類型，可以預(yù)測(cè)對(duì)兩種治療方案的良好反應(yīng)，這與最近關(guān)于B細(xì)胞對(duì)ICB反應(yīng)的預(yù)測(cè)作用的發(fā)現(xiàn)相一致。在Ti分析中，與化療相比，T細(xì)胞在聯(lián)合治療中明顯表現(xiàn)出Ti陽(yáng)性，這表明阿特珠單抗可能通過(guò)提高T細(xì)胞水平來(lái)促進(jìn)有效反應(yīng)。

建立了兩個(gè)指標(biāo)，預(yù)測(cè)指數(shù)(Pi)和治療指數(shù)(Ti)，以系統(tǒng)地研究不同的免疫細(xì)胞類型與臨床反應(yīng)的關(guān)系。Pi測(cè)量基線細(xì)胞比例與腫瘤大小變化之間的相關(guān)性，Ti測(cè)量細(xì)胞比例動(dòng)態(tài)與腫瘤大小變化之間的相關(guān)性。Pi或Ti的陽(yáng)性代表較高的基線水平或相應(yīng)免疫細(xì)胞亞型細(xì)胞比例的增加與治療后腫瘤大小的降低水平較高相關(guān)，從而分別預(yù)測(cè)或介導(dǎo)良好的反應(yīng)。陰性Pi或陰性Ti分別表示相應(yīng)的免疫細(xì)胞亞型預(yù)測(cè)或介導(dǎo)不利反應(yīng)?；赑i分析和在Ti分析中顯示，發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞是最顯著的免疫細(xì)胞類型，可以預(yù)測(cè)對(duì)兩種治療方案的良好反應(yīng)。

2. CD8-CXCL13和CD4-CXCL13在聯(lián)合治療的TNBC腫瘤中擴(kuò)增

上述分析表明，T細(xì)胞可能在PD-L1阻斷治療中發(fā)揮中心作用?；谠?TNBC 腫瘤中的高分辨率 T 細(xì)胞圖譜，確定了兩個(gè)高表達(dá)PDCD1和CXCL13 的T 細(xì)胞簇（CD8-CXCL13、CD4-CXCL13）；三個(gè) T 細(xì)胞群，包括幼稚 (Tn)、活化 (Tact) 和增殖 (Tprf) 亞群，其中包含 CD8 + 和 CD4 +T 細(xì)胞；和幾個(gè)典型的 CD8+ 或 CD4+T 細(xì)胞簇，包括調(diào)節(jié)性 (Treg)、中央記憶 (Tcm)、效應(yīng)器 (Teff)、效應(yīng)器記憶 (Tem)、組織駐留記憶 (Trm) 和粘膜相關(guān)不變 T (MAIT) ) 細(xì)胞子集。除了富含淋巴結(jié) (LN) 的 Tn 和富含肝臟轉(zhuǎn)移部位的 MAIT外，這些 T 細(xì)胞亞群沒(méi)有表現(xiàn)出特別的組織偏好。值得注意的是，CD8-CXCL13 表達(dá)TIGIT、CTLA4和LAG3 的T 細(xì)胞耗竭相關(guān)基因，類似于之前研究中鑒定的 CD8-LAYN，而 CD4-CXCL13 不僅通過(guò)表達(dá)BHLHE40、TOX2和CXCR5表現(xiàn)出 1 型輔助性 T (Th1) 細(xì)胞和濾泡輔助性 ( Tfh ) 細(xì)胞的特征，但也表達(dá)了耗竭標(biāo)記。CD8-CXCL13 和 CD4-CXCL13 的耗竭特征暗示了它們的腫瘤反應(yīng)性，因?yàn)橹暗难芯勘砻?，腫瘤反應(yīng)性 T 細(xì)胞由于持續(xù)的腫瘤抗原刺激而表現(xiàn)出耗竭表型。此外，這兩個(gè)亞群連同T 調(diào)節(jié)細(xì)胞(Treg)，基于匹配的 T 細(xì)胞受體 (TCR) 數(shù)據(jù)顯示出顯著的克隆擴(kuò)增，進(jìn)一步表明它們的抗原特異性。

為了破譯治療后的免疫細(xì)胞動(dòng)力學(xué)，本文首先研究了紫杉醇對(duì)不同 T 細(xì)胞亞群的調(diào)節(jié)。與無(wú)反應(yīng)者相比，有反應(yīng)者表現(xiàn)出 CD8-CXCL13、CD4-CXCL13 和 Tregs 水平降低，伴隨著紫杉醇治療后 CD8 + Tem、Teff 和 CD4 + Tcm 細(xì)胞水平升高。有趣的是，CD8-CXCL13 和 CD4-CXCL13 在紫杉醇聯(lián)合阿替利珠單抗治療后有反應(yīng)的患者中均擴(kuò)增，導(dǎo)致聯(lián)合治療組中它們的分?jǐn)?shù)高于治療后單獨(dú)紫杉醇。類似地，Ti分析還顯示在應(yīng)答患者中，CD8-CXCL13和CD4-CXCL13細(xì)胞群聯(lián)合治療后出現(xiàn)克隆型擴(kuò)增，在應(yīng)答患者中紫杉醇治療后減少。這些觀察結(jié)果暗示了 CXCL13 +T 細(xì)胞與 PD-L1 阻斷的相關(guān)性。進(jìn)一步利用單細(xì)胞免疫組庫(kù)測(cè)序（scTCR-seq）追蹤對(duì)聯(lián)合治療有反應(yīng)的腫瘤中CXCL13 +T細(xì)胞的譜系起源，發(fā)現(xiàn)它們的擴(kuò)增既包含已存在的克隆，也包含新浸潤(rùn)的克隆。事實(shí)上，考慮克隆TCRs(克隆大小≥2)時(shí)，已有克隆的數(shù)量大于新滲透克隆。因此，在治療后，大量已經(jīng)存在的克隆有助于CXCL13 +T細(xì)胞的擴(kuò)增。在BC小鼠模型中，ICB治療后CD8 + PD-1 + LAG3 +T細(xì)胞增加，進(jìn)一步證實(shí)了CD8- CXCL13與ICB治療的相關(guān)性。此外，也通過(guò)人基底細(xì)胞癌(BCC)的單細(xì)胞數(shù)據(jù)驗(yàn)證，顯示ICB治療后CD8 + 耗盡T (Tex)細(xì)胞增加。

圖5. 腫瘤浸潤(rùn)性 T 細(xì)胞亞群的時(shí)間動(dòng)態(tài)

3. CXCL13 +T細(xì)胞和相關(guān)的 B 細(xì)胞預(yù)測(cè)對(duì)抗 PD-L1 免疫療法的有利反應(yīng)

與對(duì)聯(lián)合治療耐藥的患者相比，有反應(yīng)的患者表現(xiàn)出更高水平的基線 CD8-CXCL13 和 CD4-CXCL13，這意味著 CXCL13+T 細(xì)胞在塑造抗 PD-L1 治療的臨床結(jié)果中的重要性.。Pi 分析還表明，更高水平的 CXCL13 +T細(xì)胞可以預(yù)測(cè)對(duì)聯(lián)合治療的更好反應(yīng)。除了 CXCL13+T 細(xì)胞，Tn-LEF1 盡管在 LN 中具有特定的富集，但也與對(duì)兩種治療方案的良好反應(yīng)有關(guān)?；?TCGA 的分析表明，乳腺腫瘤的浸潤(rùn)性 CD8+ CXCL13 +T 細(xì)胞高于黑色素瘤和肺腫瘤，這與 BC 對(duì) ICB 的響應(yīng)率較低。通過(guò)多色免疫組織化學(xué) (IHC) 染色進(jìn)一步證實(shí)了 CD8-CXCL13 和 CD4-CXCL13 T 細(xì)胞在對(duì)聯(lián)合治療有反應(yīng)的腫瘤中的存在。
TNBC 腫瘤中的 B 細(xì)胞包括兩個(gè)主要亞群，CD19 + B 和血漿 B (pB) 細(xì)胞，并且在聯(lián)合治療組中觀察到的反應(yīng)者基線 CD19 + B 細(xì)胞水平高于無(wú)反應(yīng)者。CD19 +B 細(xì)胞高度表達(dá)CXCR5，CXCL13 ( BCA-1 )的受體，表明它們與 CXCL13 + T 細(xì)胞的潛在聯(lián)系。事實(shí)上，作者觀察到 CD19 + T NBC 腫瘤中對(duì)紫杉醇加阿特珠單抗有反應(yīng)的 B 細(xì)胞與 CD8-CXCL13 和 CD4-CXCL13 T 細(xì)胞。此外，還發(fā)現(xiàn)在人 BCC 中進(jìn)行 ICB 治療后，CD19+ B 細(xì)胞與 CD8 + Tex 細(xì)胞在反應(yīng)性患者中共同擴(kuò)增。此外，與CD8 + CXCL13 +T細(xì)胞稀少的TCGA BRCA腫瘤相比，B細(xì)胞marker基因CD79A和CD19 以及CXCR5在含有大量 CD8 + CXCL13+T細(xì)胞的TCGA BRCA 腫瘤中高表達(dá)。通過(guò)比較應(yīng)答性和非應(yīng)答性腫瘤中B細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組差異，發(fā)現(xiàn)應(yīng)答性腫瘤中富含高表達(dá)基因的B細(xì)胞參與了抗原處理和遞呈、干擾素(IFN)-g應(yīng)答和T細(xì)胞激活的通路。相比之下，在無(wú)應(yīng)答的腫瘤高表達(dá)基因中富集的B細(xì)胞參與了B細(xì)胞激活、免疫球蛋白的產(chǎn)生和體液免疫應(yīng)答的通路。因此，B細(xì)胞在抗腫瘤免疫中的作用可能主要是激活CXCL13 +T細(xì)胞。

圖6. TNBC腫瘤中B細(xì)胞亞群的特點(diǎn)和動(dòng)態(tài)變化

4.?聯(lián)合治療后，Bfoc和LTi細(xì)胞在TNBC腫瘤中一致擴(kuò)增

研究發(fā)現(xiàn) CD19 ^+??B 細(xì)胞包含未顯示特定組織富集的幼稚 B (Bn)、記憶 B (Bmem)、Bfoc、增殖 Bmem 和增殖 Bfoc 亞群的異質(zhì)亞群。值得注意的是，Bn，Bmem和Bfoc細(xì)胞主要富集在響應(yīng)于紫杉醇聯(lián)合阿替利珠單抗但不是在腫瘤響應(yīng)于紫杉醇。

Bfoc 細(xì)胞的特征在于MEF2B、BCL6、RGS13和NEIL1的高表達(dá)。在兩個(gè)治療組中，響應(yīng)者的基線 Bfoc 水平明顯高于無(wú)響應(yīng)者， Pi 分析還顯示了 Bfoc 與有利的臨床反應(yīng)之間的聯(lián)系。對(duì)于 B 細(xì)胞動(dòng)力學(xué)，發(fā)現(xiàn)在接受紫杉醇治療的應(yīng)答者中 Bfoc 降低，但在接受紫杉醇加 atezolizumab 治療的應(yīng)答者中增加，表明 Bfoc 細(xì)胞與 阿替利珠單抗治療的相關(guān)性。重要的是，表征了不同B 細(xì)胞亞群的預(yù)后意義，并揭示了 Bfoc 是與 BRCA TCGA 患者的有利臨床結(jié)果相關(guān)的最重要的 B 細(xì)胞亞型。因此，Bfoc 似乎是對(duì)患者存活和 ICB 免疫治療最重要的 B 細(xì)胞亞群。

Bfoc 與其他免疫細(xì)胞的聯(lián)系（細(xì)胞通訊描繪細(xì)胞互作關(guān)系）。通過(guò)描繪相關(guān)的免疫細(xì)胞亞型，發(fā)現(xiàn) CD4-CXCL13 和 CD8-CXCL13 與 Bfoc 的細(xì)胞比例表現(xiàn)出高度相關(guān)性，尤其是在后處理組中。這種聯(lián)系表明 Bfoc 可能與 CXCL13⁺T細(xì)胞相互作用，在抗腫瘤免疫中發(fā)揮作用。通過(guò)細(xì)胞通訊分析（基于配體-受體對(duì)），發(fā)現(xiàn)CXCR5在 Bfoc 子集中表現(xiàn)出最高的表達(dá)水平，包括 CD40LG-CD40、白細(xì)胞介素 (IL)21-IL21R 和 IL6ST-EBI3 在內(nèi)的多個(gè)對(duì)可能介導(dǎo) Bfoc 和 CD4- CXCL13。有趣的是，以CCR7、IL7R、GPR183、LTB（淋巴毒素）和IL23R表達(dá)為特征的 LTi 樣 ILC3（ILC3-IL7R）也與 Bfoc 高度相關(guān)，并在聯(lián)合治療后與 Bfoc 協(xié)同擴(kuò)增，但在化療后沒(méi)有。值得注意的是，ILC3-IL7R 可以預(yù)測(cè)對(duì)兩種治療方案的有利反應(yīng)，表明其在有效抗腫瘤免疫中的潛在作用。

5.?聯(lián)合治療后，TNBC腫瘤中cDC1（樹突狀細(xì)胞）擴(kuò)增

CXCL13 ⁺T?細(xì)胞在抗 PD-L1 治療中的重要性促使我們研究它們?nèi)绾卧谀承?TNBC 患者中被激活和富集。由于TME 中的髓系細(xì)胞可以潛在地調(diào)節(jié) T 細(xì)胞反應(yīng)，接下來(lái)關(guān)注 TNBC 腫瘤中的髓系細(xì)胞。在這些主要亞群中，觀察到在基線和聯(lián)合治療而非化療治療后，應(yīng)答者的 DCs 水平高于無(wú)應(yīng)答者，支持他們?cè)?ICB 治療中的作用。為了確定 TNBC 腫瘤中 DC 的特定亞群，進(jìn)行了無(wú)監(jiān)督聚類并基于它們的特征基因確定了以CCR7、LAMP3、CCL19、IDO1和PD-L1為特征的漿細(xì)胞樣 DC（pDC）、cDC1、成熟 DC（mDC 或 LAMP3 ^+??DC），和三個(gè)常規(guī) DC2 (cDC2) 子集，包括朗格漢斯細(xì)胞(LCs, cDC2-CD207)、促炎和抗炎 cDC2 (cDC2-CLEC10A, cDC2-FCGR2B)。較高水平的基線 cDC1 和 pDC 可能表明對(duì)紫杉醇的反應(yīng)良好，但這些 DC 亞群都不能表明對(duì)聯(lián)合治療的有利反應(yīng)，這可能暗示 DC 亞群不是有效抗 PD-L1 治療的關(guān)鍵決定因素。

RNA 速度分析，cDC1 和促炎 cDC2 都可以轉(zhuǎn)化為 mDC，與人類肝癌和肺癌的發(fā)現(xiàn)一致，由于它們的轉(zhuǎn)錄相似性，mDC 與 TNBC 腫瘤中的 cDC1 緊密相連以及細(xì)胞比例的相關(guān)動(dòng)態(tài)變化。對(duì)于接受紫杉醇加阿特珠單抗治療的患者，還觀察到，與 cDC1 和 pDC 的增加相反，治療后應(yīng)答者的 mDC 下降，這可能是由于紫杉醇方案選擇性減少了 mDC。重要的是，與單獨(dú)使用紫杉醇相比，在使用紫杉醇聯(lián)合阿特珠單抗治療后有反應(yīng)的患者中發(fā)現(xiàn)了更高水平的 cDC1、mDC 和 pDC，表明他們參與了抗 PD-L1 治療。Ti 分析進(jìn)一步顯示 cDC1 和 pDC 與對(duì)聯(lián)合治療的有利反應(yīng)有關(guān)，但與化療無(wú)關(guān)。值得注意的是，當(dāng)也使用阿特珠單抗時(shí)，紫杉醇治療后 mDC 的減少受到抑制，表明其與 PD-L1 阻斷相關(guān)。mDC 和 cDC1 都表現(xiàn)出與 CD4-CXCL13 協(xié)調(diào)的時(shí)間動(dòng)態(tài)，結(jié)果暗示 CD4-CXCL13 和 CD8-CXCL13 可能都被 cDC1 或 mDC 激活，正如最近的研究所暗示的那樣，同源 CD4 ^+?T 細(xì)胞許可 cDC1 誘導(dǎo) CD8?⁺T?細(xì)胞免疫。

圖7. TNBC腫瘤中樹突狀細(xì)胞的時(shí)間動(dòng)態(tài)

 

6.?巨噬細(xì)胞的表型與 T 細(xì)胞狀態(tài)有關(guān)

與聯(lián)合治療組中的反應(yīng)者相比，無(wú)反應(yīng)者表現(xiàn)出更高的巨噬細(xì)胞 (Mφ) 基線水平，并且富含無(wú)反應(yīng)者的巨噬細(xì)胞高度表達(dá)SPP1、TREM2、FN1和C3，而富含應(yīng)答者中高度表達(dá)CXCL9，MMP9，和PLA2G2D，表現(xiàn)出不同的特征模式。研究已表明TREM2和SPP1已被證明在抗炎腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞 (TAM) 中表達(dá)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞亞群高表達(dá)FCN1、S100A8和S100A9，而巨噬細(xì)胞亞群高表達(dá)CD68、APOE和 C1Q，類似于 TAM 的特征，TNBC 腫瘤中的巨噬細(xì)胞亞群傾向于共表達(dá)經(jīng)典的 M1 和 M2 特征，與最近在人類乳腺癌和肺癌中的發(fā)現(xiàn)一致。兩個(gè)巨噬細(xì)胞亞群，MΦ-CCL2和MΦ-MMP9，以及mDC和其他DC亞型，都是排名最高的免疫亞型，表明它們與CXCL13?⁺T細(xì)胞相關(guān)。Mφ-MMP9 子集高度表達(dá)PLA2G2D、IL2RG和CXCL9，而 Mφ-CCL2 高度表達(dá)CXCL9、CXCL10和CXCL11，其中CXCL9 和 CXCL10 是已知介導(dǎo) T 細(xì)胞募集的趨化因子，它們?cè)?Mφ-MMP9 和 Mφ-CCL2 中的高表達(dá)支持這兩個(gè)巨噬細(xì)胞亞群的促炎特性。

圖8. TNBC腫瘤中巨噬細(xì)胞亞群與CXCL13??⁺T細(xì)胞的聯(lián)系

除了上述基于轉(zhuǎn)錄組的分析外，還檢查了免疫細(xì)胞比例，發(fā)現(xiàn) Mφ-CCL2 和 Mφ-MMP9 也與CXCL13 +T細(xì)胞高度相關(guān)，表明巨噬細(xì)胞的促炎表型可能是由 TME 中的主動(dòng)抗腫瘤免疫反應(yīng)塑造的，Mφ-MMP9 和 CD8-CXCL13 在對(duì)紫杉醇加阿替利珠單抗有反應(yīng)的腫瘤中同時(shí)富集。與 Mφ-CCL2 和 Mφ-MMP9 相比，Mφ-MKI67、Mφ-SLC40A1 和 Mφ-MGP 的基線水平與 Tregs 呈正相關(guān)，而 Mφ-CX3CR1、Mφ-TUBA1B 和 Mφ-FOLR2 與 Treg 呈負(fù)相關(guān)。發(fā)現(xiàn)紫杉醇方案選擇性地減少了Mφ-CCL2和Mφ-MMP9的促炎巨噬細(xì)胞，但增加了反應(yīng)性患者的免疫抑制巨噬細(xì)胞，而atezolizumab似乎對(duì)巨噬細(xì)胞亞群影響不大。這些發(fā)現(xiàn)表明紫杉醇可能具有免疫抑制性 TME。

發(fā)現(xiàn)血液中較高水平的骨髓細(xì)胞（其中單核細(xì)胞主要占主導(dǎo)地位）可以預(yù)測(cè)對(duì)兩種治療方案的有利反應(yīng)。血液中的單核細(xì)胞似乎可以部分反映 TME 的免疫特征，值得注意的是，沒(méi)有在血液中檢測(cè)到 cDC1，而是觀察到在反應(yīng)性腫瘤中聯(lián)合治療后 cDC2 的增加。

7. CD8-CXCL13在抗pd – l1治療后細(xì)胞毒性增強(qiáng)

考慮到 CXCL13 + T 細(xì)胞在抗 PD-L1 治療中的重要性，接下來(lái)檢查了它們的治療誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄動(dòng)力學(xué)?；?RNA 速度和 TCR 分析，CD8-CXCL13 顯示出與 CD8 + Tem 細(xì)胞的譜系聯(lián)系。轉(zhuǎn)錄組分析表明IFNG、GZMK、GZMA和CD44 的效應(yīng)和記憶相關(guān)基因；TBX21、BHLHE40和BCL6 的轉(zhuǎn)錄因子 (TF) ；CD28和ICOS 的共刺激分子；以及 HLA 基因和整合素而耗盡相關(guān)的基因，包括被上調(diào)HAVCR2，LAYN，TIGIT，和LAG-3，CD8-CXCL13 的表型轉(zhuǎn)變也反映在其耗竭細(xì)胞評(píng)分降低和效應(yīng)記憶細(xì)胞評(píng)分增加。此外，治療后 CD8-CXCL13 中上調(diào)的基因參與了 T 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、抗原加工和呈遞以及 IFN-γ 介導(dǎo)的信號(hào)通路的正調(diào)節(jié)途徑，進(jìn)一步表明其在 PD-L1 阻斷治療后增強(qiáng)的效應(yīng)特性。

單細(xì)胞 ATAC-seq (scATAC-seq) 分析以檢查染色質(zhì)可及性的變化，從五個(gè)樣本中獲得了 30,758 個(gè)免疫細(xì)胞的數(shù)據(jù)，包括來(lái)自接受紫杉醇加阿特珠單抗治療的反應(yīng)性患者的配對(duì)樣本?；谖覀儗?duì) scATAC-seq 和單細(xì)胞 RNA-seq (scRNA-seq) 數(shù)據(jù)的綜合分析（STAR 方法），確定了免疫細(xì)胞亞型。不同亞群的特征基因的染色質(zhì)可及性證實(shí)了它們的細(xì)胞身份。CD8-CXCL13 細(xì)胞的表觀遺傳特征，顯示 T 細(xì)胞耗竭標(biāo)志物的特定富集，包括PDCD1、LAG3和CTLA4與之前在小鼠模型、人類黑色素瘤和非小細(xì)胞肺癌中的研究所表征的CD8 + Tex 細(xì)胞一致。與染色質(zhì)可及性特征中的其他 T 細(xì)胞亞型相比，CD8-CXCL13 和 CD8 + Tem 彼此更相似，這證實(shí)了它們?cè)谧V系分化的連續(xù)譜中的聯(lián)系。具體而言，CD8-CXCL13 和 CD8 + Tem 在IFNG、GZMK和PDCD1基因座中含有開(kāi)放染色質(zhì)區(qū)域 (OCR) 。然而，CD8-CXCL13顯示來(lái)自一個(gè)不同的細(xì)胞狀態(tài)CD8+ TEM，由于在它們的富集同時(shí)進(jìn)行識(shí)別CXCL13，CTLA4和LAYN。

圖9. 聯(lián)合治療后反應(yīng)性腫瘤中T細(xì)胞亞群的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和表觀遺傳動(dòng)力學(xué)

通過(guò)比較聯(lián)合治療前后的配對(duì) scATAC-seq 數(shù)據(jù)，檢查了 CD8 + Tem、CD8-CXCL13 和 CD4-CXCL13染色質(zhì)可及性的全局動(dòng)態(tài)。每個(gè) T 細(xì)胞亞群中差異 OCR 和相關(guān)基因的表征表明 CD8-CXCL13 細(xì)胞的效應(yīng)子和記憶特性增強(qiáng)，其在CD44、CXCR4、KLRG1、XCL2、CST7、ICOS和CD28 中的可及性增強(qiáng)，而在衰竭相關(guān)的基因，如CREM和MYO7A。此外，差異可及峰中過(guò)度表達(dá)的 TF 結(jié)合基序（TFBMs）也證實(shí)了 CD8-CXCL13 的表型變化，CREM和RBPJ 的 TFBMs傾向于在預(yù)處理組中富集，而TBX21、EOMES和PRDM1 的那些富集在后處理組。因此，染色質(zhì)可及性動(dòng)力學(xué)揭示的發(fā)現(xiàn)與基于轉(zhuǎn)錄組的分析結(jié)果一致，兩者都支持聯(lián)合治療后 CD8-CXCL13 增強(qiáng)的效應(yīng)特性。

血液中的 T 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)增殖的 T 細(xì)胞在基線時(shí)在應(yīng)答者中富集，但在聯(lián)合治療后減少，可能是由于紫杉醇的影響。值得注意的是，沒(méi)有觀察到血液中的CXCL13 +T細(xì)胞，但發(fā)現(xiàn)血液中的 CD8 + Tem 細(xì)胞與腫瘤 CD8-CXCL13 共享更高水平的 TCR 克隆，并且在接受聯(lián)合治療的患者響應(yīng)中也表現(xiàn)出升高的遷移指數(shù)。這些觀察表明，在 PD-L1 阻斷治療后有反應(yīng)的患者中誘導(dǎo)了可檢測(cè)的全身免疫反應(yīng)。

總結(jié)

本文通過(guò)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、單細(xì)胞ATAC、單細(xì)胞免疫組庫(kù)技術(shù)揭示anti-PD-L1免疫治療聯(lián)合化療在三陰性乳腺癌中應(yīng)答關(guān)鍵的免疫細(xì)胞亞群，在TNBC腫瘤中，紫杉醇方案可以選擇性地減少關(guān)鍵的抗腫瘤免疫細(xì)胞，但提高免疫抑制巨噬細(xì)胞，因此可能不利于伴隨阿特珠單抗。在紫杉醇加 atezolizumab 治療后，Bfoc 而不是 pB 細(xì)胞與LTi細(xì)胞、CXCL13? +T 細(xì)胞和 cDC1 協(xié)同擴(kuò)增，B 細(xì)胞可能通過(guò)與 CD4-CXCL13 相互作用并激活 CD4-CXCL13 來(lái)促進(jìn)抗腫瘤免疫，CD4-CXCL13 可以幫助通過(guò) cDC1 啟動(dòng) CD8-CXCL13?？偟膩?lái)說(shuō)，本文突出了CXCL13? +T細(xì)胞在有效應(yīng)對(duì)抗PD-L1療法方面的重要性，并表明通過(guò)紫杉醇療法減少這些細(xì)胞可能會(huì)損害伴隨阿特珠單抗 (Atezolizumab)進(jìn)行TNBC治療的臨床結(jié)果。