微生物多樣性測序是對環(huán)境樣品中細(xì)菌（16S rDNA）、真菌（18S/ITS）、功能基因等基因的DNA進(jìn)行特定長度的PCR擴(kuò)增并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序的分析，可實現(xiàn)對環(huán)境樣品中的優(yōu)勢物種、稀有物種和一些未知物種進(jìn)行檢測，精準(zhǔn)解析微生物在種屬水平上的組成和豐度情況，是當(dāng)前研究環(huán)境微生物多樣性及群落組成差異的重要技術(shù)手段。
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中文題目：海洋厭氧氨氧化菌在不同磷酸鹽劑量下處理含氮鹽水廢水的脫氮機(jī)理：微生物群落轉(zhuǎn)變和磷酸鹽結(jié)晶
期刊：Bioresource Technology
影響因子：9.642
發(fā)表時間：2021.04
合作單位：青島大學(xué)
研究方法：16S rDNA測序（百邁客提供）+動力學(xué)分析
摘要
2021年4月，青島大學(xué)在《Bioresource Technology》發(fā)表題為“Deciphering nitrogen removal mechanism through marine anammox bacteria treating nitrogen-laden saline wastewater under various phosphate doses: Microbial community shift and phosphate crystal”的研究論文，該論文主要研究了（1）不同磷酸鹽劑量下MAB（marine anammox bacteria，海洋厭氧菌）的脫氮機(jī)制；（2）微生物群落變化；（3）磷酸鹽沉淀的組成和特征。
文章首先從磷酸鹽對含氮鹽水廢水中MAB主導(dǎo)的厭氧氨氧化過程的影響出發(fā)，發(fā)現(xiàn)MAB的活性通過加入低濃度磷酸鹽增強(qiáng)（5-30 mg/L PO43–P），并且完全去除銨的時間縮短了0.5小時。當(dāng)PO43–P超過160mg/L時，反應(yīng)器內(nèi)形成磷酸鈣鎂沉淀，底物與生物量的接觸受到沉積物的阻礙，MAB的脫氮性能也變差。當(dāng)PO43?-P到達(dá)400 mg/L，氨氮去除率和亞硝酸鹽去除率分別降低至0.45和0.43 kg/(m3·d)。實驗的158天里，MAB始終是優(yōu)勢菌株，但其相對豐度在400 mg/L PO43–P 時下降了15.4%。此外，沉積物的存在刺激了胞外聚合物的產(chǎn)生，當(dāng)PO43–P 的濃度為200 mg/L時，胞外聚合物的最大產(chǎn)量達(dá)到 11.25 mg/g·濕重。
研究背景
厭氧氨氧化（anammox）作為一種新型脫氮工藝，具有節(jié)能、無二次污染等優(yōu)點，在污水處理領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。厭氧氨氧化細(xì)菌可分為淡水氨氧化細(xì)菌（FAB）和海洋氨氧化細(xì)菌（MAB），MAB對鹽分有很大的耐受性，在處理含氮含鹽廢水方面具有巨大的潛力。來自一些沿海工廠（例如水產(chǎn)養(yǎng)殖）的污水含有高濃度的鹽和磷酸鹽，尤其是養(yǎng)殖廢水中還含有大量的氨和亞硝酸鹽氮，排放到環(huán)境水體中會引發(fā)富營養(yǎng)化，城市污水處理廠一般在厭氧氨氧化工藝后進(jìn)行磷回收，因此，殘留的磷會通過污泥回流流入?yún)捬醢毖趸?，影響厭氧氨氧化性能。但關(guān)于無機(jī)磷酸鹽多厭氧氨氧化微生物的影響還不明確，以及磷酸鹽對含氮含鹽廢水中MAB（即Candidatus Scalindua）脫氮的影響尚未清晰。
研究方法
反應(yīng)器：雙層序批式反應(yīng)器（SBR，double-layer sequencing batch reactor），材料為聚甲基丙烯酸甲酯，工作容量為7L，流入體積與反應(yīng)器體積的交換體積比為5/7。
污水制備：青島膠州灣海水（35‰鹽度和19‰氯度）
檢測內(nèi)容：
①反應(yīng)器內(nèi)部溫度，②進(jìn)出水口NH4+-N、NO2–N、NO3–N和PO43–P，③胞外聚合物（EPS），④反應(yīng)器內(nèi)的沉淀物質(zhì)，⑤反應(yīng)器0（S0）、84（S1）、158天（S2）時生物膜上的樣品進(jìn)行16S rRNA測序（百邁客提供）
實驗流程：
圖1.實驗流程圖
主要研究結(jié)果
1 在不同磷酸鹽劑量下MAB脫氮效果
在整個實驗過程中，通過固定進(jìn)水底物濃度和水力停留時間，保持進(jìn)水負(fù)載率恒定，研究了磷酸鹽在158天內(nèi)對MAB脫氮性能的影響。結(jié)果如圖2所示，出水NH4+-N和NO2–N在30天時幾乎完全被去除（圖2a），隨著磷酸鹽濃度增加，出水NO2–N濃度略有增加。當(dāng)PO43–P達(dá)到120 mg/L時，出水NH4+-N增加，NO2–N超過20 mg/L。當(dāng)PO43–P濃度增加到160-400mg/L時，出水NH4+-N隨著進(jìn)水磷酸鹽的增加而顯著增加，最終穩(wěn)定在76.56mg/L，同時出水NO2–N的濃度增加到了131.29mg/L，NO3–N減少到24.82mg/L。
在PO43–P≤80 mg/L時，氨氮去除率（ARE）和亞硝酸鹽去除率（NRE）均保持在90%以上，氨氮去除速率（ARR）和亞硝酸鹽去除速率（NRR）分別為0.91和1.18 kg /(m3·d)（圖2b、c）。當(dāng)進(jìn)水PO43–P為160–400 mg/L時，ARR 和 NRR 分別從0.72和0.90下降到0.45和0.43 kg/(m3·d)，ARE和NRE最終分別下降到50%和35.17%。此外，ΔpH（出水pH-進(jìn)水pH）值開始急劇下降并在0.2上下波動，間接反映了厭氧氨氧化性能的惡化。從化學(xué)計量比也可以得出上述結(jié)果，在300-400濃度下，化學(xué)劑量比都偏離了理論值（1.32和0.26）（圖2e）， ΔNO2–N/ΔNH4+-N和ΔNO3–N/ΔNH4+-N的值分別下降到0.96和0.20。84天時，在SBR中首次發(fā)現(xiàn)了白色沉淀物，并隨著進(jìn)水磷酸鹽用量的進(jìn)一步增加而積累。沉積物的XRD（X射線衍射）圖顯示為磷酸鈣鎂（Ca7Mg2P6O24）。
出現(xiàn)高濃度磷酸鹽抑制MBA脫氮的原因可能是厭氧氨氧化生物膜對磷酸鹽比顆粒污泥更敏感，或者磷酸鹽沉淀的存在干擾了微生物與底物之間的接觸（主要原因）。此外，SBR運行后，出水NH4+-N和NO2–N被完全去除，這說明磷酸鹽沉淀物對MAB無毒害作用。
圖2. 不同磷酸鹽劑量下MAB在158 d內(nèi)的脫氮性能：(a)底物濃度；(b)去除效率；(c)裝載率；(d) pH值變化；(e)化學(xué)計量比
2 不同磷酸鹽劑量下MAB的脫氮特性
如圖3所示，當(dāng)磷酸鹽濃度為0-80 mg/L時，出水NH4+-N幾乎完全被去除，NO2–N≤11 mg/L。其中在5-30 mg/LPO43–P期間，去除銨態(tài)氮的時間從4h減少到3.5h，同時，出水NO3–N在PO43–P為30 mg/L達(dá)到最大值。因此，低劑量的磷酸鹽滿足了MAB的生長需求并增強(qiáng)了其活性。在50-120 mg/L時，完全去除NH4+-N的時間回到了4 h，可能原因：升高的磷酸鹽與厭氧氨氧化酶和底物形成的化合物結(jié)合，導(dǎo)致酶活性降低和反應(yīng)速度變慢，在160–400 mg/L PO43–P時，MAB的脫氮受到嚴(yán)重影響，但在300-400 mg/L PO43–P階段，NH4+-N轉(zhuǎn)化率高于200 mg/L的階段，因為其出水濃度并沒有顯著增加（圖3a），NO2–N和NO3–N則依舊隨著磷酸鹽濃度增加而出水濃度增加，這可能是由于NH4+的吸附。
微生物細(xì)胞和EPS由于其負(fù)電荷可以吸附陽離子，并在20分鐘內(nèi)達(dá)到吸附平衡，運行周期前0.5小時NH4+-N的急劇下降與該結(jié)論一致。一般來說，游離金屬離子的存在會抑制NH4+的吸附。然而，由于形成磷酸鈣鎂沉淀，消耗了Ca2+和Mg2+，增強(qiáng)了NH4+的吸附。300-400 mg/L PO43–P時，根據(jù)磷酸鹽濃度和出水NH4+濃度成正比計算得到理論去除值為65.92和56.85 mg/L，而實際值為83.97和79.79 mg/L，由此計算，相應(yīng)的吸附百分比分別為21.5%和28.8%。
如圖3d所示，ΔNO2–N/ΔNH4+-N 和ΔNO3–N/ΔNH4+-N在前2小時出現(xiàn)不規(guī)則波動，然后趨于穩(wěn)定。然而，在300-400 mg/L時，ΔNO2–N/ΔNH4+-N顯著偏離1.32，這與0-50 mg/L時的情況相反。隨著磷酸鹽濃度的增加，出水pH升高的幅度逐漸變平（圖3b），例如400 mg/L時，ΔpH值僅占不添加磷酸鹽時的33%。如圖3f所示，隨著反應(yīng)時間的延長，底物轉(zhuǎn)化率逐漸降低，在160-400 mg/L階段，由于磷酸鹽沉積物的存在，底物與生物質(zhì)之間的接觸受到阻礙，導(dǎo)致底物轉(zhuǎn)化率較低。因此，在高濃度磷酸鹽的存在下，SBR 中MAB的活性會嚴(yán)重惡化。
圖3 加入磷酸鹽MAB脫氮性能：(a) NH4+-N 濃度；(b) 酸堿度；(c) NO2–N濃度；(d)化學(xué)計量比；(e) NO3–N濃度；(f)底物轉(zhuǎn)化率
3 微生物群落變化
通過16S rRNA研究了不同磷酸鹽濃度下SBR中微生物群落的變化。三個時間的微生物樣品的OTU數(shù)量分別為311、300和297，圖4a揭示了SBR中的主要微生物：Planctomycetes、Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes和Chloroflexi。其中，含有厭氧氨氧化菌屬的Planctomycetes仍處于優(yōu)勢地位，添加磷酸鹽后，S1中的Planctomycetes從初始的44.11%加至55.6%，然后在S2中下降至42.61%，屬水平上同樣。此外，Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes和Chloroflexi的豐富度均由S0的19.36%、11.95%、9.3%和6.53%下降到S1的16.09%、9.31%、4.38%和6.37%，然后上升到S2的19.53%、11.18%、11.59% 和 7.68%。這表明上述4個門與Planctomycetes存在競爭關(guān)系，且Planctomycetes是含鹽廢水中的優(yōu)勢菌種。
在屬水平上，Candidatus Scalindua是Planctomycetes中唯一的厭氧菌，其豐富度首先從41.87%增加到50.11%，然后下降到35.43%（圖4b）。這表明適當(dāng)?shù)牧姿猁}劑量（PO43–P≤120 mg/L）可以促進(jìn)MAB的生長，而高濃度的磷酸鹽則相反。MAB的減少導(dǎo)致總氮去除效率降低，僅次于Candidatus Scalindua的Actinomarinales的豐度從S0的11.4%變?yōu)镾1的8.71%并最終維持在10.46%。S0和S2的Wenzhouxiangella的豐富度沒有明顯變化。Marinicella是一種硫氧化細(xì)菌，可以將NO3?-N轉(zhuǎn)化為N2，其在S2中的相對豐度較S0下降了0.6%。在S2 期間，檢測到新屬Algibacter和Colwellia，豐度分別為5.76%和3.72%，其中Algibacter是從海水中分離出的革蘭氏陰性菌，需要 Mg2+才能生長。在整個過程中沒有觀察到聚磷酸鹽積累生物的存在，表明還原的磷僅用于沉淀和細(xì)菌生長。
圖4 門水平（a）和屬水平（b）微生物分布柱狀圖
同時使用了基于KEGG和COG的PICRUSt 分析功能基因。如圖5a所示，碳水化合物代謝的豐度（9.22-9.28%）相對較高，這表明磷酸鹽對微生物消耗碳源獲取能量沒有明顯影響。氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝、外源生物降解代謝和膜轉(zhuǎn)運的豐度在S1時下降，然后在S2時上升。相反，能量代謝、輔因子和維生素代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞運動的豐度在S1中較高，在S2中較低。能量代謝豐度的下調(diào)表明高濃度磷酸鹽抑制了細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的產(chǎn)生和細(xì)菌的生長。這與Candidatus Scalindua豐度的下降是一致的。此外，復(fù)制重組和修復(fù)（6.71-7.11%）、細(xì)胞內(nèi)運輸、分泌和囊泡運輸（3.95-4.38%）和細(xì)胞運動（3.34-3.79%）的相對豐度在 S1 中上調(diào)，在 S2 中下調(diào)，這表明高劑量的磷酸鹽會破壞微生物細(xì)胞，不利于細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運。
圖5.基于(a) KEGG和(b) COG 數(shù)據(jù)庫的PICRUSt分析
4 EPS的變化
EPS是一種由微生物分泌的高分子聚合物，可以保護(hù)細(xì)菌免受外界有毒物質(zhì)的侵害。一般可分為可溶性EPS（SEPS）、松散結(jié)合型EPS（LB-EPS）和緊密結(jié)合型EPS（TB-EPS），它們的主要成分是蛋白質(zhì)（PN）、多糖（PS）和腐殖質(zhì)。在160 mg/L PO43–P 時，EPS的產(chǎn)量最初從2.74增加到3.66 mg/g 濕重。當(dāng)磷酸鹽濃度超過200 mg/L 時，EPS 的產(chǎn)量急劇增加至11.25，然后降至7.57 mg/g 濕重（圖6）?？傮w而言，與不添加磷酸鹽相比，高磷酸鹽濃度下EPS的產(chǎn)量增加，這可能與沉淀的形成有關(guān)。惡劣的生活環(huán)境迫使微生物產(chǎn)生更多的EPS來保護(hù)自己免受損害，此外，PN/PS比值在160 mg/LPO43–P時達(dá)到最大值16.83，然后隨著磷酸鹽濃度的增加而降低，這意味著微生物細(xì)胞的疏水性降低了。EPS產(chǎn)量的下降可歸因于 MAB在有害情況下對細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的消耗。即由于MAB生物膜被磷酸鈣鎂沉淀覆蓋，內(nèi)部底物稀少，為了維持生理活動，微生物可以降解EPS以獲得能量。而EPS產(chǎn)量的下降不利于MAB抵抗磷的干擾，MAB的活性也有所下降。
圖6.不同磷酸鹽劑量下EPS含量的變化 PN：蛋白質(zhì) PS：多糖
5 磷酸鈣鎂的形成
如上文所述，流出物中的一部分還原磷以Ca7Mg2P6O24的形式沉積，隨著進(jìn)水磷酸鹽用量的增加，生物膜上積聚的白色沉淀物逐漸增多。這可以看作是磷回收的一種手段。至于其他的磷酸鹽礦物，如羥基磷灰石（HAP，Ca5(PO4)3(OH)）和鳥糞石（MAP，MgNH4PO4·6H2O），在SBR的厭氧氨氧化生物膜上未檢測到，這可能與pH值和SBR中Ca含量有關(guān)。
在本研究中，當(dāng)磷酸鹽濃度超過160 mg/L時，氮和磷酸鹽的物質(zhì)平衡被打破，隨著KH2PO4用量的進(jìn)一步增加，進(jìn)水pH值顯著下降。為了使進(jìn)水pH值保持在7.5，加入氫氧化鈉進(jìn)行酸堿中和。隨著氫氧化鈉的注入，在液相中觀察到白色絮狀沉淀。此外，隨著磷酸鹽用量的增加，所需的氫氧化鈉濃度也增加，產(chǎn)生更多的白色絮狀沉淀物，這些白色沉積物會粘附在生物膜上并延遲底物滲透到內(nèi)部生物質(zhì)中，正是由于這些非織造膜載體的存在，MAB可以富集成致密致密的生物膜，而不是漂浮和松散的顆粒。因此，MAB的新細(xì)胞不能以被沉淀覆蓋的顆粒為核，形成更大的顆粒。
鈣在堿性環(huán)境中與磷酸鹽結(jié)合形成磷酸鈣沉淀，然后與鎂結(jié)合形成Ca7Mg2P6O24。此外，生物代謝產(chǎn)生的內(nèi)源性有機(jī)物可能會誘導(dǎo)磷酸鹽生物礦化，但其具體形成機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
總結(jié)
本研究首次探索了含氮含鹽廢水中不同磷酸鹽劑量下MAB的脫氮工藝。MAB的活性在含低濃度磷酸鹽時（0-30 mg/L）增強(qiáng)，高濃度時（160~400 mg/L），NH4+和NO2-的去除率下降，MAB相對豐度下降了15.4%。此外，沉積物的存在迫使微生物產(chǎn)生更多的EPS以保護(hù)自己免受損害。通過低濃度磷酸鹽促進(jìn)MAB的厭氧氨氧化過程或?qū)}廢水脫氮處理有重大意義，SBR中磷酸鈣鎂沉淀的形成，或許為磷元素的回收提供了思路。
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參考文獻(xiàn)：
1.Si P, Li J, Xie W, et al. Deciphering nitrogen removal mechanism through marine anammox bacteria treating nitrogen-laden saline wastewater under various phosphate doses: Microbial community shift and phosphate crystal[J]. Bioresource Technology, 2021, 325: 124707.
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