《Nature》案例：宏基因組聯(lián)合多組學研究揭示腸道有益菌對非酒精性脂肪性肝炎的保護作用

研究背景

吸煙是人類常見的不健康行為之一，世界衛(wèi)生組織將吸煙列為可預防死亡的主要原因。戒煙是延長預期壽命的有效方法，但由于尼古丁的強大成癮性和戒斷癥狀，戒煙并不容易實現(xiàn)。尼古丁降解最近被認為是阻斷尼古丁誘發(fā)的病理的一種策略。NAFLD（非酒精性脂肪肝?。┌瑥V泛的病理，通常從簡單的脂肪變性發(fā)展為 NASH（非酒精性脂肪性肝炎），然后在某些情況下發(fā)展為肝硬化和肝癌。由于腸道產(chǎn)生的代謝物在通過腸-肝軸的 NAFLD 進展中具有關(guān)鍵作用，因此建立腸道尼古丁積累、腸源性代謝物和NAFLD進展之間的關(guān)系可以為吸煙相關(guān)的肝臟疾病提供新的線索。

三個隊列：

隊列1：30名非吸煙者和30名吸煙者采集血清和糞便樣本。

隊列2：從41名確診為NAFLD的吸煙者身上采集了血清和糞便樣本。

隊列3：42名經(jīng)活檢確診為NAFLD的非吸煙者的血清和糞便樣本。

在吸煙或使用尼古丁貼劑期間，人體唾液和胃液中可檢測到高水平的尼古丁，表明其在消化道中積累，在消化道中可能產(chǎn)生病理性作用。為了確認吸煙期間尼古丁是否在腸道中積聚，研究者收集了 30 名非吸煙者和 30 名吸煙者的回腸末端黏膜活檢、血清和糞便樣本。在吸煙者的回腸粘膜組織中檢測到高水平的尼古丁，表明在吸煙期間尼古丁會在腸道中積聚（圖 1a）。進一步評估了通過三種先前描述的給藥方法（即煙霧暴露，口服和皮下）。在上述小鼠模型中始終觀察到回腸尼古丁積累（圖 1b、c 補充圖1a）。這些結(jié)果表明，吸煙期間的尼古丁水平在腸道中積累的程度相對較大，這可能具有病理生理學意義。

在尼古丁飲用水輸送模型中，無菌(GF)小鼠的回腸內(nèi)容物和回腸組織中的尼古丁濃度都高于SPF小鼠，這表明內(nèi)源性腸道細菌有助于尼古丁的降解(圖1C)。為了確定特定的人類內(nèi)源性尼古丁降解腸道菌群，研究者從公共宏基因組數(shù)據(jù)庫中篩選攜帶已知尼古丁分解代謝基因的潛在菌株。在幾個菌株中發(fā)現(xiàn)了nicA（一種已知的尼古丁降解酶）的同源序列，表明這些菌株具有降解尼古丁的潛力(補充圖1B)。對30名吸煙者的糞便樣本進行了宏基因組學分析，以確定與回腸尼古丁濃度降低最相關(guān)的物種。根據(jù)回腸尼古丁水平，參與者被定義為低尼古丁(LN)或高尼古丁(HN)(擴展數(shù)據(jù)圖1C)。值得注意的是，LN組和HN組之間在吸煙史(包括吸煙年限和每天吸煙數(shù)量)方面沒有顯著差異(補充表1和2)。在兩組之間沒有發(fā)現(xiàn)α-和β-多樣性的差異；但是，幾個菌株在LN和HN組之間顯示了不同的豐度(圖1D)。在宏基因組數(shù)據(jù)庫和宏基因組學的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)B.xylansolvens可能含有尼古丁分解代謝基因，并被鑒定為與LN和HN組之間的分離相關(guān)的主要驅(qū)動因素(圖1D)。

擴展數(shù)據(jù)圖 1.高尼古丁和低尼古丁吸煙者的腸道菌群組成差異

研究者進一步對B.xylansolvens進行了體外實驗，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加尼古丁對菌的生長速度沒有影響；然而，B.xylansolvens有效地降解了添加到培養(yǎng)基中的尼古丁。為了檢測B.xylansolvens中尼古丁的降解代謝產(chǎn)物，進行了B. xylanisolvens?的發(fā)酵實驗，并用層析法分離了尼古丁代謝物。用核磁共振對代謝產(chǎn)物進行了進一步的表征，鑒定為4-羥基-1-(3-吡啶)-1-丁酮(HPB)，可在B.xylansolvens菌的培養(yǎng)基中檢測到。為了驗證B.xylansolvens在體內(nèi)對尼古丁的降解特性，將該細菌定植到通過上述三種遞送策略給予尼古丁的SPF小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)可以在體內(nèi)降解尼古丁，并伴隨著HPB的增加(圖1E)。

接下來，研究者對B.xylansolvens進行了全基因組測序，并研究了B.xylansolvens中尼古丁分解代謝的生物合成基因。在由這些測序基因編碼的潛在的尼古丁分解代謝蛋白中，nicX蛋白(由nicX基因編碼)具有類似于已知的尼古丁降解酶nicA的計算模型的預測核心結(jié)構(gòu)，nicX可在體外降解尼古丁。

為了進一步驗證nicX的尼古丁降解能力，將NicX導入大腸桿菌或在B.xylansolvens中敲除。與野生型(WT)大腸桿菌相比，nicX-knockin大腸桿菌在體內(nèi)外獲得了降解尼古丁和產(chǎn)生HPB的能力(圖1F和擴展數(shù)據(jù)圖2J)。此外，B.xylansolvens中的nicX缺乏導致其尼古丁降解能力的喪失(圖1G和補充圖2K)。WT和nicX基因敲除的B.xylansolvens的生長曲線沒有發(fā)現(xiàn)顯著變化(擴展數(shù)據(jù)圖2L)。綜上所述，結(jié)果表明尼古丁在不同的給藥途徑中在腸道中積累，B.xylansolvens在nicX存在的情況下具有降解尼古丁的能力。

圖 1.鑒定腸道尼古丁積累和腸道細菌介導的的腸道尼古丁降解。

2.尼古丁降解延緩NAFLD進展

通過飲用水口服尼古丁是研究尼古丁相關(guān)慢性代謝性疾病的一個廣泛使用的模型。為了確定腸道尼古丁積累的作用以及B. xylanisolvens對其降解在NAFLD進展中的影響，用PBS(對照組)、B. xylanisolvens、尼古丁水、B. xylanisolvens加尼古丁水或nicX基因敲除B.xylansolvens加尼古丁水處理SPF鼠20周。WT和nicX基因敲除B. xylanisolvens成功地在HFHCD（高果糖高膽固醇飲食）喂養(yǎng)的SPF小鼠中定植(擴展數(shù)據(jù)圖3A)。然而，尼古丁的降解只在被B. xylanisolvens定植的組中觀察到(擴展數(shù)據(jù)圖3B)。各組之間沒有觀察到明顯的體重的變化(擴展數(shù)據(jù)圖3C，d)。

肝腫塊、血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平與對照組相比，尼古丁處理組小鼠的肝臟質(zhì)量、血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平以及肝臟甘油三酯水平都較高(擴展數(shù)據(jù)圖3E-I)。兩組間血清甘油三酯、肝臟和血清膽固醇酯及血清非酯化脂肪酸水平無顯著差異(擴展數(shù)據(jù)圖3j-m)。根據(jù)蘇木精伊紅(H&E)、油紅O和天狼星紅染色，在HFHCD喂養(yǎng)條件下，水中補充尼古丁加速了NAFLD的進展，這種加速伴隨著更嚴重的肝臟脂肪變性、炎癥和纖維化(圖1H和擴展數(shù)據(jù)圖3n-r)。此外，涉及肝臟脂肪代謝、促炎細胞因子產(chǎn)生和膠原合成的mRNAs的相對表達在添加尼古丁的水處理中被誘導(擴展數(shù)據(jù)圖3s-u)，而這些Nash指標通過WT?B.xylansolvens的定植而得到改善，但與nicX缺乏的b.xylansolvens無關(guān)(圖1H和擴展數(shù)據(jù)圖3c-u)。

這些數(shù)據(jù)表明，尼古丁降解菌的定植可以減少尼古丁誘導的NASH，并且這種作用依賴于nicX的表達。

3.尼古丁激活腸道AMPKα-1

與之前的研究一致，研究者發(fā)現(xiàn)尼古丁處理以劑量依賴的方式誘導回腸器官中AMPKα在Thr172磷酸化(擴展數(shù)據(jù)圖4A，b)。此外，吸煙在回腸末端激活了回腸AMPKα，這種作用的強度與吸煙者組織中的尼古丁水平呈正相關(guān)(圖2A)。此外，在所有三種尼古丁暴露的SPF小鼠模型中，回腸中的磷酸化AMPKα(p-AMPKα)均增加(擴展數(shù)據(jù)圖4C-e)。AMPKα有兩種亞型，即AMPKα1和AMPKα2)。研究者建立了腸上皮特異性AMPKα1(Prkaa1ΔIE)和AMPKα2(Prkaa2ΔIE)基因敲除小鼠系(擴展數(shù)據(jù)圖4F)。

在沒有腸道AMPKα1的情況下，尼古丁完全失去了激活AMPKα1的能力，而在沒有腸道AMPKα2的情況下，尼古丁誘導的p-AMPKα的增加仍然發(fā)生，這表明AMPKα1是尼古丁在腸道中的主要靶點(擴展數(shù)據(jù)圖4F)。B.xylansolvens的定植抑制尼古丁誘導的AMPKα在回腸的磷酸化(擴展數(shù)據(jù)圖4G)。與B.xylansolvens相似，nicX-knockin大腸桿菌在體內(nèi)能夠抑制尼古丁誘導的回腸AMPKα的磷酸化(擴展數(shù)據(jù)圖4H)。然而，在沒有nicX的情況下，沒有觀察到B.xylansolvens介導的抑制作用(擴展數(shù)據(jù)圖4I)。因此，B.xylansolvens在nicX存在下減輕了尼古丁誘導的回腸p-AMPKα的激活，這得到尼古丁分解代謝物HPB不能激活回腸p-AMPKα的支持(擴展數(shù)據(jù)圖4J)。

關(guān)于腸道AMPKα1在尼古丁加速的非酒精性脂肪肝進展中的作用，進一步發(fā)現(xiàn)腸道上皮AMPKα1的缺失有助于改善尼古丁加速的NASH小鼠模型的肝臟脂肪變性、炎癥和纖維化(圖2B-f和擴展數(shù)據(jù)圖5a-m)。

圖 2.尼古丁誘導的 NAFLD 進展中腸 AMPKα-SMPD3 軸的激活

4.P-AMPKα使SMPD3在Ser208/20處磷酸化

脂質(zhì)被認為在 NAFLD 進展中具有重要作用，因為它們是該病理學中腸道和肝臟之間串擾的關(guān)鍵介質(zhì)。研究者進一步對回腸進行了靶向脂質(zhì)組學分析，并確定神經(jīng)酰胺是導致Prkaa1基因敲除(KO)和對照(WT)腸上皮在尼古丁治療下基于聚集分化的主要代謝物(擴展數(shù)據(jù)圖5n，o)。在尼古丁飲用模型中沒有腸道 AMPKα1 的情況下，回腸神經(jīng)酰胺譜較低（圖 2g）。基于尼古丁飲用模型回腸上皮的磷酸化蛋白質(zhì)組分析（擴展數(shù)據(jù)圖 5p），腸上皮AMPKα1的缺失顯著降低了SMPD3的Ser208位的磷酸化(圖2H和擴展數(shù)據(jù)圖5Q)。

在回腸器官中，尼古丁處理沒有改變SMPD3的mRNA水平。然而，用AMPK激酶活性抑制劑或表達激活域突變體都可以緩解尼古丁誘導的SMPD3蛋白水平的增加(圖2I)，這表明尼古丁對SMPD3的影響是翻譯后的。發(fā)現(xiàn)在尼古丁處理下，SMPD3與AMPKα1結(jié)合(圖2J)。使用蛋白質(zhì)翻譯后修飾磷酸化位點預測工具GPS 2.0分析預測Ser208(小鼠)是AMPK最有可能的磷酸化位點(擴展數(shù)據(jù)圖6C)。SMPD3中包括Ser208(人類中的Ser209)在內(nèi)的多肽滿足AMPK的磷酸化底物基序，并且在進化上高度保守(擴展數(shù)據(jù)圖6D)。據(jù)報道，SMPD3的穩(wěn)定性受5個保守的絲氨酸位點的磷酸化調(diào)節(jié)。在尼古丁治療組檢測到Ser209磷酸化增加(圖2K和擴展數(shù)據(jù)圖6E)。SMPD3(WT)可被AMPKα1直接磷酸化，當Ser209突變或給予AMPK抑制劑時，這種磷酸化幾乎消失了(圖2L)。

為確定SMPD3在Ser209位的磷酸化是否影響SMPD3蛋白的穩(wěn)定性，將WT、S209A(缺失磷酸化突變體)和S209D(持續(xù)磷酸化突變體)SMPD3分別導入SW480細胞，并用尼古丁和放線菌酮(CHX)處理。發(fā)現(xiàn)Ser209的磷酸化保護SMPD3蛋白不被降解(圖3A)。在尼古丁飲用模型中分離的有機化合物中，觀察到缺乏腸上皮AMPKα1的小鼠的有機化合物中SMPD3的降解速度更快(擴展數(shù)據(jù)圖6F)。

此外，在尼古丁處理的SW480細胞中，SMPD3在Lys103處的去泛素化程度顯著高于DMSO處理的細胞(圖3B和擴展數(shù)據(jù)圖6G)。通過免疫沉淀，我們發(fā)現(xiàn)泛素化的SMPD3(Lys103)主要包含經(jīng)典的Lys48-連接Ub鏈(Lys48-Ub)，而不是Lys63-Ub，后者被尼古丁處理減少(圖3C，d和擴展數(shù)據(jù)圖6h)。S209A突變逆轉(zhuǎn)了尼古丁誘導的SMPD3 Lys48-Ub的減少，K103R突變進一步緩解了這一下降(圖3e和擴展數(shù)據(jù)圖6i)。此外，開發(fā)了抗p-SPMD3(S209)和抗Ub-SMPD3(Lys103)抗體(擴展數(shù)據(jù)圖6J，k)，并證實尼古丁誘導的總SMPD3蛋白的增加是由于SMPD3磷酸化水平升高，隨后泛素化減少(圖3F)。

這些發(fā)現(xiàn)表明，尼古丁激活的AMPKα在Ser209位磷酸化SMPD3，這反過來又抑制SMPD3上Lys103的泛素化和隨后的Lys48-Ub降解途徑，從而提高SMPD3蛋白的穩(wěn)定性及其蛋白水平(圖3G)。進一步檢測到尼古丁誘導的SMPD3在Ser208位的磷酸化，同時在Lys103位的SMPD3泛素化減少，這可以通過在NicX存在下B.xylansolvens的定植來緩解(圖3H)。吸煙者回腸的磷酸化和總SMPD3蛋白水平也高于非吸煙者，這與回腸尼古丁含量有關(guān)；而泛素化的SMPD3蛋白水平在非吸煙者、LN和HN組依次降低(圖3I)。

圖3.由于泛素化介導的降解減少，磷酸化的SMPD3更穩(wěn)定

5.P-AMPKα-SMPD_3-神經(jīng)酰胺軸與NASH

SMPD3被認為是代謝性疾病的病理加速器。將SMPD3抑制劑GW4869應用于有機化合物以抑制SMPD3活性。GW4869降低了尼古丁處理下類器官及其上清液中的神經(jīng)酰胺水平。慢病毒表達的SMPD3被用于從尼古丁飲用模型恢復Prkaa1基因敲除的回腸器官中SMPD3的表達。正如預期的那樣，SMPD3的過表達逆轉(zhuǎn)了由于回腸器官中AMPKα1缺乏而導致的神經(jīng)酰胺水平的降低。在尼古丁加速的NASH小鼠模型中，在B. xylanisolvens存在的情況下，被B.xylansolvens定植的SPF小鼠回腸神經(jīng)酰胺減少，這是由于腸道p-AMPKα-SMPD3軸被抑制所致。

在尼古丁加速的NASH小鼠模型中，為了證實神經(jīng)酰胺譜的調(diào)節(jié)是否與腸上皮細胞AMPKα1缺乏所致的NASH改善有關(guān)，研究者通過每日腹腔注射神經(jīng)酰胺(D18：1/16：0)。神經(jīng)酰胺給藥可逆轉(zhuǎn)AMPKα1對腸上皮遺傳破壞引起的肝臟脂肪變性、炎癥和纖維化的保護作用。此外，口服GW4869降低了回腸神經(jīng)酰胺的水平，并且在尼古丁飲用模型中伴隨著較低的NAFLD嚴重程度。

總之，尼古丁誘導的腸道AMPKα-SMPD3軸的激活通過增加腸道神經(jīng)酰胺的產(chǎn)生來促進非酒精性脂肪肝的進展，因此抑制SMPD3是一種潛在的緩解肝臟脂肪變性、炎癥和纖維化的策略。

擴展數(shù)據(jù)圖 7.?p-AMPKα和SMPD3在腸道神經(jīng)酰胺產(chǎn)生中的相互作用

6.B. xylanisolvens與臨床非酒精性脂肪肝

為了闡明我們的發(fā)現(xiàn)與人類NAFLD進展之間的相關(guān)性，我們收集了83名經(jīng)活檢證實的NAFLD患者的數(shù)據(jù)，這些患者被分為吸煙者(n=41)和非吸煙者(n=42)。在吸煙者中，NAFL、Borderline NASH和Defined NASH在煙草吸煙史(包括吸煙年限和每天吸煙數(shù)量)方面沒有顯著差異。然而，我們發(fā)現(xiàn)B.xylansolvens水平與NAFLD嚴重程度呈負相關(guān)，隨著NAFLD的進展，糞便中尼古丁水平逐漸增加，糞便中尼古丁降解產(chǎn)物HPB相應地隨著NAFLD的進展而減少(圖4C，d)。在吸煙者中，B.xylansolvens豐度與糞便尼古丁含量呈負相關(guān)，但與HPB水平呈正相關(guān)(圖4e，f)。

在代謝指標方面，糞便中B.xylansolvens和HPB的存在與血清ALT和AST水平呈負相關(guān)，而尼古丁濃度呈正相關(guān)(圖4G)。這些結(jié)果表明，B.xylansolvens介導的尼古丁降解可能保護吸煙者的肝功能。NASH患者的血清神經(jīng)酰胺水平，尤其是主要來自腸道的神經(jīng)酰胺(D18：1/16：0)水平顯著高于NAFL患者(圖4H)，并與B.xylansolvens的豐度呈負相關(guān)(圖4I)。

然而，在非吸煙者中，沒有觀察到B.xylansolvens的豐度與NAFLD嚴重程度之間的相關(guān)性。綜上所述，這些數(shù)據(jù)證實了腸道尼古丁蓄積是吸煙者臨床NAFLD進展的危險因素，同時也表明具有尼古丁降解活性的B.xylansolvens具有保護作用。

圖 4. B. xylanisolvens介導的尼古丁降解與臨床 NAFLD 進展呈負相關(guān)。

該研究發(fā)現(xiàn)尼古丁在吸煙期間在腸道中積聚并加速NAFLD的進展，但它可以被人類共生菌B. xylanisolvens 有效降解。揭示了了腸道尼古丁積累的病理影響，并確定了一種內(nèi)源性尼古丁降解腸道細菌，該細菌對預防和治療吸煙者的 NASH 具有潛在價值。

姜長濤教授、Frank Gonzalez研究員、虞朝輝教授、李洋研究員、鄭明華教授為本文的共同通訊作者。北京大學醫(yī)學部基礎(chǔ)醫(yī)學院博士后陳博、美國國立衛(wèi)生研究院博士后孫露露、北京大學醫(yī)學部基礎(chǔ)醫(yī)學院博士研究生曾廣易、浙江大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院沈哲教授、北京大學醫(yī)學部基礎(chǔ)醫(yī)學院博士后汪鍇、復旦大學基礎(chǔ)醫(yī)學院博士研究生尹利敏為本文的共同第一作者。百邁客生物可提供Illumina二代宏基因組、ONT三代宏基因組、PacBio全長微生物多樣性、二代微生物多樣性、微生物絕對定量等全套測序分析服務，如果您對我們的服務感興趣，歡迎點擊下方按鈕聯(lián)系我們，我們將免費為您設(shè)計文章思路方案。

參考文獻：

Chen, B., Sun, L., Zeng, G. et al. Gut bacteria alleviate smoking-related NASH by degrading gut nicotine. Nature 610, 562–568 (2022). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05299-4