單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組解析結(jié)直腸癌與肝轉(zhuǎn)移之間的免疫表型

研究背景

本研究對(duì)來(lái)自肝轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的樣本進(jìn)行了單細(xì)胞分析，以解釋了影響TME的因素。通過(guò)對(duì)不同組織中的CD45⁺細(xì)胞分析，發(fā)現(xiàn)M型T細(xì)胞表型與惡性腫瘤相關(guān)，而N型表型與生態(tài)位相關(guān)。樹(shù)突狀細(xì)胞（DC3s）和SPP1⁺巨噬細(xì)胞的一個(gè)亞群也是M型，在肝轉(zhuǎn)移中占優(yōu)勢(shì)，表明其具有促轉(zhuǎn)移的作用。本研究將原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤的免疫表型聯(lián)系起來(lái)，從而有助于了解腫瘤特異性。

研究材料

材料：結(jié)直腸癌患者17例，其中女性6例，男性11例?；颊呤中g(shù)切除來(lái)自原發(fā)性腫瘤和肝轉(zhuǎn)移的新鮮腫瘤和鄰近正常組織樣本（距匹配的腫瘤組織至少2 cm）

方法：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

研究成果

1、CRLM、HCC和CRC的數(shù)據(jù)收集和不同的免疫特征

從101個(gè)匹配的CRLM樣本中分選出CD45⁺細(xì)胞，包括原發(fā)性結(jié)直腸癌（Pri.CT）、鄰近結(jié)腸（Adj.Col）、腸系膜淋巴結(jié)（MLN）、肝轉(zhuǎn)移（Liv.Mets）、鄰近肝臟（Adj.Liv） 和17名初治患者的外周血（圖1A），分別獲得323,444和5,004個(gè)高質(zhì)量細(xì)胞，包括CD4⁺和CD8⁺ T細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷T（NKT）細(xì)胞、NK細(xì)胞、γδ T細(xì)胞、DC、肥大細(xì)胞、B細(xì)胞、3型先天性淋巴細(xì)胞（ILC3）和少量 CD45-細(xì)胞，此外，共鑒定出78個(gè)免疫細(xì)胞亞群（圖1B和1C）。由于原發(fā)性HCC/CRC和CRLM腫瘤同時(shí)分析TME 形成過(guò)程中的相互作用至關(guān)重要，因此本研究結(jié)合了來(lái)自18名未接受治療的非轉(zhuǎn)移性CRC患者的49個(gè)樣本和51個(gè)樣本的scRNA-seq數(shù)據(jù)集。

僅對(duì)來(lái)自原發(fā)性HCC/CRC的正常和腫瘤數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA分析，發(fā)現(xiàn) CD4_Treg-CTLA4、CD8_Tex-LAYN和Mph-C1QC是腫瘤相關(guān)的前三個(gè)簇（p < 0.001，ANOVA檢驗(yàn)；圖2A），并且在HCC和CRC腫瘤相應(yīng)的鄰近部位（圖2B），這表明這些細(xì)胞可能受到惡性腫瘤狀態(tài)的影響。此外，與Adj.Cols和HCC腫瘤相比，Mph-SPP1在CRC腫瘤中富集（圖2B）。KLRB1⁺組織駐留記憶（Trm）CD8⁺?T和MAIT細(xì)胞在HCC腫瘤和Adj.Livs中占優(yōu)勢(shì)，而上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞（IEL）和Mph-NLRP3在CRC腫瘤和Adj.Cols中表現(xiàn)出更高的豐度（圖2A），這表明這些細(xì)胞可能受到所在組織的影響。

2、通過(guò)PhenoAligner解開(kāi)癌細(xì)胞和宿主器官對(duì)TME的影響

使用來(lái)自Pri.CT、Adj.Col、MLN、Adj.Liv和血液的單個(gè)細(xì)胞作為參考，并將來(lái)自 Liv.Mets的每個(gè)免疫細(xì)胞與參考對(duì)齊，以識(shí)別其相鄰的組織類(lèi)型（圖2C）。對(duì)于Liv.Mets中的特定簇，具有高PhenoAligner指數(shù)的組織類(lèi)型可能表明Liv.Mets中的高比例細(xì)胞在所識(shí)別的組織類(lèi)型中具有相似的居住位。

在主要免疫區(qū)室水平中，PhenoAligner顯示Liv.Mets中81% CD45^–細(xì)胞與Pri.CT中的細(xì)胞對(duì)齊（r>0.5，Pearson相關(guān)性；p<0.05，置換檢驗(yàn)）（圖2D）。來(lái)自原發(fā)性腫瘤的肥大細(xì)胞被稱為“惡性腫瘤相關(guān)”（因此稱為“M型”）；Liv.Mets中的NKT和NK細(xì)胞與Adj.Liv的免疫微環(huán)境密切相關(guān)，但與其他組織無(wú)關(guān)，被表征為“生態(tài)位相關(guān)”（因此稱為“N型”），同樣，DC和γδ T細(xì)胞被鑒定為N型；此外，Liv.Mets中的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞與Pri.CT和Adj.Liv具有顯著聯(lián)系，其表型被表征為“組合相關(guān)”（因此稱為“C型”）（圖2D）。

3、CD8⁺?Texs與惡性腫瘤相關(guān)

盡管Liv.Mets中的CD8⁺?T細(xì)胞被指定為N型，但基于PhenoAligner分析（圖3 A和3B），它們的子集顯示出不同的模式。在所有CD8⁺?T簇中，Tex-LAYN和Tex-MKI67被鑒定為M型（圖3A）。Tex-MKI67與Tex-LAYN共享多個(gè)T細(xì)胞受體（TCR）克隆型和相似的基因表達(dá)。因此，Texs主要受惡性細(xì)胞的影響。

從10×5′ VDJ數(shù)據(jù)中獲得了TCR信息，以識(shí)別Liv.Mets和Pri.CT之間的共享TCR，在Pri.CT和Liv.Mets中分別檢測(cè)到的172和149種TCR克隆型中，42種在兩個(gè)腫瘤部位共享（圖3C和3E），表明Tex表現(xiàn)出惡性腫瘤排他性并包含可能識(shí)別腫瘤抗原的TCR。另外，Pri.CT和Liv.Mets之間共享的Texs TCR克隆型也可以在血液中的效應(yīng)記憶T細(xì)胞（Temras）中檢測(cè)到，這表明血液中的Temra克隆可能會(huì)滲入Pri.CT和Liv.Mets。效應(yīng)記憶T細(xì)胞（Tems）和Texs之間觀察到更高程度的TCR共享。RNA速度分析發(fā)現(xiàn)Temras和Tems之間的雙向流動(dòng)（圖3F）。這些觀察表明，Tems表現(xiàn)出高度可塑性和中間性質(zhì)，Tems的這種中間轉(zhuǎn)變可能是CD8⁺?T細(xì)胞腫瘤浸潤(rùn)過(guò)程中的一個(gè)重要橋接步驟，并且可以為先前提出的癌癥-免疫周期增加新的見(jiàn)解（圖 3 G）。

4、結(jié)直腸惡性腫瘤和肝臟生態(tài)位對(duì)CD4⁺?T細(xì)胞亞群有不同的影響

對(duì)CD4⁺?T細(xì)胞進(jìn)行了類(lèi)似的分析，并觀察到Th17、Th1、Treg-IL10和Treg-CTLA4被表征為M型（圖4A和4B）。在組織富集的Treg群體中，Treg-IL10高度表達(dá)腸道常駐Treg標(biāo)志物，包括IL10、IL23R和IL1R1（圖4 C）；Treg-CTLA4高表達(dá)基因包括LAYN、CCR8和TIGIT（圖4C）。此外，與非轉(zhuǎn)移性CRC腫瘤相比，CRLM患者Pri.CT中Treg-IL10和Treg-CTLA4的比例顯著增加（圖4D），表明與非轉(zhuǎn)移性CRC腫瘤相比，具有Liv.Mets的原發(fā)性CRC腫瘤可能表現(xiàn)出更強(qiáng)的免疫抑制生態(tài)位。

Treg-CTLA4和Th1細(xì)胞中的TCR在Pri.CT和Liv.Mets之間顯著共享（圖4F和4E）。在所有CD4⁺?T細(xì)胞簇中，只有Treg-CTLA4在Pri.CT和Liv.Mets之間的STARTRAC-migr指數(shù)高于腫瘤和其他組織之間的指數(shù)（圖4H）。此外，RNA速度分析顯示從Treg-FOXP3到Treg-CTLA4的轉(zhuǎn)變方向（圖4I），表明血液中靜止的Tregs可能遷移到兩個(gè)腫瘤部位，然后在TME中被激活和擴(kuò)張。Treg-IL10和Th17的TCR在Pri.CT和Liv.Mets之間表現(xiàn)出互斥模式（圖4G）。這些觀察表明，Liv.Mets中Treg-IL10和Th17的表型可能是由類(lèi)似于腸道相關(guān)環(huán)境的組織生態(tài)位誘導(dǎo)的。

5、SPP1⁺?TAMs在Liv.Mets中的作用

對(duì)巨噬細(xì)胞的異質(zhì)性進(jìn)行分析。得到14個(gè)亞群，大多數(shù)被表征為N型或C型，只有3個(gè)TAM簇被表征為M型（圖5A）。雖然SPP1⁺?TAM的表達(dá)特征通常存在于非轉(zhuǎn)移性CRC hM13_TAM_SPP1中，但這種特征在非轉(zhuǎn)移性HCC巨噬細(xì)胞中基本上不存在（圖5B），可SPP1⁺?TAMs在Liv.Mets中占主導(dǎo)地位（圖5C）。使用bulk RNA-seq數(shù)據(jù)（GEO：GSE14297）證實(shí)，SPP1基因在Liv.Mets中高表達(dá)（圖5D）。IHC也證實(shí)了該TAM亞群在 Liv.Mets（圖5H）中。

接下來(lái)評(píng)估了這3個(gè)M型TAM亞群的血管生成和吞噬特性。SPP1⁺?TAMs顯示出*高的血管生成評(píng)分，而C1QC⁺?TAMs顯示出*高的吞噬作用評(píng)分（圖5G）。結(jié)果證明了SPP1⁺主要存在于Liv.Mets中以及C1QC⁺的增殖特征，暗示它們?cè)谵D(zhuǎn)移過(guò)程中的重要作用。

6、促炎性DC3在表型上由CRLM中的癌細(xì)胞形成

在CRLM患者中鑒定了10個(gè)DC亞群，并根據(jù)ROGUE指數(shù)計(jì)算了它們的純度（圖6A）。Liv.mets中的cDC2- C1QC細(xì)胞被表征為M型，而Liv.mets中的cDC2-TIMP1細(xì)胞被表征為C型，因?yàn)樗鼈兣cAdj.Liv和MLN相關(guān)（圖6B），這些觀察表明這兩個(gè)cDC2可能在Liv.Mets中具有不同的功能?；诓町惐磉_(dá)分析，cDC2-C1QC表現(xiàn)出更高的C1QA、CD68、CD163和CD14表達(dá)（圖6C和6E）。cDC2-TIMP1高度表達(dá)成熟標(biāo)志物，如CCR7 和血管生成相關(guān)基因，包括EREG、CREM和VEGFA（圖6D和6E）。

最后，比較了CRLM、HCC和CRC數(shù)據(jù)集之間DC的差異（圖6F）。與Liv.Mets和非轉(zhuǎn)移性CRC腫瘤相比，DC3在CRLM的Pri.CT中顯示出更高的頻率（圖6G）。基于對(duì) TCGA、COAD和READ隊(duì)列的生存分析，cDC2中DC3的比例與預(yù)后不良相關(guān)（圖6H）。IHC進(jìn)一步證實(shí)了DC3s的存在（圖6I和6J）。

研究結(jié)論

• 描述了結(jié)直腸癌和肝轉(zhuǎn)移的免疫細(xì)胞表型
• 惡性腫瘤相關(guān)的耗竭和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表現(xiàn)出不同的TCR依賴性
• SPP1⁺TAMs與惡性腫瘤相關(guān)并與肝轉(zhuǎn)移有關(guān)
• DCs主要與宿主器官相關(guān)

 

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