視網(wǎng)膜基因研究：Hi-C技術繪制高分辨率人類視網(wǎng)膜3D基因組拓撲結構圖譜

在過去視網(wǎng)膜疾病的全基因組關聯(lián)研究（GWAS）發(fā)現(xiàn)常見的變異主要在基因組非編碼區(qū)域，但由于先導變異區(qū)域的局部連鎖不平衡（LD），阻礙了特定關聯(lián)基因和變異的識別，因此闡明與性狀相關的遺傳變異如何影響調節(jié)基因表達網(wǎng)絡，并因此影響表型，亟需了解相關組織和細胞類型的3D基因組拓撲結構。

近日，來自美國NIH國家眼科研究所Anand Swaroop團隊通過Hi-C技術繪制了人類視網(wǎng)膜細胞染色質三維結構圖譜，揭示了人類視網(wǎng)膜中超級增強子（SEs）的3D染色質組織的特性，并將得到的視網(wǎng)膜基因組調控網(wǎng)絡與通過GWAS識別的老年性黃斑變性（AMD）和青光眼相關的數(shù)量性狀基因座（quantitativetraitloci, QTL）和遺傳變異相結合，揭示了順式調控元件(CREs)的靶標，表明了人類視網(wǎng)膜中SEs的3D染色質組織的特性。此次人類視網(wǎng)膜高分辨率基因組結構的研究為組織特異性功能的遺傳調控提供了新見解，并能夠解剖常見的致盲疾病表型。

研究背景

在不同組織和細胞類型中人類基因組染色質結構增強子-啟動子相互作用建立了獨特的時空基因表達模式。非編碼遺傳變異可以通過染色質空間構象從而調控基因表達來影響細胞表型。為了闡明人類視網(wǎng)膜的基因組調控，利用Hi-C技術以高分辨率揭示染色質并與超級增強子（SE）、組蛋白標記、CTCF結合和選擇轉錄因子相互作用，表明與邊緣SE的TAD相比，具有中心SE的拓撲相關結構域（TAD）表現(xiàn)出更強的絕緣性，并與視網(wǎng)膜基因的接觸增強。全基因組表達數(shù)量性狀位點（eQTL）分析與拓撲圖相結合，揭示了100個eQTL和與視網(wǎng)膜神經(jīng)變性相關的相應eGene之間的聯(lián)系，并發(fā)現(xiàn)了與年齡相關的黃斑變性和青光眼相關的易感變異的候選基因。對人類視網(wǎng)膜高分辨率基因組結構的研究為組織特異性功能的遺傳控制提供了見解，提出了缺失遺傳性的模式，Hi-C組學技術為識別視網(wǎng)膜相關疾病表型提供有利工具。

研究設計

材料：一共取材5名患者捐贈視網(wǎng)膜組織（2名女性，3名男性，年齡65-77歲）;Hi-C互作取3名男性和1名女性視網(wǎng)膜組織以及HCT116細胞系；CUT&RUN取1名75歲的女性外周視網(wǎng)膜組織；ATAC-seq取2名女性和3名男性視網(wǎng)膜組織。

方法：Hi-C互作(5kb)、ATAC-seq、Cut&Run、ChIP-seq（數(shù)據(jù)集：GSE13731134）、RNA-seq（數(shù)據(jù)集）

文章亮點

1）本文整合表觀調控全面的技術，利用Hi-C互作、ATAC-seq、Cut&Run、ChIP-seq等多組學不僅重構了視網(wǎng)膜基因組拓撲結構，還深入剖析了三維結構對基因調控的網(wǎng)絡；

2）視網(wǎng)膜調控基因組拓撲結構與AMD和青光眼相關遺傳變異的首次詳細整合；

3）高分辨率的基因組結構圖像(5kb)，深入研究常染色質A/異染色質B區(qū)域、TAD邊界、Loop形成的變化；

4）利用GWAS、eQTL等疾病性狀關聯(lián)分析建立與視網(wǎng)膜神經(jīng)變性相關的相應eGene之間的聯(lián)系。

主要研究內容

1、Hi-C測序以5kb高分辨率識別人類視網(wǎng)膜中的染色質空間構象

利用Hi-C技術檢測了4名眼科相關疾病患者的視網(wǎng)膜組織，以超高的分辨率（5kb）的重新繪制了人類視網(wǎng)膜細胞染色質的組織（每個視網(wǎng)膜樣本的測序深度約為3億對reads，HCT116的深度約為5000萬對read）。分析表明Hi-C數(shù)據(jù)在樣本間表現(xiàn)出高度的相似性，所有常染色體的分層相關系數(shù)(SCC)>0.97。整合所有樣本的數(shù)據(jù)一共獲得了11.48億對reads,其中有效互作reads的比例高達95%，不同染色體之間的互作trans占23.6%。

此次研究總共獲得了7.04億個有效染色質互作，這些染色質互作平均分布在染色體之間和染色體之內。

本文Hi-C以3 kb的高分辨率識別出67,841個顯著的染色質互作和2948個拓撲關聯(lián)域（TADs）、以及60000多個loops的形成。如預測一樣，視網(wǎng)膜中活躍表達的基因在A Component染色質區(qū)域，而大多數(shù)低活性的基因出現(xiàn)在B Component中，檢測全基因組loop環(huán)結構特征發(fā)現(xiàn)，在A-A互作、A-B互作、B-B互作形成loops三種模式中，A-A互作形成loops距離小于B-B互作和A-B互作形成的loops，并且A-A形成的loops都是活躍的染色質區(qū)域，跨度平均小于1Mb，大多數(shù)都是發(fā)生在TAD內。

2、人視網(wǎng)膜染色質拓撲結構具有組織特異性和物種保守性

為了評估已識別的染色質特征在人視網(wǎng)膜組織特異性和物種保守性，這里比較了人類神經(jīng)元（ACC）、GM12878淋巴細胞（LCL）、結腸癌細胞（HCT116，clone cancer）Hi-C測序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜特異性基因，如OTX2、EYS、PDC，只存在于視網(wǎng)膜的A component；由于視網(wǎng)膜和ACC神經(jīng)元之間的高度相關性，比較發(fā)現(xiàn)PAX6基因座在神經(jīng)元和視網(wǎng)膜中的相互作用與其在兩個組織中的表達相似，而編碼OTX2和CRX兩個關鍵的視網(wǎng)膜TF，在視網(wǎng)膜中表現(xiàn)出大量的局部相互作用，但在神經(jīng)元中沒有，表明人視網(wǎng)膜組織拓撲關聯(lián)域具有組織特異性，并在基因調節(jié)中發(fā)揮著重要作用。

小鼠和人類染色質組織之間的相似性表明了跨物種的守恒，強調了染色質組織模式與視網(wǎng)膜基因調控的相關性。發(fā)現(xiàn)小鼠TAD中21.8%的小鼠基因對也位于相應的人類TAD中，超過三分之一（35.7%）的基因對在小鼠體內通過染色質環(huán)相互作用，在人類視網(wǎng)膜中也是如此。

在這兩個物種中，EGF和ENPEP之間都觀察到loops的形成，這些發(fā)現(xiàn)表明，視網(wǎng)膜表達的基因表現(xiàn)出保守的染色質拓撲結構，突顯了其對調節(jié)視網(wǎng)膜基因的重要性，并可能涉及組織特異性順式調控元件CREs。

3、視網(wǎng)膜中SE與高度表達的組織特異性基因重疊，并富集視網(wǎng)膜TF結合motfis

染色質互作形成的loops促進CRE與其目標基因之間的物理相互作用，并且在控制基因表達方面發(fā)揮著至關重要的作用。為了識別視網(wǎng)膜CRE，利用染色質可及性檢測（ATAC-seq）確定了染色質開放狀態(tài)和CUT&Run檢測活性（H3K4me3，H3K27Ac，H3K4me234）和抑制性（H3K9me3）組蛋白標記互作的特征序列。通過全基因組染色質開放程度以及開放區(qū)域（啟動子、增強子、異染色質、低豐度信號）構建了10種染色質狀態(tài)模型，啟動子和增強子區(qū)域富集了用于結合CTCF和關鍵視網(wǎng)膜TF，如CRX、NRL、OTX2、MEF2D、CREB和RORB，另外增強子主要在TSS上游區(qū)域富集，而啟動子僅在TSS富集。

利用H3K27Ac蛋白標記互作在視網(wǎng)膜順式調控元件啟動子和活性或穩(wěn)定增強子區(qū)域鑒定了1325個超級增強子（SEs），發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜表達基因的數(shù)量與每個染色體的SE數(shù)量之間存在高度相關性。SE與轉錄組測序數(shù)據(jù)集結合分析表明，與CRE相比，SE重疊的基因的平均表達量高2.17倍，并且比100組隨機SE大小的位點高2.89倍，視網(wǎng)膜中關鍵的光感受器特異性基因NRL主要在活性組蛋白標記和染色質開放區(qū)域的大型SE中富集，與CRE或隨機區(qū)域相比，TF結合位點主要存在于SE中，其中編碼許多具有豐富結合基序TF的基因也與SE重疊，這表明它們在維持視網(wǎng)膜穩(wěn)態(tài)方面的潛在作用。

4、SE在TAD內部loops富集并參與基因表達調控

以往研究表明SE可能會與其他調節(jié)區(qū)域互作，形成能夠調節(jié)多個基因的大型轉錄單元。視網(wǎng)膜SE在距離較小的loops中富含，并廣泛存在與loops內的互作，幾乎所有SE參與內部互作的loops都小于1Mb，并且大多數(shù)SE主要在TAD中存在交互。

與隨機區(qū)域相比較，SE在調節(jié)相互作用中大量富集，與3,059個獨特的CRE、1個獨特的TSS和217個獨特的SE互作。在視網(wǎng)膜和/或大腦中特異性表達的基因大多與SE重疊，而與SE相互作用但不重疊的基因則是一些常規(guī)基因，也有一些SE與許多CRE相互作用，因此可能在協(xié)調基因表達模式方面發(fā)揮重要作用，這些結果均表明人視網(wǎng)膜中SE的組織特異性和調控獨特性。

5、SE的TAD內定位與靶基因的邊界絕緣和生物學功能有關

進一步研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)SE與桿狀細胞基因有關，反映了人類視網(wǎng)膜樣本中桿狀細胞的優(yōu)勢。研究還證明了SE靶基因的生物學功能可能與TAD中的SE定位以及TAD邊界絕緣有關。在TADs的邊緣，SEs的存在是與較弱的絕緣有關，與其他類型TAD相比，我們發(fā)現(xiàn)含SE的TAD中有更多的染色質相互作用。值得注意的是，SE本身大多與位點的相互作用非常接近，表明在局部、TAD邊緣有很強的絕緣性，可能是由于CTCF結合的富集和避免附近基因的隨機激活，這與之前的研究一致。

SE靶向基因功能研究，即TSS與SE重疊或相互作用的基因，發(fā)現(xiàn)SE處在邊緣的TAD中都是富含應激反應基因，而視網(wǎng)膜基因主要在SE處于中心的TAD中富集，其中應激反應FOS重疊的SE位于TAD的邊緣，該TAD可能會受到超出自身TAD邊界的區(qū)域變化的影響。

6、染色質loops、SEs和CREs與視網(wǎng)膜 eQTLs的聯(lián)合分析

eQTL將特定的遺傳變異與目標基因表達的變化聯(lián)系起來（下文稱為eGene），為了識別可能與視網(wǎng)膜基因調節(jié)相關的eQTL，結合14,859個視網(wǎng)膜eQTLs，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)視網(wǎng)膜eQTL都存在于活躍的染色質中，并駐留在同一個TAD中，這為解釋基因變體對eGene的影響提供了直接機制。此外，評估了變異與其eGene的啟動子區(qū)域（距離TSS±2.5kb）之間的物理距離，能夠區(qū)分啟動子eQTL、遠端eQTL和與啟動子相互作用的遠端eQTL。分別確定了2,410個CRE（CRE-eQTL）和880個SE（SE-eQTL）特殊的eQTL，其中58.5%的CRE-eQTL和69.3%的SE-eQTL也與相關的eGene相交?？傮w而言，大多數(shù)eQTL在物理上與eGene或其啟動子重疊或者通過染色質loops互作接近各自的eGene。

7、基因組拓撲結構將目標基因與AMD和青光眼相關的風險變異進行關聯(lián)

關于青光眼和AMD的GWAS研究已經(jīng)確定了大量的非編碼變異，包括eQTLs分析在內的其他研究提供了進一步見解，但許多相關位點的目標基因和變異仍然難以捉摸。研究人員將染色質互作與從GWAS研究中識別的遺傳變異數(shù)據(jù)進行了整合，并對帶有GWAS先導和LD變體的成人視網(wǎng)膜基因組拓撲結構進行了綜合分析，發(fā)現(xiàn)了幾個先前未知的可能與青光眼和AMD有關的基因。例如，研究展示了一個顯著的遠程相互作用導致目標基因變化的青光眼相關基因TFAP2B/PKHD1。此外，小鼠中TFAP2B表達的中斷導致與青光眼一致的強烈病理表型，這些發(fā)現(xiàn)指向了與這些疾病相關的特定候選致病基因。研究團隊發(fā)現(xiàn)了AMD的候選致病基因，在CTRB2/CTRB1位點建立了CFDP1作為AMD相關的候選基因。

總結

研究團隊通過將高分辨率Hi-C數(shù)據(jù)與表觀遺傳圖譜和順式調控元件整合，為人類視網(wǎng)膜研究提供了一個重要的數(shù)據(jù)資源，促進了基因組調控的研究。研究團隊識別了視網(wǎng)膜病變中缺失的遺傳性，以及包括AMD和青光眼在內的常見致盲疾病的候選因果基因和變異，該研究為將調控變異與視網(wǎng)膜疾病表型聯(lián)系起來提供了一個框架。整合的基因組調控圖譜還將有助于評估與其他常見視網(wǎng)膜相關疾病(如糖尿病視網(wǎng)膜病變)相關的基因，確定缺失的遺傳性，并了解遺傳性視網(wǎng)膜和黃斑疾病的基因型-表型相關性。

這項研究的首席研究員Anand Swaroop教授說:“這是視網(wǎng)膜調控基因組拓撲與老年性黃斑變性(AMD)和青光眼相關的遺傳變異的首次詳細整合，這兩種基因變異是視力喪失和失明的兩個主要原因?！盨waroop說:“擁有如此高分辨率的基因組結構圖像，將繼續(xù)為組織特異性功能的基因控制提供見解?！?/p>

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