一文讀懂全基因組甲基化測序技術原理及應用

 

技術背景

DNA甲基化是一種在原核和真核生物基因組中常見的復制后表觀遺傳修飾，可以在不改變 DNA分子一級結構的情況下調(diào)節(jié)基因組的功能，其在基因表達、轉(zhuǎn)座子沉默、染色質(zhì)相互作用、細胞分化以及生長發(fā)育過程中起著重要作用。

其形成過程主要是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下，將S-腺苷甲硫氨酸分子上的甲基(CH3-)轉(zhuǎn)移到DNA的CpG兩個核苷酸的胞嘧啶上進行DNA 甲基化修飾，形成 5-甲基胞嘧啶 (5-mC)、N6-甲基腺嘌呤 (N6-mA) 以及7-甲基鳥嘌呤(7-mG)。

DNA 甲基化造成基因沉默的原因大多都是由于轉(zhuǎn)錄受到抑制從而影響了目的基因的表達：（1）啟動子區(qū)域發(fā)生甲基化 ；（2）基因序列中某位點發(fā)生甲基化抑制蛋白的表達 ；（3）染色體結構由于受到 DNA 序列的變化從而變得緊密。

因此，闡明DNA甲基化的動力學和遺傳學及其分子調(diào)控機制，可在基因表達層面上探究動植物的生長發(fā)育及抗逆性機理，為優(yōu)良新品種的培育和遺傳改良研究提供更多理論依據(jù)。

目前應用廣泛的全基因組甲基化檢測方式主要是BS-seq：用亞硫酸氫鹽處理DNA將胞嘧啶殘基（C）轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（U），而5-甲基胞嘧啶殘基（5mC）不會發(fā)生轉(zhuǎn)變。因此可通過測序的手段識別甲基化位點。但是亞硫酸氫鹽處理后DNA會發(fā)生降解，測序長度受限，使得較大的區(qū)域難易被解析。

三代測序平臺則可以在不依賴DNA實驗處理的情況下，根據(jù)信號差來識別甲基化位點信息。其中，PacBio 已經(jīng)實現(xiàn)通過HiFi測序直接檢測 DNA 樣本中 CpG 位點的 5mC甲基化。基于HiFi 的 5mC 檢測能夠在提供既長又準的測序結果的同時，給出準確的單倍型甲基化信息。同時，具有甲基化信息的HiFi數(shù)據(jù)，所占存儲僅增~5%，極大的壓縮了可分析的空間，為表觀遺傳挖掘保駕護航！

技術原理

PacBio平臺主要通過DNA聚合酶與模板鏈結合，在鏈合成的過程中，不同熒光標記的堿基會釋放不同的熒光信號，根據(jù)光的波長與峰值從而判斷堿基類型與順序。聚合酶合成中每個堿基間都存在時間間隔，當模板堿基有修飾時，兩個相鄰的脈沖峰之間的距離就會延長。當IPD比例（兩個相鄰的脈沖峰之間的距離和參考序列距離的比值）明顯大于1 時，可推斷這個位置存在修飾。

技術優(yōu)勢

 

分析方案

測序深度；≥10x。根據(jù)數(shù)據(jù)檢測圖可以看到，當深度達到10X，即可達到很好的檢出效果。

應用場景

（1）全基因組甲基化

對單個樣本進行HiFi測序可檢測整個基因組的甲基化模式，如轉(zhuǎn)錄起始位點的低甲基化。不同組織部位甲基化差異，構建全基因組的甲基化圖譜。

（2）泛基因組甲基化

通過對多個樣本進行測序來確定物種品系間的差異甲基化，從而揭示品系間功能差異的調(diào)控機制。

本研究構建了青鳉（Oryzias latipes）近親繁殖系中12尾材料的基因組，并通過比對構建了青鳉的圖型泛基因組。結果顯示泛基因組總長度為1.3 Gb，大約是其參考基因組的1.8倍。通過泛基因組展示了更大、更復雜的結構變異-“暗變異”，為進一步研究結構變異（SV）如何影響感興趣的表型提供了重要的研究基礎。作者通過構建基因組時的三代測序數(shù)據(jù)，進一步對12尾近親繁殖系的大腦樣本中的CpG甲基化進行了差異研究。結果顯示，甲基化模式在多代中表現(xiàn)一致，說明甲基化是青鳉魚的一種遺傳性狀，能夠持續(xù)多代，并可能影響表型性狀。最后結合RNA等數(shù)據(jù)，表明galm基因甲基化可能性與肝臟表達之間存在顯著相關性。

（3）單體型甲基化

HiFi測序能夠同時分階段讀取母系和父系單倍型，并檢測甲基化。這直接揭示了印記的模式，其中染色體的甲基化狀態(tài)取決于它是從母親還是父親遺傳的。

日本田中魚（Oryzias latipes）作為脊椎動物模式生物有著悠久的歷史。我們利用其異常高的近親繁殖耐受性建立了Medaka近親繁殖Kiyosu Karlsruhe（MIKK）小組：來自單個野生種群的近等基因脊椎動物系的集合[3]。

在與這篇文章一起發(fā)表的配套文章中，我們根據(jù)Illumina短讀序列與最近、完全組裝的參考基因組（日本南部medaka自交系HdrR）的比對，提供了80個個體MIKK面板系[4]的詳細遺傳特征。

盡管這使我們能夠發(fā)現(xiàn)與HdrR相關的MIKK面板中的許多遺傳變異，但該方法不可避免地隱藏了某些變異，包括更大、更復雜的結構變異-“暗變異”-這可能會對每個品系產(chǎn)生功能性后果。在這里，我們描述了我們?nèi)绾问褂门＝蚣{米孔技術（ONT）長讀測序來揭示12個MIKK面板系中的一些暗變異，從而使我們對其基因組變異進行更完整的評估，并為進一步研究結構變異（SV）如何影響感興趣的表型鋪平了道路。

 

DNA甲基化分析：

• MIKK面板樣本中所有顯著CpG島差異甲基化的熱圖。
• CpG島按基因組位置和X軸排序。樣本通過Y軸上的分層聚類排序，并進行顏色編碼，以便用相同的顏色表示兄弟線。
• 顏色方案根據(jù)來自的中值對數(shù)似然比的值?3（藍色）到3（紅色）之間的值不明確?1和1為白色。
• B紅色顯著差異甲基化CpG（n=4249）和藍色所有非顯著島（n=8727）的最接近基因TSS的距離分布。
• C 24條HdrR染色體基因組窗口中顯著CpG島的數(shù)量，從0（白色）到6（深紅色）。
• D示例100kb區(qū)域包含紅色的顯著CpG島（chr15:1565040-1565987），而非白色的非顯著CpG島。
• E面板D中突出顯示的CpG島的CpG水平對數(shù)似然比核密度圖。通過降低中值llr，在Y軸上對樣本進行排序。單個CpG值由點表示。
• 圖D中突出顯示的CpG島的對數(shù)似然比熱圖，按樣本分層聚類。X軸上是按基因組位置排序的單個CpG

 

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