【成功案例】-人類顳葉皮層circRNA測序揭示顳葉癲癇的新認知

英文名：High-Throughput Data of Circular RNA Profiles in Human Temporal Cortex Tissue Reveals Novel Insights into Temporal Lobe Epilepsy
中文名：人類顳葉皮層組織的circRNA高通量測序揭示顳葉癲癇的新認知
雜志：Cell Physiol Biochem 2018
影響因子：5.104
合作單位：首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院北京神經外科研究所

01.研究背景

癲癇是一種常見的慢性神經系統(tǒng)疾病，影響近5000萬人，約占世界人口的0.4-1%。顳葉癲癇(TLE)是一種常見的癲癇，伴有藥物抵抗，需要對癲癇灶進行手術切除。人類的TLE病變包括了在鉤回、杏仁核和側顳葉皮層的異常，其中許多異常與興奮性離子通道和改變的離子型受體有關。全基因組表達譜揭示了在人的TLE組織中，離子通道和相關受體基因的模式發(fā)生了顯著的改變，但是這些基因表達如何被調控仍然未知。
最近的基因組學研究揭示了許多與各種疾病的基因調控相關的非編碼RNA (ncRNAs)。人類癲癇中非編碼RNA的表達也發(fā)生了改變，可以作為一種新的、非侵入性的生物標志物來改善目前的癲癇診斷。環(huán)狀RNA (circRNAs)是一種獨特的非編碼環(huán)狀RNA，circRNA與microRNAs (miRNAs)相互作用，并作為miRNA海綿，通過circRNA-miRNA-mRNA網絡在神經系統(tǒng)疾病中調節(jié)基因表達。研究表明環(huán)狀RNA在神經元功能中發(fā)揮重要作用，尤其是在突觸中。組織學研究結果證實，邊緣系統(tǒng)的突觸重組似乎能逐漸增強皮質興奮性，并可能導致癲癇發(fā)作。然而，circRNAs在癲癇中的作用仍是未知的。
在本研究中，為了評估circRNA在人體內的作用，作者采用了高通量測序方法，測定TLE患者和非TLE患者顳葉新皮質中circRNA表達水平，并對環(huán)狀RNA的功能進行了注釋。作者描述了一個包含潛在基因與circRNA-miRNA的網絡。

02.材料方法

試驗材料：非TLE對照組和TLE組患者的顳葉新皮質組織
測序方法：circRNA seq，Illumina HiSeq4000（北京百邁客）

03.研究結果

1.臨床和病理數據
術中腦電圖（I-EEG）和免疫染色（NeuN和GFAP）結果表明，相比于非TLE對照組，TLE組患者具有典型的異常情況。

圖1. I-EEG和免疫染色結果

2.顳葉皮層circRNA表達譜
在兩組樣本中檢測出了78983個circRNA，15.29%為已知circRNA，84.71%是新發(fā)現(xiàn)的circRNA。其中，58558個circRNA位于外顯子區(qū)，10520個位于內含子區(qū)，其它位于基因間區(qū)（圖2a），不同類型circRNA的表達水平如圖2b所示。已知的circRNA整體表達水平比新circRNA高，外顯子circRNA表達水平高于內含子和基因間區(qū)的circRNA表達水平。表明樣本中大多數circRNA位于外顯子區(qū)，并且可能在癲癇中發(fā)揮調節(jié)作用。
所有circRNA和外顯子circRNA的GC含量高于circRNA數據庫，但內含子和基因間區(qū)circRNA的GC含量與circRNA數據庫中相似（圖2c）。此外，circRNA長度的峰值主要集中在558 bp區(qū)域，而在數據庫中circRNA的峰值則集中在4105 bp區(qū)域。新circRNA與已知的circRNA長度具有相似的特征，表明新circRNA數據是可靠的（圖2d）。圖2e顯示了circRNA在人類染色體上的基因分布，circRNA也廣泛分布于所有的染色體中，但在Y染色體和著絲粒上的分布較少，在每條染色體的染色體臂兩端有較高的分布。

圖2. CircRNA表達譜

3.CircRNA差異表達分析及qPCR驗證
TLE與對照樣本之間有442個顯著差異表達的circRNA (FC≥2，F(xiàn)DR≤0.05)，其中254個下調，188個上調（圖3a）。circRNA的來源基因功能注釋結果表明，這些差異表達circRNA可能與GTPase活性、蛋白轉運和蛋白磷酸化等途徑有關，這些途徑在癲癇的發(fā)病機制中起著關鍵作用。為了找出功能性的差異表達circRNA，比較了100個差異表達最顯著的circRNA和GO數據庫中的5058個功能基因，從中找到了10個與神經功能相關的circRNAs 。
作者選擇了10個顯著差異表達的circRNA進行qPCR驗證，其中有8個circRNA差異顯著。結果表明，qPCR試驗結果與高通量測序結果基本一致。此外，還選擇了表達量差異最顯著的兩個circRNA（circ-EFCAB2、circa-DROSHA），在28個臨床樣本中進行qPCR試驗（圖3c），結果表明這兩個circRNA在對照組和TLE組之間顯著差異表達。綜上所示，發(fā)現(xiàn)了circ-EFCAB2和circ-DROSHA在TLE患者顳葉皮層組織中存在著異常調節(jié)。circ-EFCAB2和circ-DROSHA的來源基因分別為EFCAB2和DROSHA。EFCAB基因家族主要選擇性地與鈣離子非共價作用。EFCAB2上調會影響鈣離子的結合，從而導致癲癇的發(fā)生。DROSHA是一種雙鏈RNA特異內切核糖核酸酶，它影響miRNA生物合成的初始階段，其丟失會導致神經元和神經膠質異常、癲癇和神經退行性疾病。因此，circ-EFCAB2和circ-DROSHA可能是通過調節(jié)EFCAB2和DROSHA參與TLE。

圖3. 差異表達circRNA及其來源基因注釋、qPCR驗證

4.circRNA作為miRNA海綿參與癲癇發(fā)病的分子機制
為了確定circ-EFCAB2和circ-DROSHA的功能，利用TargetScan和Miranda來預測靶向miRNA。預測結果表明，circ-EFCAB2的前5個靶向miRNA分別為miR-5787、mir – 684 -5p、miR-3929、miR-6780a-5p和miR-4739，而circ-DROSHA的靶向miRNA分別為miR-1252-5p、miR-651-3p、miR-4446-5p、miR-548ab和miR-4762-3p。通過靶基因預測，找到了上述的10個miRNAs對應的靶基因，構建了circRNA-miRNA-mRNA網絡（圖4）。其中，circ-DROSHA的間接靶基因CLCN6是一種氯離子通道家族（CLCs）成員，它與電興奮性、跨上皮轉運、電中性和離子穩(wěn)態(tài)等多種生理過程有關；而其打分最高的靶向miR-1252-5p所對應的靶基因ATP1A2與癲癇具有很強的相關性，也是人類癲癇的候選基因。
由于circ-EFCAB2和circ-DROSHA被預測為這些miRNA的海綿，它們可能會吸附這些miRNA而影響靶基因的表達，從而影響TLE的發(fā)病機制。

圖4. circ-EFCAB2、circ-DROSHA調控網絡

由于circ-EFCAB2和circ-DROSHA被預測為這些miRNA的海綿，它們可能會吸收這些miRNA而影響靶基因的表達，從而影響TLE的發(fā)病機制。

總結

綜上所述，作者對TLE患者顳葉新皮質組織的circRNA表達譜進行了全面的分析，確定了癲癇患者的8個circRNA。其中顯著差異表達的circ-EFCAB2和circ-DROSHA可能是通過調節(jié)來源基于EFCAB2和DROSHA參與TLE，也可能作為miRNA的海綿影響靶基因的表達，參與TLE的發(fā)病機制（圖5）。

圖5. circ-EFCAB2、circ-DROSHA參與癲癇發(fā)生的分子機制示意圖

參考文獻：Li J, Lin H, Sun Z, et al. High-Throughput Data of Circular RNA Profiles in Human Temporal Cortex Tissue Reveals Novel Insights into Temporal Lobe Epilepsy[J]. Cellular Physiology and Biochemistry, 2018, 45(2): 677-691.