三維基因組學(xué)論文:三維基因組學(xué)新角度闡述胰腺癌發(fā)生機(jī)制-IF17.521

真核生物的染色質(zhì)在細(xì)胞核內(nèi)會折疊成復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)，染色體的結(jié)構(gòu)和數(shù)量重排等結(jié)構(gòu)變異（SV），在很大程度上貢獻(xiàn)了人類基因組的遺傳多樣性，往往破壞染色質(zhì)TAD結(jié)構(gòu)域、改變遠(yuǎn)離 SV 斷點(diǎn)的基因表達(dá)，這些三維基因組的變化導(dǎo)致許多疾病發(fā)生發(fā)展。今天帶來一篇利用多組學(xué)發(fā)表近17分的文章，從三維基因組學(xué)新角度闡述胰腺癌發(fā)生機(jī)制，一起來探討這邊的文章的新思路（入選同期封面論文）。

研究背景

結(jié)構(gòu)變異（SV）是基因組變異的來源之一，并可能導(dǎo)致癌基因生成。然而，人類癌癥中SV的識別和解釋在技術(shù)上仍然具有挑戰(zhàn)性。利用長讀長測序和Hi-C優(yōu)勢檢測人類胰腺導(dǎo)管上皮癌發(fā)生結(jié)構(gòu)變化的特征，揭示了3D染色質(zhì)架構(gòu)的廣泛重新編程，對闡明胰腺癌基因組結(jié)構(gòu)變化特征對其發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制至關(guān)重要。

研究設(shè)計(jì)

材料：人類胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞（HPDE6-C7）和人類胰腺癌細(xì)胞系PANC1和BxPC3；CCLE+GSE97003數(shù)據(jù)庫中的三條細(xì)胞系進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組聚類分析

方法：Hi-C互作、單分子實(shí)時(shí)（SMRT）測序、RNA-seq、ChIP-seq（NCBI PRJEB27863）

研究結(jié)論

研究人員通過整合三代人重測序、高通量染色質(zhì)構(gòu)象捕獲( Hi-C) 和 RNA-seq等多組學(xué)技術(shù)，對源自人胰腺導(dǎo)管上皮的胰腺癌細(xì)胞和正常人胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞進(jìn)行了深入研究和綜合分析，成功揭示了PDAC細(xì)胞中SV的特征圖譜和染色體空間結(jié)構(gòu)的多尺度重塑，并進(jìn)一步闡釋了SV與染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)之間的復(fù)雜的相互作用及其對基因表達(dá)的影響。這一發(fā)現(xiàn)為全面了解SV在胰腺癌發(fā)展中的致病機(jī)制提供了全基因組資源和新的空間視角，這可能有助于識別新的預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

文章亮點(diǎn)

借助三代人全基因組重測序技術(shù)，揭示胰腺癌關(guān)鍵驅(qū)動基因CDKN2A和SMAD4的復(fù)雜基因組重排，并且結(jié)合Hi-C技術(shù)識別了染色質(zhì)空間構(gòu)象的改變，并從線性角度和3D角度進(jìn)一步闡明了它們對癌基MIR31HG、MYO5B等表達(dá)的影響，這是首次采用多組學(xué)策略集成了長讀長測序和Hi-C技術(shù)研究結(jié)構(gòu)變異（SV）對胰腺癌三維基因組的影響，為PDAC診治開發(fā)提供了遺傳和分子基礎(chǔ)的根本新見解。

研究結(jié)果

1、人類胰腺癌結(jié)構(gòu)變異的特征

利用SMRT測序長度長的優(yōu)勢全面研究了正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中發(fā)生的SV的動態(tài)譜，檢測到PANC1、BxPC3和HPDE6C7中存在大量的結(jié)構(gòu)變異（SV），分別為20 805、21 168和23 035個(gè)SV。兩種常見的SV類型是插入和缺失，分別占所有SV的約50%和41%。值得注意的是，與正常上皮細(xì)胞系相比，癌癥細(xì)胞系中兩種以上簡單SV斷端重疊的復(fù)雜SV數(shù)量增加了兩到四倍，這表明在惡性轉(zhuǎn)化過程中，基因組不穩(wěn)定性大大增加。對這些SV進(jìn)行染色體區(qū)域分布、長度分布分別進(jìn)行分析，插入、缺失和重復(fù)表現(xiàn)出相似的特征，大多數(shù)長度都在1kb以內(nèi)，表現(xiàn)出細(xì)胞異質(zhì)性。

研究了在其外顯子區(qū)域受到SV直接影響的基因，并分別在PANC1、BxPC3和HPDE6C7中檢測到了1017、1061和1683個(gè)基因的變化。在PANC1中獨(dú)立檢測到14號染色體上的DICER1擴(kuò)增，19號染色體上的AKT2缺失和20號染色體上的GNAS插入。在BxPC3中特異性地檢測到9號染色體上的TNC缺失，11號染色體上的RRAS2插入和18號染色體上的SMAD4缺失。BxPC3樣本中還存在許多基因大片段缺失，長度超過1.7 Mb，包括CDKN2A、CDKN2B、MTAP和DMRTA1等基因?；陂L讀長測序結(jié)果建立了人類胰腺癌中SV的特征，為全面研究SV在這種致命惡性腫瘤中的發(fā)病機(jī)制提供寶貴的資源。

2.染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的廣泛重塑與人類PDAC的基因表達(dá)變化相關(guān)

Hi-C測序全面分析正常HPDE6C7細(xì)胞系和兩種癌細(xì)胞系（BxPC3和PANC1）染色體的空間構(gòu)象，對來自不同庫的三個(gè)細(xì)胞系的主要讀數(shù)的相關(guān)性分析表明，來自不同庫的Hi-C數(shù)據(jù)是一致的，兩種癌細(xì)胞類型最相似，可以與正常的HPDE6C7細(xì)胞系區(qū)分開來。

PADC中染色質(zhì)A/B室置換分析，與正常細(xì)胞相比，BxPC3中A/B置換的總發(fā)生率分別為24.8%（A到B，15.3%；B到A，9.5%）和PANC1中的24.1%（A到B，16.2%；B到A，7.9%）。A/B置換與基因密度和調(diào)節(jié)活性的變化有關(guān)，穩(wěn)定的A和B室到A室置換是具有活性轉(zhuǎn)錄的基因豐富的區(qū)域，而穩(wěn)定的B室和A室到B室置換具有相反的特性，RNA-seq數(shù)據(jù)相結(jié)合也證實(shí)這一結(jié)論。其中癌癥樣本中PHLDA1是位于12號染色體共同B到A室置換的基因，在兩個(gè)癌細(xì)胞系中都顯著上調(diào)，PHLDA1在幾種惡性腫瘤中顯著上調(diào)，包括胰腺癌、低級膠質(zhì)瘤和黑色素瘤，它與胰腺癌預(yù)后不佳顯著相關(guān)。這些結(jié)果表明兩個(gè)癌細(xì)胞系（BxPC3和PANC1）中染色質(zhì)A和B室的空間分布發(fā)生了變化，這些轉(zhuǎn)變與癌癥相關(guān)基因的表達(dá)變化顯著相關(guān)。

PDAC中的接觸域（CD）改變分析，拓?fù)潢P(guān)聯(lián)域（TAD）是染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的功能單位，這里利用高分辨率Hi-C（5kb）測序檢測正常細(xì)胞系和癌細(xì)胞系的接觸域邊界（CDB）,在HPDE6C7、BxPC3和PANC1細(xì)胞系中確定了14 581、14 318和13 494 CD，平均大小分別為211、227和214kb。CDB保存在人類基因組中任何兩種細(xì)胞類型之間共享的CDB很少，CD數(shù)量和大小的變化可能會在不同的染色體區(qū)域出現(xiàn)截然相反的變化。與共享的的CD相比，癌癥特異性CD區(qū)域與上調(diào)基因表達(dá)的關(guān)聯(lián)要大得多。這些癌癥特異性CD中差異表達(dá)基因的GO富集分析顯示，改變的基因涉及幾種關(guān)鍵途徑，包括癌癥促進(jìn)、細(xì)胞分化、細(xì)胞粘附、細(xì)胞運(yùn)動和遷移。

PDAC中的癌癥特異性loops和異常增強(qiáng)子激活深入研究，顯示癌癥特異性loops異常增多，癌癥特異性CD與高比例的癌癥特異性loops顯著相關(guān)，這些H3K27ac活性的癌癥特異性loops與上調(diào)的基因表達(dá)顯著相關(guān)。這些變化伴隨著基因表達(dá)的上調(diào)，可能與癌癥特異性loops中調(diào)節(jié)元素活性的增強(qiáng)有關(guān)?？傊琍DAC細(xì)胞系中的3D染色質(zhì)結(jié)構(gòu)經(jīng)歷了廣泛的重塑，并隨之而來的基因表達(dá)失調(diào)，這可能會促進(jìn)PDAC的腫瘤發(fā)生和進(jìn)展。

3、三維基因組結(jié)構(gòu)變異的分布

人體內(nèi)SV的發(fā)生和形成往往受到染色體三維空間結(jié)構(gòu)的影響，根據(jù)SV和染色質(zhì)A/B室之間的關(guān)系，除了BxPC3中的缺失外，BxPC3/PANC1/HPDE6C7樣本中染色質(zhì)A室都有顯著的插入、缺失和重復(fù)變化，發(fā)現(xiàn)插入、其中在PANC1的染色質(zhì)A室中顯著富集了缺失和重復(fù)變異，但在BxPC3的染色質(zhì)A室中顯著存在重復(fù)變異，兩種癌細(xì)胞系之間A/B隔間中癌癥特異性SV的分布模式大不相同。

SV在CD中的分布及其邊界研究，根據(jù)SV和CDB斷點(diǎn)之間的相對位置，將所有癌癥特異性SV分為四類：CDB中/交叉CDB/內(nèi)部CDB/部分重疊。超過90%的癌癥特異性SV位于CD（CDB-SV）內(nèi)部，這對它們的染色質(zhì)空間構(gòu)象影響很小，而跨CDB/內(nèi)部CDB/部分重疊SV對CD折疊的影響更大，其比例相對較低?？傊贏/B室或CD級別的腫瘤中，SVs的發(fā)生與染色體三維空間構(gòu)象之間存在一定的相關(guān)性。此外，SV在三維基因組中的分布模式具有高度細(xì)胞類型特異性。

4、PDAC基因組中特定癌癥SV和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域的相互作用

SV可以重塑線性基因組染色質(zhì)空間構(gòu)象，從而改變順式中的染色質(zhì)拓?fù)浜突蛘{(diào)控，深入探索跨CDB SV對CD中斷的影響，跨CDB缺失區(qū)域的CD融合明顯高于基因組的其他位點(diǎn)，并且只有同一細(xì)胞系中頻率更高的缺失與相鄰CD或CD融合的增強(qiáng)相互作用有關(guān)，低頻率的缺失對相鄰CD的相互作用沒有顯著影響，在這些情況下沒有發(fā)現(xiàn)CD融合。這些表明SV對3D基因組結(jié)構(gòu)的影響相當(dāng)復(fù)雜，可能會受到多種因素的影響，例如SV的細(xì)胞間基因組異質(zhì)性、位置和長度等。

分析了兩個(gè)癌細(xì)胞系中CD融合與差異基因表達(dá)之間的相關(guān)性。結(jié)果表明，融合CD中差異表達(dá)基因的比例明顯高于基因組其他區(qū)域，總的來說，這些數(shù)據(jù)表明，癌癥特異性SV可以通過重塑PDAC中的CD來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。

5、CDKN2A純合子缺失對三維基因組結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)的影響

CDKN2A失活通過各種機(jī)制發(fā)生在約90%的PDAC中，其中純合子缺失是常見的途徑之一。此次研究證實(shí)了BxPC3和PANC1中CDKN2A的純合子缺失，發(fā)現(xiàn)缺失兩側(cè)相鄰CD之間的相互作用顯著增強(qiáng)，形成融合CD，相鄰CD區(qū)域之間的內(nèi)部相互作用也顯著增強(qiáng)。發(fā)現(xiàn)CDKN2A、CDKN2B和MTAP（缺失區(qū)域的基因）的表達(dá)幾乎消失了，而MIR31HG和LINC01239（缺失區(qū)域兩側(cè)的基因）的表達(dá)被顯著上調(diào)。發(fā)現(xiàn)MIR31HG表達(dá)高患者的生存率顯著縮短（圖5e），與MIR31HG在PDAC中的致癌作用一致。該研究揭示了CDKN2A純合子缺失對三維基因組結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)的影響，為了解CDKN2A失活以推動PDAC的發(fā)生和發(fā)展提供了新的見解。

6、PDAC驅(qū)動基因SMAD4缺失對三維基因組和基因表達(dá)的影響

SMAD4是PDAC的一個(gè)關(guān)鍵驅(qū)動基因，已知在約55%的胰腺癌中丟失，純合子缺失占這些病例的約30%。通過三代測序技術(shù)和Hi-C方法驗(yàn)證了BxPC3中的SMAD4純合子缺失。涉及SMAD4基因的交叉CDB缺失雙方之間的相互作用沒有增強(qiáng)，分析BxPC3中第18號染色體的相互作用熱圖，并發(fā)現(xiàn)了幾種增強(qiáng)的遠(yuǎn)端異位相互作用。這些不尋常的遠(yuǎn)程區(qū)域主要與三個(gè)大型缺失點(diǎn)有關(guān)，包括SMAD4缺失區(qū)域。BxPC3中SMAD4的純合子丟失和18號染色體上的多次缺失會導(dǎo)致巨大、復(fù)雜的染色體重排，包括反轉(zhuǎn)和易位。CD可以減少復(fù)雜染色體重排造成的3D基因組組織的破壞，保持染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)，并穩(wěn)定CD中基因的表達(dá)。確定了與18號染色體上SMAD4缺失相關(guān)的復(fù)雜染色體重排，并揭示了它們對3D基因組組織和相關(guān)基因表達(dá)的影響。

總結(jié)

三代測序和高通量染色質(zhì)構(gòu)象捕獲技術(shù)（Hi-C）的快速發(fā)展和應(yīng)用，越來越多的證據(jù)表明，SV和3D基因組在腫瘤發(fā)生和發(fā)育中起著關(guān)鍵作用。建立SV和3D基因組結(jié)構(gòu)的特征，并表征它們在PDAC中的動態(tài)相互作用，闡明了兩個(gè)關(guān)鍵驅(qū)動基因CDKN2A和SMAD4的純合子缺失對3D染色質(zhì)折疊結(jié)構(gòu)域的影響，以及相關(guān)基因在PDAC的致癌和進(jìn)展中的表達(dá)，這項(xiàng)研究為全面理解SV在胰腺癌發(fā)生和發(fā)展中的功能和致病機(jī)制提供了新的空間視角。基于高維基因組學(xué)的研究將有助于識別PDAC新的分子標(biāo)記物或潛在靶點(diǎn)，這對提高預(yù)后極差的PDAC的治療挑戰(zhàn)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

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