項(xiàng)目文章NEURO（IF:15.9) | 罕見病脊索瘤治療新機(jī)制？單細(xì)胞空間組學(xué)來揭示！

2024年1月，湖南省南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院在國際學(xué)術(shù)期刊Neuro-Oncology發(fā)表一項(xiàng)重要研究成果，題為：Integrating single-cell and spatial transcriptomics reveals endoplasmic reticulum stress-related CAF subpopulations associated with chordoma progression。該研究使用單細(xì)胞 RNA 測序 (scRNA-seq)、空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)、批量 RNA-seq 和多重定量免疫熒光 (QIF) 來剖析脊索瘤中 CAF 的異質(zhì)性、空間分布和臨床意義。

文章標(biāo)題：Integrating single-cell and spatial transcriptomics reveals endoplasmic reticulumstress-related CAF subpopulations associated with chordoma progression

期刊名稱：Neuro-Oncology

影響因子：15.9

合作單位：湖南省南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院

研究部位：脊索瘤

研究方法：scRNA-seq、空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)、RNA-seq、QIF等

百邁客生物為該研究提供了空間轉(zhuǎn)錄組測序服務(wù)。

研究背景

脊索瘤被認(rèn)為是由原始脊索的殘余物產(chǎn)生的，是一種罕見的局部侵襲性間葉性腫瘤。脊索瘤的年發(fā)病率約為百萬分之 0.8，并且優(yōu)先發(fā)生在骶骨和顱底區(qū)域。脊索瘤對傳統(tǒng)化療不敏感，目前的最佳治療方法是初始最大手術(shù)切除輔以輔助放射治療，這為患者提供了最佳的臨床結(jié)果。然而，由于由于腫瘤的浸潤性和鄰近關(guān)鍵神經(jīng)血管結(jié)構(gòu)，根治性切除腫瘤具有挑戰(zhàn)性。因此，許多患者在手術(shù)后出現(xiàn)局部腫瘤復(fù)發(fā)甚至轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致生活質(zhì)量和長期生存不良。鑒于這一令人沮喪的事實(shí)，迫切需要揭示其分子生物學(xué)和分子生物學(xué)機(jī)制來開發(fā)出針對該疾病更有效的治療方法。

實(shí)驗(yàn)材料

自 3 個(gè)原發(fā)腫瘤樣本和 3 個(gè)復(fù)發(fā)腫瘤樣本的 72 097 個(gè)單細(xì)胞以及作為對照的 3 個(gè)髓核樣本進(jìn)行了測序單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組測序。對 126 名患者的總RNA-seq 測序。另外針對105名患者開展QIF試驗(yàn)。

1、scRNA-seq：收集了 6 份脊索瘤樣本（包括 3 份原發(fā)腫瘤和 3 份復(fù)發(fā)腫瘤）和 3 份髓核標(biāo)本進(jìn)行 scRNA-seq。

2、Bulk RNA-seq：總共檢索了 126 個(gè)腫瘤樣本（包括 93 個(gè)原發(fā)腫瘤和 33 個(gè)復(fù)發(fā)腫瘤）進(jìn)行總RNA 測序。

3、空間組學(xué)測序：三個(gè)新鮮腫瘤標(biāo)本（包括 2 個(gè)原發(fā)腫瘤和 1 個(gè)復(fù)發(fā)腫瘤）用于 ST 測序。

4、QIF：QIF 使用 Opal 7 色手動 IHC 試劑盒（PerkinElmer，Waltham，馬薩諸塞州）進(jìn)行。

研究結(jié)果

1.單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組譜鑒定脊索瘤微環(huán)境中功能獨(dú)特的 CAF 群體

該研究通過生成 6 名脊索瘤患者（包括 3 名原發(fā)性腫瘤和 3 名復(fù)發(fā)性腫瘤）和 3 名匹配的 LDH 患者組織的單細(xì)胞基因表達(dá)譜，總共獲得72097個(gè)細(xì)胞，其中46987個(gè)細(xì)胞來自脊索瘤，25110個(gè)來自NP組織樣本。如圖1A-B所示，a總共鑒定了49個(gè)細(xì)胞簇，這些簇的注釋導(dǎo)致了10種細(xì)胞類型的分離。被鑒定為上皮樣細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、T 細(xì)胞和 B 細(xì)胞的細(xì)胞屬于多個(gè)簇，表明這些細(xì)胞類型是異質(zhì)的（圖 1B）。與NP組織相比，脊索瘤組織中存在較多上皮樣細(xì)胞，尤其是復(fù)發(fā)腫瘤中。此外，原發(fā)性和復(fù)發(fā)性脊索瘤均顯示軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞比例下降（圖 1C）。10 個(gè)細(xì)胞亞群的代表性基因的表達(dá)如圖 1D-E 所示。這些結(jié)果共同表明上皮樣細(xì)胞代表腫瘤細(xì)胞。

為了定義成纖維細(xì)胞亞群，該研究根據(jù)特定細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)，確定了脊索瘤和 NP 組織樣本中的 6 個(gè)主要成纖維細(xì)胞亞群（圖 2A 和 B）。為了可視化 6 個(gè) CAF 亞組之間的關(guān)鍵差異，作者生成了一個(gè)熱圖，顯示每個(gè)簇中前 10 個(gè) DEG 的表達(dá)水平（圖 2C）。在6個(gè)成纖維細(xì)胞亞群中，成纖維細(xì)胞-1和-5僅在脊索瘤中觀察到，表明它們是脊索瘤特異性的CAF（圖2D）。比較分析表明，CAF、癌細(xì)胞和正常成纖維細(xì)胞的干性和細(xì)胞周期評分沒有顯著差異（圖2E）。功能富集分析表明，CAF 與成纖維細(xì)胞和癌細(xì)胞具有共同的活性（圖 2F），與之前的觀察結(jié)果一致。在轉(zhuǎn)錄組水平上，CAF高表達(dá)成纖維細(xì)胞（例如COL1A1和COL6A1）和腫瘤細(xì)胞（例如SPP1和RARRES21；圖 2G）。

2.成纖維細(xì)胞聚集揭示了與脊索瘤進(jìn)展相關(guān)的獨(dú)特亞群

為了識別CAF亞群并闡明其功能，作者進(jìn)一步對脊索瘤組織中的所有CAF（即成纖維細(xì)胞-1和-5細(xì)胞）進(jìn)行了降維分析。該研究確定了 4 個(gè) CAF 亞群（包括 CAF-1、CAF-2、CAF-3 和 CAF-4），其中 CAF-1 和 CAF-2 為主要亞型（圖 3A），全部它們高度表達(dá) CAF 的假定標(biāo)記基因，包括 POSTN、THY1、ACTA2、FBLN1、FAP 和 PDGFRA（圖 3B）。該研究生成了一個(gè)熱圖來可視化 4 個(gè) CAF 簇之間的基因表達(dá)差異（圖 3C）。分析CAF亞群的起源，發(fā)現(xiàn)CAF簇2存在于復(fù)發(fā)腫瘤中，簇3和簇4存在于原發(fā)腫瘤組織中，簇1存在于兩種腫瘤組織中（圖3D）。基于GO富集分析，觀察到CAF簇2與ERS反應(yīng)相關(guān)，并以ERS相關(guān)和缺氧基因的高表達(dá)為特征（HSPA1A，HSPA1B，CCL2，DNAJB1，HSPA6，HIF1A，BAG3，和VEGFA；圖3E和F）。發(fā)現(xiàn) CAF 簇 1 與 SPP1、RBP4、AGT、SFRP2 和 ENPP1 高表達(dá)的能量代謝相關(guān)（圖 3E 和G）。CAF 簇 3 與中性粒細(xì)胞激活相關(guān)，并表達(dá) MMP9、ACP5、CKB、TPM1 和 SERPINE1（圖 3E）。CAF 簇 4 主要促進(jìn)骨骼系統(tǒng)發(fā)育，表達(dá) IBSP、IFITM5、DLX5、HHIP、?和 GADD45B（圖 3E 和 I）。

3.GSVA 表明 ERS-CAF 特征評分與脊索瘤進(jìn)展相關(guān)

為了驗(yàn)證 ERS-CAF 的促腫瘤作用，該研究對來自脊索瘤患者的 126 個(gè)樣本進(jìn)行了總 RNA 測序（圖 4A）。使用代表該 CAF 子集的基因集計(jì)算每位患者的 ERS-CAF 特征評分，其中包括 ERS 相關(guān)基因（例如 HSPA1A、HSPA1B、CCL2 和 DNAJB1）和 CAF 特定標(biāo)記（例如 THY1、FAP、?和 COL1A1）。ERS-CAF 特征評分與臨床數(shù)據(jù)之間的關(guān)系如圖 4B 所示。如上所示，ERS-CAF特征評分與腫瘤侵犯周圍肌肉（P?<?0.0001）、腫瘤分級（P?=?0.011）、AJCC分期（P?=?0.011）顯著相關(guān)。P?=?0.007）和手術(shù)切緣（P?=?0.002）。與原發(fā)腫瘤患者相比，復(fù)發(fā)腫瘤患者的 ERS-CAF 特征較高（-0.06?±?0.53 vs. -0.10?±?0.51），但這種差異并不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t?=?-0.404）?，p?=?0.687）。對于生存分析，作者使用在線平臺確定ERS-CAF特征評分的閾值，并根據(jù)截止點(diǎn)將患者分為高（>截止）和低（≤截止）亞組。Kaplan-Meier 分析表明，ERS-CAF 特征評分的增加可預(yù)測不利的 LRFS 和 OS（圖 4C），在控制 Cox 多元回歸模型中的重要臨床因素后，這一結(jié)果仍然顯著（圖4D–E）。這些數(shù)據(jù)表明使用 GSVA 特征來反映脊索瘤組織中的 ERS-CAF 亞群的可靠性，并強(qiáng)調(diào)了 ERS-CAF 在調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展中的重要性。

4.ERS-CAF 可能從多個(gè)方面促進(jìn)脊索瘤進(jìn)展

為了推斷ERS-CAF亞群促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的可能機(jī)制，該研究使用CellChatDB數(shù)據(jù)庫來剖析CAF亞群與其他細(xì)胞類型之間的細(xì)胞間通訊。結(jié)果表明，CAF 亞群（尤其是 ERS-CAF 和 CAF 簇 1）顯著激活并與多種細(xì)胞相互作用（圖 5A 和 B）。鑒定出許多配體-受體對，以證明 ERS-CAF 與脊索瘤中主要細(xì)胞類型之間廣泛的分子相互作用。對于傳入信號，ERS-CAF 主要接受來自 CD46、EFG、SELL、NGF、NRXN 和 HH 分子的信號（圖 5D）。在發(fā)送信令方面，ERS-CAF 主要產(chǎn)生 TENASCIN、IGF、LIFR、NGF、THBS、GDF 和 JAM 信號（圖 5D）。此外，ERS-CAF 被證明是多個(gè)細(xì)胞通訊網(wǎng)絡(luò)中的核心細(xì)胞，包括 JAM、THBS 和 GDF 信號通路（圖 5E），所有這些都已被證明在細(xì)胞通訊網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著重要作用。此外，該研究對 10 個(gè)腫瘤組織樣本進(jìn)行了 QIF 檢測，以進(jìn)一步證實(shí) ERS-CAF 與腫瘤細(xì)胞之間 JAM2 和 JAM3 的相互作用信號傳導(dǎo)。研究發(fā)現(xiàn)，JAM2/JAM3 信號在腫瘤細(xì)胞靠近 ERS-CAF 的區(qū)域表達(dá)更多。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明 ERS-CAF 可以通過各種分子機(jī)制促進(jìn)脊索瘤進(jìn)展。

5.ERS-CAF 與其他細(xì)胞類型之間的空間關(guān)系

為了進(jìn)一步剖析脊索瘤組織中 ERS-CAF 的空間特征，該研究對 3 個(gè)新鮮腫瘤樣本（包括 2 個(gè)原發(fā)腫瘤和 2 個(gè)復(fù)發(fā)腫瘤）進(jìn)行了空間轉(zhuǎn)錄組測序；圖 6A 和 G ）。在 ST 數(shù)據(jù)中觀察到 UMI 和標(biāo)記基因之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性（圖 6B 和 H），表明質(zhì)量令人滿意。上皮樣細(xì)胞（KRT8）、單核吞噬細(xì)胞（CD14）、T細(xì)胞（CD3D）、內(nèi)皮細(xì)胞（）的標(biāo)記基因PECAM1）、中性粒細(xì)胞（CSF3R）、B 細(xì)胞（CD79A）、成纖維細(xì)胞（COL2A1）和壁細(xì)胞（ACTA2）在 ST 數(shù)據(jù)中檢測到（圖 6C 和 I）。隨后，通過 UMAP 方法降維，在原發(fā)性和復(fù)發(fā)性腫瘤樣本中識別出 8 個(gè)主要細(xì)胞簇（圖 6D 和 J）。作者在原發(fā)性腫瘤中觀察到 CAF 簇 1，而在復(fù)發(fā)腫瘤標(biāo)本中觀察到 CAF 簇 1 和 ERS-CAF（圖 6D 和 J）。這些發(fā)現(xiàn)通過 CAF 標(biāo)記基因表達(dá)分析（圖 6E 和 K）以及 MIA 結(jié)果（圖 6F 和 L）得到證實(shí)。

 

研究總結(jié)

該研究使用?scRNA-seq?對來自?3?個(gè)原發(fā)腫瘤樣本和?3?個(gè)復(fù)發(fā)腫瘤樣本的?72 097?個(gè)單細(xì)胞以及作為對照的?3?個(gè)髓核樣本進(jìn)行了測序。在復(fù)發(fā)性腫瘤中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)獨(dú)特的?CAF?簇，該簇高度表達(dá)缺氧基因，并且在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激?(ERS)?中功能豐富。擬時(shí)序分析和細(xì)胞通訊分析表明，該ERS-CAF亞群起源于正常成纖維細(xì)胞，并與腫瘤和免疫細(xì)胞廣泛相互作用。通過分析?126?名患者的大量?RNA-seq?數(shù)據(jù)，研究發(fā)現(xiàn)?ERS-CAF?特征評分與脊索瘤的侵襲和不良預(yù)后相關(guān)。通過將?scRNA-seq?的結(jié)果與空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)相結(jié)合，證明了脊索瘤組織中?ERS-CAF?的存在，并揭示了這種?CAF?亞型與其周圍的腫瘤細(xì)胞最接近。在隨后涉及?105?名額外患者的?QIF?驗(yàn)證中，研究證實(shí)?ERS-CAF?在脊索瘤微環(huán)境中豐富且靠近腫瘤細(xì)胞。此外，ERS-CAF?密度及其與腫瘤細(xì)胞的距離均與腫瘤惡性表型和不良患者預(yù)后相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)描繪了脊索瘤的?CAF?情況，并可能為新型治療方法的開發(fā)提供見解。