現(xiàn)如今，轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究范圍幾乎覆蓋全部的研究領(lǐng)域，包括農(nóng)林領(lǐng)域，畜牧業(yè)，海洋水產(chǎn)，生物醫(yī)藥，環(huán)境科學(xué)，已經(jīng)成為生物科技研究的必備利器。轉(zhuǎn)錄組學(xué)在農(nóng)學(xué)領(lǐng)域有五大黃金應(yīng)用方向：生長發(fā)育、脅迫響應(yīng)、免疫互作、突變表型、品質(zhì)研究，其中生長發(fā)育和脅迫響應(yīng)研究項(xiàng)目所占比例最多。隨著三代全長測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)（如PacBio），轉(zhuǎn)錄組研究內(nèi)容變得豐富多彩。通過全長轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，我們不僅可以獲得全長序列，還可進(jìn)行可變剪切、APA、融合基因，新基因的研究，大大豐富了研究內(nèi)容，提高了論文的質(zhì)量。
對(duì)于無參物種、基因組組裝或注釋不完善的物種，用普通的二代無參轉(zhuǎn)錄測(cè)序，我們將會(huì)獲得不好的轉(zhuǎn)錄本序列信息，注釋和定量結(jié)果。對(duì)于這種情況，我們可以采用PacBio單樣本全長轉(zhuǎn)錄組方案設(shè)計(jì)模式，利用三代獲得全長轉(zhuǎn)錄本庫，作為二代數(shù)據(jù)的參考基因組使用，大大提升了數(shù)據(jù)質(zhì)量。接下來小編給大家解讀兩篇鯉魚應(yīng)對(duì)脅迫反應(yīng)機(jī)制的成功案例，從實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)，分析內(nèi)容，發(fā)表文章IF分?jǐn)?shù)，我們可以充分了解到三代PacBio測(cè)序的優(yōu)勢(shì)。
英文標(biāo)題：IntegrativeTranscriptomicAnalysisRevealstheImmuneMechanismfora CyHV-3-ResistantCommonCarpStrain
中文標(biāo)題：轉(zhuǎn)錄組分析揭示CyHV-3抗性鯉魚品系的免疫機(jī)制
發(fā)表雜志：Frontiersinimmunology.2021
影響因子：7.561
合作單位：中國水產(chǎn)科學(xué)院黑龍江水產(chǎn)研究所
DOI：10.3389/fimmu.2021.687151
材料：德國鏡鯉G4：CyHV-3抗性篩選后的第四代，G4（實(shí)驗(yàn)組）和非抗病育種品系（對(duì)照組）用于病毒脅迫。
實(shí)驗(yàn)方法：將患病魚內(nèi)臟勻漿溶液添加到水箱中，從而誘導(dǎo)CyHV-3感染兩個(gè)品系。
測(cè)序策略：Illumina測(cè)序：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別取病毒刺激后第0天和第7天，獲得前腎樣本，每組3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。PacBio全長測(cè)序：取肝臟、脾臟和腎臟的混合物，各兩生物學(xué)重復(fù)。
轉(zhuǎn)錄組分析的策略
研究背景
鯉魚皰疹病毒-3（CyHV-3）感染是鯉魚養(yǎng)殖的主要威脅，可導(dǎo)致鯉魚大量的死亡。CyHV-3可通過削弱宿主的免疫系統(tǒng)而使其死亡，導(dǎo)致其對(duì)病原微生物易感性，并可能在感染后6至10天內(nèi)出現(xiàn)發(fā)病和死亡。感染CyHV-3后存活下來的鯉魚可以抵抗這種病毒未來的感染。由于CyHV-3在鯉魚中存在潛伏期和持續(xù)性攜帶期，遺傳背景對(duì)于了解對(duì)病毒的耐藥性至關(guān)重要。德國鏡鯉品系G4是中國廣泛栽培的鯉魚品系，但因CyHV-3病毒引起高死亡率。然而目前在研究抗CyHV-3免疫機(jī)制的詳細(xì)免疫系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)方面，還缺乏系統(tǒng)的研究。最近的研究表明，lncRNAs在不同類型病原體感染時(shí)的廣泛差異表達(dá)，表明lncRNAs在魚類免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。然而，在CyHV-3感染期間，鯉魚體內(nèi)的特異性LncRNA對(duì)免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)尚未被研究。第三代測(cè)序（如PacBio）可以解碼比第二代測(cè)序方法（如Illumina）更長的基因序列，包括mRNA和非編碼RNA在內(nèi)的更高質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄本組裝，可能提供對(duì)遺傳抗性機(jī)制的更詳細(xì)理解。在本研究中，為了揭示鯉魚抗CyHV3育種中涉及的免疫機(jī)制，使用圖1所示的策略，對(duì)CyHV-3激發(fā)期間的mRNA和長非編碼RNA（lncRNA）進(jìn)行了整合轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。對(duì)來自繁殖品系或非繁殖品系的存活鯉魚和健康對(duì)照鯉魚的免疫相關(guān)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了分析。
研究內(nèi)容
在CyHV-3感染后第0天和第7天提取鯉魚頭腎組織，并通過Illumina和PacBio測(cè)序分析轉(zhuǎn)錄組。在對(duì)涉及的GOterm和KEGG途徑進(jìn)行分析。加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析用于揭示lncRNA對(duì)免疫基因的調(diào)節(jié)。結(jié)果表明，繁殖鯉魚品系通過一種特定的先天免疫機(jī)制對(duì)CyHV-3感染產(chǎn)生了顯著的抗性,主要的生物學(xué)過程是自噬、吞噬、細(xì)胞毒性和凝集素和MUC3阻斷病毒。此外，還有免疫抑制信號(hào)途徑，如IL21R對(duì)STAT3的抑制，PI3K介導(dǎo)的感染時(shí)多巴胺對(duì)炎癥的抑制，以及NLRC3在穩(wěn)定狀態(tài)下對(duì)STING的抑制。從非抗性品系中還發(fā)現(xiàn)了CyHV-3的可能易感因素，如ITGB1、TLR18和CCL4。本研究結(jié)果還表明，LncRNA調(diào)節(jié)的Nramp和PAI分別促進(jìn)病毒感染和感染細(xì)胞的增殖，而T細(xì)胞白血病同源框3(TLX3），以及l(fā)ncRNA的半乳糖凝集素3可能在抗病制中發(fā)揮作用。因此，免疫遺傳不敏感或易受CyHV-3感染的免疫因子已被揭示。
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