引言
2021年12月4日，大連海洋大學(xué)海洋科學(xué)與環(huán)境學(xué)院在JCR Q1區(qū)期刊《Water Research》上發(fā)表了題為“Metagenomics combined with comprehensive validation as a public health risk assessment tool for urban and agricultural run-off”的研究論文，該論文提出了一個由病原體篩選、病原體基因分型和風(fēng)險評估三個階段組成的公共健康風(fēng)險評估流程：1）運用宏基因組測序、微流控芯片和qPCR對病原體進行篩選，2）多位點序列分型(MLST)或常規(guī)PCR進行病原菌分離和基因分型；3）對宏基因組數(shù)據(jù)的毒力基因進行致病性評估。
譯名：宏基因組學(xué)結(jié)合綜合驗證作為城市和農(nóng)業(yè)徑流公共健康風(fēng)險評估工具
期刊：Water Research
影響因子：11.236
發(fā)表時間：2021年12月4日
合作單位：大連海洋大學(xué)海洋科技與環(huán)境學(xué)院
研究方法：宏基因組測序；微流控芯片；qPCR；MLST分型
研究背景
水生病原體可引起嚴重疾病，如霍亂、鉤端螺旋體病、傷寒或腹瀉。鑒于這些新出現(xiàn)的疾病的不可預(yù)測性和高度多樣性，水傳播病原體監(jiān)測的關(guān)鍵挑戰(zhàn)之一是優(yōu)先為局部暴發(fā)做好準備。為應(yīng)對這些挑戰(zhàn)，該研究分三個步驟進行公共衛(wèi)生風(fēng)險評估：潛在病原體篩選、病原基因型確認、與當?shù)嘏R床資料比較。
摘要
研究者選擇了兩個具有潛在公共衛(wèi)生問題的地區(qū)(東港和湛江)進行了宏基因組測序，對毒力基因進行了致病性評估。結(jié)果表明，共檢測到90多種細菌病原體，其中56種含有毒力基因。在東港，發(fā)現(xiàn)了一株致病性不動桿菌屬(Acinetobacter sp.)，在2018年和2020年達到了較高的豐度，所有致病性弧菌都在2019年10月達到頂峰。在湛江，鮑曼不動桿菌（A. baumanni）等腸桿菌科細菌種類在2019年和2020年大量存在，而氣單胞菌屬（Aeromonas）和弧菌屬（Vibrio spp）在2017年11月濃度達到頂峰。通過MLST對40個菌種進行了分離與分型，其中一半是臨床上的流行基因型。此外，在2017年采集的水樣中發(fā)現(xiàn)了非洲豬瘟病毒(ASFV)，這在中國首次報告非洲豬瘟（2018年）之前，還檢測到甲型肝炎病毒(HAV)和腸道病毒71型(EV71)等RNA病毒，濃度分別在2020年4月和2018年4月達到峰值。HAV和EV71的動態(tài)與當?shù)亓餍汹厔菀恢?。最后，基于毒力基因圖譜，該研究確定了兩個城市污水中的風(fēng)險水平。這一工作流程說明了對當?shù)亓餍胁≡缙陬A(yù)警的可能性，有助于提前為當?shù)氐奶囟ú≡w做好準備。
研究方法
采樣點：東港市大洋河(DY)和東溝(DG)，湛江城區(qū)(DA)和農(nóng)業(yè)區(qū)(DB)
采樣時間：2017-2020年間，每年采集兩次水樣（半年一次）
檢測方法：MLST基因分型，微流控芯片篩選，病毒基因分型，宏基因組測序分析
實驗流程：
圖1.廢水中新出現(xiàn)病原體風(fēng)險評估的工作流程示意圖。
工作流程包括潛在病原體的篩選、病原體基因分型和風(fēng)險評估。
主要研究結(jié)果
1.東港水樣中潛在致病菌的篩選
在宏基因組數(shù)據(jù)中，89.3%的reads被分配到細菌中。參考毒力因子數(shù)據(jù)庫(VFDB)，使用MetaPhlAn2對每個樣品進行分類鑒定以進一步研究潛在病原體。
在DY的宏基因組數(shù)據(jù)中大量檢測到40種病原體，包括水傳播致病菌和呼吸道致病菌。2019年后，鮑曼不動桿菌、副溶血性弧菌、霍亂弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、肺炎克雷伯菌、腸沙門氏菌、結(jié)核分枝桿菌和空腸彎曲桿菌等幾種檢測到的病原體的相對豐度有所增加。相比之下，其他物種在2017年至2020年期間有所減少，例如韋羅尼氣單胞菌、嗜肺氣單胞菌和邦格里沙門氏菌(圖2B)，隨后培養(yǎng)實驗，檢測出其中32種細菌。
在DY數(shù)據(jù)中，城市污水中的細菌組成在2017年至2018年期間保持穩(wěn)定(圖4)。此后，變形桿菌的相對豐度在2019年4月至2019年下降到17.3%，但在2020年9月后成為優(yōu)勢類群。宏基因組數(shù)據(jù)中共檢測到76種細菌病原體，其中32種用于可視化(圖2D)。致病性不動桿菌屬在2018年和2020年達到了較高的相對豐度，所有致病性弧菌都在2019年10月達到頂峰，其他病原體的相對豐度沒有明顯的波動。在32個選定的細菌病原菌中，在不同采樣時間的培養(yǎng)檢測中獲得17種(圖2D)。在研究期間，結(jié)核分枝桿菌、梅毒螺旋體和腸炎沙門氏菌的相對豐度保持不變，它們分別是結(jié)核病、梅毒和傷寒/副傷寒的臨床病原體。
圖2. 東港市農(nóng)業(yè)(DY)和城市污水(DG)采樣點細菌群落2017-2020年動態(tài)
A：DY細菌群落相對豐度；B：DG中細菌群落相對豐度；C：DY樣品中細菌病原體的動態(tài)；D：DG樣品中細菌病原體的動態(tài)
2.東港地區(qū)細菌病原菌基因分型
對單個菌種進行MLST基因分型，以確定是否屬于致病基因型。共分離出16種細菌進行MLST，東港地區(qū)霍亂弧菌和副溶血性弧菌分別鑒定出3個和5個序列類型（STs），其中僅副溶血性弧菌ST3在當?shù)嘏R床中被確認。7個肺炎克雷伯菌STs（包含ST11和ST23）被發(fā)現(xiàn)，并且在當?shù)蒯t(yī)院相關(guān)感染中占主導(dǎo)地位。檢出5株嗜肺鏈球菌，但未檢出臨床病例，臨床和環(huán)境標本中均檢出北京分支(ST4)結(jié)核分枝桿菌，環(huán)境中的腸鏈球菌ST34和ST19在當?shù)鼗颊咧斜粰z出。對于其他病原體，除陰溝腸桿菌外，每種都檢測到6種STs，且至少有一種STs出現(xiàn)在臨床中。雖然一些致病基因型在當?shù)氐呐R床樣本中沒有被鑒定出來，但它們是普遍存在的，如金黃色葡萄球菌ST7，因此仍需要進一步的研究。
3.東港水樣中致病病毒的篩選
選擇了60種與公共衛(wèi)生風(fēng)險相關(guān)的致病病毒，其中，通過將宏基因組reads比對到參考基因組確認了20種DNA病毒，用微流控芯片對40種RNA病毒進行了篩選，最后通過qPCR檢測確認。
在DY發(fā)現(xiàn)了非洲豬瘟病毒(ASFV)和豬痘病毒(Swinpox Virus)等幾種病毒。ASFV在2017年10月被檢測到，并在2018年達到頂峰(圖6A)，并通過qPCR證實。qPCR在2018年4月后連續(xù)檢測到ASFV，其中2018年4月的病毒載量為3.0×103拷貝/L。在DG地點未檢測到ASFV和Swinpox病毒，在兩個地點均未檢測到其它人畜共患病DNA病毒。通過高通量微流控芯片檢測檢測了40種致病性RNA病毒的存在。DY樣品中，經(jīng)qPCR確認，2019年僅檢測到諾如病毒、流行性腮腺炎病毒、鼻病毒和Human herpesvirus 6病毒。DG樣品中，2017年至2019年在樣本中檢測到human enterovirus 71 (EV71)，2020年4月檢測到Coxsackievirus 16 (CA16)。
4.東港水樣中病毒基因分型研究
對陽性樣本進行病毒基因分型，使用濃縮的DNA樣本對DY 2017和2018年水樣中ASFV B646L基因進行PCR擴增。從DY和其他國家的32個ASFV B646L序列數(shù)據(jù)中檢測到的B646L的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，前者與從遼寧和其他東歐國家的死豬中獲得的第一個ASFV分離物(CN201801/2018) 在基因上是相同的。對東港市手足口病流行時2019年4月達到峰值(5.8×102拷貝/L)的EV71濃度進行了定量檢測(圖3B)，其中EV71的VP1基因PCR為陽性，系統(tǒng)發(fā)育分析證實東港EV71屬于在遼寧省流行的C4a型，但PCR未擴增出CA16基因片段。在DG樣品中，通過qPCR檢測，從2018年10月連續(xù)檢出了甲型肝炎病毒(HAV)，峰值在2020年4月(4.7×103拷貝/L)(圖5C)，這與甲型肝炎病例大幅增加的時間吻合。進一步通過PCR擴增得到甲型肝炎病毒VP3/P2A區(qū)，對100個公開提供的甲型肝炎病毒基因組系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)DG中甲型肝炎病毒與大連分離株DL3(圖5C)有遺傳關(guān)系。其余陽性檢測的病毒可能是由于病毒豐度低所致未被常規(guī)PCR擴增出。
圖3.代表病毒的動態(tài)變化和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。
5.湛江水樣中潛在致病菌的篩選
宏基因組數(shù)據(jù)中大約90%的reads與細菌相對應(yīng)。DA樣品中，變形菌門數(shù)量最多，其次是疣微菌門和放線菌(分別為35%和58%)(圖4A)。DB樣品中，變形菌門從2017年的50.1%增加到2020年的84.7%(圖4A)。兩個地點的微生物組成自2018年11月后出現(xiàn)了差異。在每個采樣時間，豐度 top20屬代表了微生物群落的35%到57%(圖5B)。在2019年(5.8%)和2020年(4.8%)采集的樣品中發(fā)現(xiàn)了弧菌屬(Arcobacter)，而氣單胞菌屬(Aeromonas)和弧菌屬(Vibrio Spp)在2017年11月達到峰值(分別為0.43%和4.1%)，在DA中還檢測到其它幾種細菌病原體(圖5C)，所有時間均檢出假結(jié)核耶爾森菌（Yersinia pseudotuberculosis），2018年5月達到峰值(0.00013%)，其他菌種也達到峰值，如不動桿菌屬、肺炎克雷伯菌屬等。基于培養(yǎng)的分析證實，DA和DB位點分別存在22種和18種致病物種(圖5C，D)。對兩個城市的宏基因組數(shù)據(jù)進行直接分類。每個數(shù)據(jù)集中的宏基因組組裝基因組(MAG)數(shù)量從7到23個不等，相對豐度在0.215%到1.325%之間。然而，對MAGs的注釋結(jié)果表明，它們都不含有毒力因子，說明該方法只能檢測高豐度的病原體。
圖4.湛江地區(qū)細菌群落動態(tài)研究
6.湛江水樣細菌病原菌基因分型
在DA和DB中分別鑒定出4種和13種副溶血性弧菌的序列類型 (sequence types，STs)。在10份湛江樣品中有3份分離到ST1740和ST1799。湛江城區(qū)共分離到4株霍亂弧菌STs(ST69、ST1170、ST1171和1株新的STs)，其中ST69屬于O1大流行血清群。在城市和農(nóng)業(yè)樣品中均檢出肺炎克雷伯菌ST23、ST35和ST86。城區(qū)樣品中檢出三株流行基因型ST11、ST34和ST13沙門氏菌，并出現(xiàn)在廣東省臨床樣品中。
7.湛江水樣中病毒的檢測和基因分型
湛江宏基因組數(shù)據(jù)中3.2%的reads分類為DNA病毒序列，其中97.8%對應(yīng)細菌噬菌體。2017年和2019年還檢測到四種人類病原體，其中包括與兒童腹瀉有關(guān)的Tanapox病毒。2018年5月后，湛江也檢測到低豐度的猴痘病毒和Human herpesvirus 6，2019年5月，檢測到很低(0.001%)的Swinpox病毒，可能由于其低豐度然而，qPCR檢測未檢測到上述病毒。對于RNA病毒，使用微流控芯片和qPCR技術(shù)在2018年11月、2019年5月和11月湛江樣品中檢測出諾如病毒，載量分別為3.4×104、1.78×103和2.9×103拷貝/L，2018年11月檢測到豬札幌病毒(Sapovirus)，為3.2×103拷貝/L，但常規(guī)PCR沒有擴增出這些病毒的DNA片段。
8.機會性病原體豐度定量和WGS
兩個城市的樣品宏基因組數(shù)據(jù)中給定病原體在多個點的相對豐度顯著增加。例如，2018年4月，DG樣本中A. baumannii, Acinetobacter lwoffi和 Acinetobacter junii增加了100倍以上，2018年10月，DY樣本中發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基Aeromonas media增加了10倍以上(圖2)。東港水樣的qPCR檢測表明，污水中病原菌豐度在7.1×104~1.33×109拷貝/L之間。2018年4月和2020年4月，A. junii, A. baumannii和A. lowffii三種細菌在DG中的豐度超過了半數(shù)致死量（LD50）水平。
從湛江樣品中選擇了4株無MLST方案的病原菌，A. junii , V.alginolyticus, S. algae 和A. hemolyticus進行全基因組測序（WGS）。結(jié)果表明，V. alginolyticus與本地水產(chǎn)養(yǎng)殖場的菌株有親緣關(guān)系，表明它們是該地區(qū)特有的(圖5A)。S. algae ZJ61與我國山東的4株臨床分離株有親緣關(guān)系，而S. algae ZJ-SH在一個獨立的分支上(圖6B)。結(jié)合75個A. junii基因組進行系統(tǒng)發(fā)育分析，2018年東港水樣分離株JZ20與2020分離株JZ102(圖6C)聚為一類。對57個A. hemolyticus基因組分析，湛江分離株ZJ54與從醫(yī)院分離的SZ3452有親緣關(guān)系(圖6D)，分離株HK30與醫(yī)院的菌株XH900聚在一起。
圖5.根據(jù)Vibrio alginolyticus (A)Shewanella algae (B) Acinetobacter junii (C) Acinetobacter haemolyticus (D)核心基因組序列，
用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹本研究中獲得的分離株用星號表示
9.污水樣本的公共衛(wèi)生風(fēng)險評估
細菌：低風(fēng)險，在宏基因組數(shù)據(jù)中可以檢測到病原體，但不能培養(yǎng)；中風(fēng)險，宏基因組數(shù)據(jù)中檢索到病原體及其關(guān)鍵毒力基因，但沒有分離到致病基因型；高風(fēng)險，在隨后的分離和MLST能確認致病基因型。病毒：中風(fēng)險，qPCR/微流控芯片/宏基因組數(shù)據(jù)檢測到；高風(fēng)險，用傳統(tǒng)的PCR可進一步擴增。
對兩個城市采樣地點的公共衛(wèi)生風(fēng)險進行了評估，通過與VFDB數(shù)據(jù)庫比對，確定了95種參考病原體。主要毒力因子包括(1)毒素，(2)鞭毛和菌毛，(3)脂多糖和抗原，(4)致病島。
24個物種含有關(guān)鍵的毒力因子，這些因子在不同的水樣中情況不同，因此城市和農(nóng)業(yè)水樣有不同的健康風(fēng)險特征。2020年4月收集的東港城市污水總體健康風(fēng)險最高(圖6A)，包含1種病毒病原體高風(fēng)險和6種細菌病原體高風(fēng)險。2019年至2020年，報告的甲型肝炎病例有所上升，同時甲型肝炎病毒的在樣品中濃度很高。從2017年-2020年病例數(shù)增加數(shù)量（183-622例）和病毒檢測量（增加10倍）不一致，可能是因為城市臨床監(jiān)測還沒建立起來，無癥狀或未被識別的患者未被報告，這突顯了環(huán)境監(jiān)測的重要性。此外，農(nóng)業(yè)污水中ASFV、蠟狀芽孢桿菌和腸球菌有高風(fēng)險，需要干預(yù)以保證食品安全。
湛江水樣結(jié)果表明A. baumanni, B. cereus, C. jejuni, E. coli, K. pneumoniae, S. enterica, S. sonii, S. pneumoniae和V. cholerae在城市地區(qū)具有很高的健康風(fēng)險(圖6B)。其中，2018年5月采集的廢水中含有7種高風(fēng)險病原體，Aeromonas sp., B. cereus和V. parahaemolyticus是農(nóng)業(yè)污水的主要關(guān)注對象，湛江的城市和農(nóng)業(yè)廢水中沒有發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險病毒病原體。
圖6.東港(A)和湛江(B)污水樣品中細菌和病毒病原體的公共衛(wèi)生風(fēng)險評價
藍色：低健康風(fēng)險；灰色：中等健康風(fēng)險；紅色：高健康風(fēng)險
總結(jié)
該研究提出了一種同時檢測多種毒力基因的污水公共健康風(fēng)險評估框架，該框架具有很大的病原體環(huán)境監(jiān)測應(yīng)用潛力。廢水監(jiān)測是可視化病原體動態(tài)和提供病原體與疾病之間關(guān)系的重要洞察力的有力平臺。在農(nóng)村，臨床監(jiān)測或報告系統(tǒng)不夠充分，這一風(fēng)險評估工具還可以監(jiān)測農(nóng)村地區(qū)病原體的流行病學(xué)。
該篇論文運用了百邁客云分析平臺進行宏基因數(shù)據(jù)分析，如您有任何疑問，可以討論區(qū)留言或者發(fā)郵件給我們（郵箱地址：tech&@biomarker.com.cn)
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