2018年7月20日，中山大學(xué)中山眼科中心眼科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院廣東省腦功能與疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和第三軍醫(yī)大學(xué)西南眼科醫(yī)院與北京百邁客生物科技有限公司合作的多組學(xué)研究文章發(fā)表在Nature Communications上，該研究從體細(xì)胞重編程出發(fā)，探究成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為誘導(dǎo)性神經(jīng)干細(xì)胞的分子機(jī)制，為神經(jīng)退行性疾病的治療提供了強(qiáng)有力的策略支持。以下是對(duì)該文章的詳細(xì)解讀。
摘要
????????由體細(xì)胞重編程的誘導(dǎo)性神經(jīng)干細(xì)胞（induced neural stem cells，iNSC）在神經(jīng)疾病的細(xì)胞替代療法和體外建模中具有巨大的潛力。已有研究證明將成纖維細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化成iNSC的方法依賴于幾個(gè)關(guān)鍵的神經(jīng)前體細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子（TF），這就提出了一個(gè)問(wèn)題：這種直接的重編程是否可以由非神經(jīng)前體細(xì)胞調(diào)控TF來(lái)實(shí)現(xiàn)。作者發(fā)現(xiàn)，非神經(jīng)前體細(xì)胞調(diào)控TFPtf1a可以將小鼠和人的成纖維細(xì)胞直接重編程為具有分化出神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的潛能和自我更新能力的iNSC，并在移植后可以改善阿爾茨海默病小鼠模型的認(rèn)知功能障礙。Ptf1a的重編程活性通過(guò)與Rbpj結(jié)合的非Notch信號(hào)依賴途徑，來(lái)維持NSC特化、自我更新和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)。同時(shí)作者的數(shù)據(jù)確定了這是一種用于研究和治療的更安全的非典型iNSC。
研究背景
????????包括阿爾茨海默?。ˋD）、亨廷頓舞蹈癥和青光眼在內(nèi)的神經(jīng)退行性疾病已經(jīng)成為威脅人類健康的全球性疾病。傳統(tǒng)的治療方法可以減緩疾病的惡化，但總體上是無(wú)效的，因?yàn)樵诓∽儾课粊G失的細(xì)胞得不到補(bǔ)充。但內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生效率低，不足以修復(fù)損傷或疾病所導(dǎo)致的缺陷。再生醫(yī)學(xué)目前關(guān)注的重點(diǎn)是如何產(chǎn)生大量的神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞或它們的前體細(xì)胞，這些細(xì)胞能夠在受累組織中整合并發(fā)揮作用，從而為損傷修復(fù)提供一個(gè)有希望的途徑。目前，人類胚胎干細(xì)胞（ESC）或誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPSC）的臨床應(yīng)用受到其致瘤風(fēng)險(xiǎn)的影響。相比之下，神經(jīng)干細(xì)胞（NSC）被證明是一種不容易發(fā)生腫瘤的安全細(xì)胞來(lái)源，因此為患者特異性細(xì)胞替代療法提供了強(qiáng)有力的策略，并為藥物發(fā)現(xiàn)和體外疾病建模提供了有用的工具。
體細(xì)胞重編程是一種獲得患者特異性NSC的有效方法。最近的研究表明，小鼠和人類體細(xì)胞可以通過(guò)特定的組織特異性轉(zhuǎn)錄因子（TF）和/或化學(xué)物質(zhì)實(shí)現(xiàn)重編程，轉(zhuǎn)化為誘導(dǎo)性NSC（iNSC）/神經(jīng)前體細(xì)胞。TF誘導(dǎo)iNSC的大多數(shù)情況中，重編程是通過(guò)單獨(dú)的Sox2或Sox2結(jié)合其它TF實(shí)現(xiàn)的。最近研究證明，一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)TF-Zfp521可以直接將人類成纖維細(xì)胞重編程為iNSC。因此，由TF誘導(dǎo)的體細(xì)胞重編程產(chǎn)生iNSC似乎嚴(yán)重依賴于Sox2或Zfp521，而這兩種TF通常在具有增殖能力的神經(jīng)前體細(xì)胞中表達(dá)，是體內(nèi)神經(jīng)發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)控因子。事實(shí)上，Sox2已被推測(cè)為iNSC直接重編程的主調(diào)節(jié)因子。這就引出了一個(gè)問(wèn)題：神經(jīng)前體細(xì)胞TF是否是這種直接重編程所必須的，以及非神經(jīng)前體細(xì)胞TF是否能夠?qū)崿F(xiàn)這種重編程。
在此之前，作者和其他研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量的TF，它們?cè)谝暰W(wǎng)膜發(fā)育過(guò)程中的有絲分裂期前體細(xì)胞和/或有絲分裂后細(xì)胞中表達(dá)，在控制視網(wǎng)膜細(xì)胞特化和分化方面起著關(guān)鍵作用。作者感興趣的是這些前體細(xì)胞TF和非前體細(xì)胞TF是否有能力將成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化成iNSC或功能神經(jīng)元。Ptf1a（pancreas TF-1α）是一個(gè)堿性螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH）TF，是視網(wǎng)膜、小腦、脊髓和胰腺發(fā)育中不可或缺的角色。作者發(fā)現(xiàn)，與其它典型的iNSC重編程TF不同，Ptf1a在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的有絲分裂后前體細(xì)胞中選擇性表達(dá)。此外，與作者檢測(cè)的其它視網(wǎng)膜TF不同的是，Ptf1a的異位表達(dá)可直接將小鼠和人類成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為可自我更新的、高效的三能性iNSC。這種重編程需要Ptf1a和Rbpj之間的Notch非依賴性互作，以及隨后的參與NSC穩(wěn)態(tài)的TF基因表達(dá)和Notch信號(hào)的激活。此外，ptf1a重編程的iNSC移植后可以改善AD小鼠模型的認(rèn)知功能。
材料與方法
1、RNA-seq
材料：miNSC（第10代小鼠誘導(dǎo)性神經(jīng)干細(xì)胞）、小鼠皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞（SCR029）和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）。測(cè)序平臺(tái)：Illumina HiSeq 4000。
2、ATAC-seq
材料：35000個(gè)MEF細(xì)胞，50,000個(gè)miNSC10細(xì)胞，50,000個(gè)SCR029細(xì)胞。測(cè)序平臺(tái)：Illumina HiSeq X Ten。
3、體內(nèi)外分化試驗(yàn)
4、行為學(xué)試驗(yàn)
筑巢試驗(yàn)，曠場(chǎng)試驗(yàn)，新物體識(shí)別試驗(yàn)，Y迷宮試驗(yàn)，morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。
研究結(jié)果
1.Ptf1a在CNS非神經(jīng)前體細(xì)胞中的表達(dá)
在E12.5時(shí)，Ptf1a的抗體免疫標(biāo)記表明，在視網(wǎng)膜、脊髓、小腦和后腦中幾乎沒(méi)有細(xì)胞共同表達(dá)Ptf1a和細(xì)胞增殖標(biāo)志物Ki67，表明Ptf1a在CNS分裂前體細(xì)胞中幾乎不表達(dá)。RNA-seq得到的結(jié)果與此一致，E14.5鼠的視網(wǎng)膜中Ptf1a低表達(dá)，神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)志物TF Sox2和Pax6高表達(dá)；與MEF相比，小鼠SCR029 NSC中Ptf1a未表達(dá)，而Sox2和Pax6高表達(dá)。同樣，E11.5-E18小鼠CNS中Ptf1a顯著低于神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)志物TF Pax6、Olig2、Zfp521。這些結(jié)果表明，Ptf1a是一種非神經(jīng)前體細(xì)胞TF，不太可能參與體內(nèi)NSC生成。
2.Ptf1a將MEF重編程為自我更新性iNSC
作者研究了Ptf1a是否有能力將MEF直接重編程為iNSC，發(fā)現(xiàn)當(dāng)MEF感染了強(qiáng)力霉素（Dox）可誘導(dǎo)的Ptf1a的慢病毒，并在含表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、堿性纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）和Dox的N3培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，它們開(kāi)始發(fā)生形態(tài)變化，在第6天形成群落，從第9天出現(xiàn)大量神經(jīng)球（圖1 a,b,d）。對(duì)照MEF感染Dox可誘導(dǎo)的GFP的慢病毒，幾乎沒(méi)有形成任何正常形狀的神經(jīng)球（圖1 b,d）。當(dāng)將多個(gè)ptf1a誘導(dǎo)的神經(jīng)球作為混合物收集、分離和再培養(yǎng)后，它們從第3天開(kāi)始迅速形成新的次代神經(jīng)球（圖1c），表明它們具有自我更新能力。
作者分別選取了初代神經(jīng)球，以克隆的方式獲得了多個(gè)重編程的小鼠iNSC （miNSC）細(xì)胞系。將它們分別單獨(dú)植入到有Dox的平板孔中，發(fā)現(xiàn)NSC形態(tài)的細(xì)胞逐漸從粘附的神經(jīng)球生長(zhǎng)。在含有或不含Dox的情況下，它們被進(jìn)一步擴(kuò)增和傳遞了30代。在約第10代時(shí)，所有miNSC細(xì)胞系不再生成神經(jīng)球，開(kāi)始變得均勻，并形成一個(gè)典型的NSC單層。與前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的每個(gè)克隆形成的miNSC具有自我更新能力一致，作者發(fā)現(xiàn)~ 32.6%的miNSC10細(xì)胞被EdU 脈沖標(biāo)記，高于野生型鼠NSC細(xì)胞系SCR029（18.9%）（圖1 e,f）。因此，通過(guò)Ptf1a重編程MEF得到的miNSC具有增殖能力和自我更新能力。相比之下，被GFP慢病毒感染的MEF并不能產(chǎn)生典型的NSC標(biāo)記物免疫性的神經(jīng)球，形成的少數(shù)球狀體看起來(lái)異常，并且在培養(yǎng)時(shí)沒(méi)有任何擴(kuò)增能力。
圖1 ptf1a直接將MEF轉(zhuǎn)化為神經(jīng)球
????????為了證實(shí)Ptf1a確實(shí)直接將MEF誘導(dǎo)為miNSC，作者使用針對(duì)多個(gè)NSC標(biāo)志物的抗體進(jìn)行了免疫熒光染色。結(jié)果表明外源性Ptf1a在神經(jīng)球中高表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)NSC標(biāo)志蛋白Sox2、Pax6、Olig2和Nestin的顯著表達(dá)（圖2a）。在單層miNSC中，Sox2、Pax6和Nestin的表達(dá)量仍然很高（圖2a）。qRT-PCR結(jié)果與蛋白表達(dá)水平相一致（圖2b）。相比之下，與小鼠ESC相比，miNSC細(xì)胞系中多能性基因Oct4、Nanog和Klf4的表達(dá)量很少，甚至沒(méi)有表達(dá)（圖2c）。此外，由于細(xì)胞命運(yùn)的改變，miNSC細(xì)胞系中MEF標(biāo)志基因Snai1、Twist2和Col1a1的表達(dá)顯著減少（圖2d）。與miNSC中Nestin基因的轉(zhuǎn)錄活性一致，其啟動(dòng)子在miNSC和對(duì)照SCR029細(xì)胞中低甲基化，但在MEF中高甲基化（圖2e）。然而，Oct4和Nanog的啟動(dòng)子在這三種細(xì)胞類型中都是高甲基化的（圖2e)，這與這些細(xì)胞中多能性基因表達(dá)量很少的結(jié)果是一致的。
圖2 ptf1a重編程的NSC特征分析
????????Six3是一個(gè)前腦腹側(cè)和視網(wǎng)膜前體細(xì)胞的標(biāo)志性TF。作者通過(guò)semi-qRT-PCR和qRT-PCR發(fā)現(xiàn)，與MEF相比，ptf1a重編程的miNSC中Six3表達(dá)明顯增加。Six3-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠與R26R-YFP報(bào)告小鼠雜交胚胎分離培養(yǎng)的MEF被Ptf1a慢病毒感染后，它形成了含有許多黃色熒光蛋白（YFP）和Nestin都呈陽(yáng)性的神經(jīng)球，這表明Ptf1a可能誘發(fā)前腦和視網(wǎng)膜前體細(xì)胞的一些干細(xì)胞特征。
為了進(jìn)一步確認(rèn)這些miNSC的NSC身份，作者對(duì)miNSC10、SCR029和MEF細(xì)胞進(jìn)行了RNA-seq分析。miNSC10、SCR029和MEF細(xì)胞中基因表達(dá)水平的散點(diǎn)圖顯示，miNSC10和SCR209細(xì)胞的基因表達(dá)水平相似，但均與MEF存在顯著差異（圖3a-c）。與這些結(jié)果一致的是，聚類分析也顯示出miNSC10和SCR029細(xì)胞之間有很高的相似性，但它們與MEF之間有很大的差異（圖3d）。與MEF相比，miNSC中有許多基因表達(dá)水平下調(diào)或上調(diào)（圖3e）。作者對(duì)上調(diào)基因進(jìn)行基因集富集分析（GSEA），發(fā)現(xiàn)了兩組主要的富集基因GO term（圖3f）。其中一組在與神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的GO term中富集，如神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)元分化、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、神經(jīng)發(fā)生調(diào)節(jié)、大腦發(fā)育和軸突發(fā)生。另一組富集在細(xì)胞分裂GO term，包括細(xì)胞分裂、有絲分裂細(xì)胞周期、核分裂、姐妹染色單體分離、細(xì)胞周期調(diào)控。這些數(shù)據(jù)與miNSC作為NSC及其增殖和自我更新能力是一致的。與此一致的是，進(jìn)一步的分析顯示，盡管有一定的差異，但miNSC10、SCR029、NS528（小鼠ES細(xì)胞來(lái)源的NSC）和ciNSC10 （化學(xué)誘導(dǎo)MEF形成的NSC）細(xì)胞之間的相似性比MEF更大。
圖3 iNSC、對(duì)照NSC和MEF的基因表達(dá)圖譜
????????Ptf1a在分裂的胰腺原基中表達(dá)，在產(chǎn)生多潛能胰腺前體細(xì)胞中起重要作用。此外，胰腺干細(xì)胞和NSC均特征性表達(dá)Nestin。因此，ptf1a重編程的miNSC也可能可以代表胰腺干細(xì)胞。作者通過(guò)semi-qRT-PCR檢測(cè)胰腺前體細(xì)胞和分化細(xì)胞的一系列標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)均未在miNSC中表達(dá)，排除了ptf1a重編程miNSC可以作為胰腺干細(xì)胞的可能性。
3.Ptf1a重編程miNSC的三能性
作者想要解決的問(wèn)題是由非神經(jīng)前體細(xì)胞TF Ptf1a重編程的miNSC是否可以與NSC 一樣，具有分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的潛力（圖4a）。當(dāng)在神經(jīng)分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，短短幾天內(nèi)，miNSC就發(fā)生了穩(wěn)健的形態(tài)學(xué)變化，細(xì)胞體積變小、普遍的神經(jīng)突擴(kuò)張（圖4b)。在培養(yǎng)的2-3周，許多細(xì)胞分化為T(mén)uj1、Map2、Dcx、NeuN、Tau、peripherin或GABA免疫的神經(jīng)元（圖4c）。3周時(shí)的定量顯示，83.3%的細(xì)胞呈Tuj1陽(yáng)性（圖4e）。此外，不同miNSC細(xì)胞系（miNSC5、10、12）顯示類似的分化成Tuj1或Map2免疫的神經(jīng)元的能力（補(bǔ)充圖8）。在星形膠質(zhì)細(xì)胞分化條件下，87.2%的分化細(xì)胞形成神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（GFAP）免疫的星形膠質(zhì)細(xì)胞（圖4 c,e），少突膠質(zhì)細(xì)胞分化培養(yǎng)基中，miNSC能夠分化為O1、CNP或MBP免疫的少突膠質(zhì)細(xì)胞，而26.6%的分化細(xì)胞為O1陽(yáng)性（圖4 c,e）。因此，ptf1a重編程的miNSC具有三能性，能夠分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。
通過(guò)突觸素染色標(biāo)記試驗(yàn)、電生理特性分析表明了miNSC分化的神經(jīng)元具有活性膜特性（圖4d、f-j）。因此，ptf1a重編程的miNSC能夠分化為功能神經(jīng)元。
圖4 ptf1a重編程的NSC的體外分化潛能
????????作者評(píng)估了ptf1a重編程的miNSC在體內(nèi)分化成三種細(xì)胞系的潛能。將GFP標(biāo)記的miNSC慢病毒注射入成年小鼠海馬區(qū)，通過(guò)一系列免疫標(biāo)記試驗(yàn)表明，ptf1a重編程的miNSC具有在體內(nèi)分化為三種神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞的多能性（圖5）。另外，作者觀察到分化的神經(jīng)元形成具有典型的頭-頸結(jié)構(gòu)的成熟樹(shù)突棘，它們的樹(shù)突可以直接接觸周圍宿主細(xì)胞的多個(gè)突出蛋白陽(yáng)性的突觸前端（圖5），這表明miNSC分化的神經(jīng)元可以形成突觸連接和功能性集成到現(xiàn)有的神經(jīng)元回路。
圖5 ptf1a重編程的NSC的體內(nèi)分化潛能
4.miNSC對(duì)AD模型的治療效果
鑒于ptf1a誘導(dǎo)的miNSC在體內(nèi)具有活性和三種分化潛能，作者檢測(cè)了移植的miNSC是否對(duì)治療小鼠神經(jīng)退行性疾病模型有療效。將GFP標(biāo)記的miNSC移植到APP/PS1 AD小鼠模型的海馬區(qū)中。移植一個(gè)月后，作者進(jìn)行了一系列行為學(xué)試驗(yàn)來(lái)評(píng)估移植動(dòng)物的認(rèn)知功能（圖6a）。在筑巢試驗(yàn)中，注射生理鹽水和miNSC的小鼠的巢質(zhì)量沒(méi)有差異（圖6b）。在曠場(chǎng)試驗(yàn)中，兩組小鼠的運(yùn)動(dòng)總距離或中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間也沒(méi)有差異（圖6c)。
為了研究學(xué)習(xí)記憶行為，進(jìn)行了新物體識(shí)別試驗(yàn)、Y迷宮試驗(yàn)和Morris水迷宮試驗(yàn)。結(jié)果表明，對(duì)照和miNSC注射小鼠在新物體識(shí)別試驗(yàn)中花費(fèi)在新物體上的時(shí)間沒(méi)有差異，在Y迷宮試驗(yàn)中正確自發(fā)性交替（SAP）的總百分比沒(méi)有差異（圖6 d,e）。然而，Morris水迷宮試驗(yàn)表明，在試驗(yàn)第6天，miNSC移植小鼠相比于對(duì)照組平均逃避潛伏期明顯降低（圖6），并且這些移植小鼠在目標(biāo)象限的逗留時(shí)間更長(zhǎng)（圖6f）。此外，移植小鼠似乎對(duì)目標(biāo)平臺(tái)位置有偏好，但這一偏好沒(méi)有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖6f）。綜上所述，這些結(jié)果表明移植的miNSC可以顯著提高APP/PS1 AD小鼠模型的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。
作者也評(píng)估了miNSC對(duì)β-淀粉樣蛋白1-40（Aβ1-40）損傷AD小鼠模型的治療潛力。首先確定了Aβ1-40損傷小鼠的學(xué)習(xí)和記憶障礙小鼠與AD類似。將GFP標(biāo)記的miNSC在注射Aβ1-40 2周后移植到相同位置。兩個(gè)月后，作者進(jìn)行了同樣的行為學(xué)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)移植miNSC可以顯著提高APP / PS1和Aβ1-40損傷AD小鼠模型的空間學(xué)習(xí)和記憶能力，療效與ESC來(lái)源的NSC相似（圖6g-k）。
圖6 移植miNSC對(duì)APP / PS1和Aβ1-40損傷AD小鼠模型的療效
5.Ptf1a重編程對(duì)Rbpj互作的依賴性
先前有研究表明，Ptf1a與Rbpj、E-蛋白以非Notch信號(hào)依賴性方式形成DNA結(jié)合三聚體，以特化胰腺細(xì)胞系和GABA能神經(jīng)元。作者研究了Ptf1a和Rbpj之間非Notch信號(hào)依賴性的互作是否也是Ptf1a重編程所需要的。在MEF中，WB和免疫共沉淀結(jié)果顯示，Rbpj蛋白是內(nèi)源性表達(dá)，外源性表達(dá)的Ptf1a可以免疫共沉淀Rbpj。將Dox可誘導(dǎo)的 Ptf1aW298A（此突變體中Ptf1a與Rbpj的互作被破壞，但仍可與E-蛋白結(jié)合）慢病毒注射到MEF中，在注射6天后，沒(méi)有發(fā)生典型形態(tài)變化以形成細(xì)胞群落，只在9—14天產(chǎn)生了少數(shù)類似正常形態(tài)神經(jīng)球的群落，而注射了野生型Ptf1a病毒的MEF則在在9—14天，在12孔板中每板產(chǎn)生了數(shù)以百計(jì)的神經(jīng)球（圖7 b,c）。類似地，MEF感染Ptf1aW298A慢病毒后未能表達(dá)NSC標(biāo)志蛋白質(zhì)Sox2、Pax6或Nestin（圖7 d）。因此，與Rbpj的互作是Ptf1a重編程的先決條件。與此一致的是，敲除MEF中Rbpj的表達(dá)后，ptf1a誘導(dǎo)的神經(jīng)球的數(shù)量減少了兩倍多（圖7e-g）。
圖7 Ptf1a重編程依賴于與Rbpj的Notch信號(hào)非依賴性互作
6.TF和Notch信號(hào)調(diào)節(jié)iNSC內(nèi)穩(wěn)態(tài)
miNSC10 iNSC和SCR029 NSC的ATAC-seq結(jié)果表明，peak關(guān)聯(lián)基因富集在神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)元發(fā)育、大腦發(fā)育、膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育（圖8a, b），與NSC特征一致。在peak峰值中心300 bp窗口中鑒定新motif，說(shuō)明miNSC10和SCR029細(xì)胞都富集了類似的屬于多個(gè)TF家族的TF結(jié)合motif，TF家族包括Sox、bHLH (Ebox)、Pou3f、homeobox、Nfi和Rfx（圖8c）。相應(yīng)地，RNA-seq數(shù)據(jù)顯示，與MEF相比，這些TF基因家族的多個(gè)成員在miNSC10和SCR029細(xì)胞中上調(diào)或高表達(dá)。qRT-PCR證明，除了Sox2之外，Sox5、6、8、21在miNSC10和SCR029細(xì)胞中均表達(dá)上調(diào)。一般來(lái)說(shuō)，miNSC10細(xì)胞的ATAC-seq圖譜與SCR029細(xì)胞相似，但與MEF完全不同；而對(duì)于上調(diào)的TF基因，如Olig2（bHLH）、Sox2、Pou3f2/Brn2、Pax6 (homeobox)，與MEF相比，miNSC10和SCR029細(xì)胞中這些位點(diǎn)具有更多的峰和/或差異峰(圖8d-g），說(shuō)明更開(kāi)放的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)增加了基因表達(dá)。
與最富集的基序相對(duì)應(yīng)的6個(gè)TF家族都有助于維持NSC穩(wěn)態(tài)，如NSC狀態(tài)特化、自我更新、預(yù)防靜止和神經(jīng)分化（圖8h）。NSC的特化和維持需要Sox2。它通過(guò)與第3類POU域TF的互作遠(yuǎn)端增強(qiáng)子結(jié)合，特別是p3f2，它也涉及到ESC特化為神經(jīng)細(xì)胞系。Olig2通過(guò)激活促增殖基因來(lái)促進(jìn)NSC自我更新，同時(shí)通過(guò)抑制參與神經(jīng)元過(guò)早分化和干細(xì)胞靜止這些過(guò)程的基因來(lái)抑制這些過(guò)程。Pax6是一種眾所周知的同源盒TF，對(duì)于NSC的特化、自我更新、多能性和神經(jīng)發(fā)生至關(guān)重要。Lhx2同源盒TF通過(guò)激活Pax6的表達(dá)，同時(shí)減弱骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）和Wnt信號(hào)，從而在NSC特化中發(fā)揮作用。Nfi和Rfx家族成員已被證明與Sox2和Pou3f2共同占據(jù)基因組位點(diǎn)，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和靜止?fàn)顟B(tài)至關(guān)重要。
圖8 iNSC和NSC的染色質(zhì)可接近性和基因表達(dá)
????????Notch信號(hào)是一種典型的細(xì)胞接觸依賴性信號(hào)通路，是NSC增殖和自我更新所需的信號(hào)通路，也是防止NSC不及時(shí)的神經(jīng)分化所必需的信號(hào)通路。RNA-seq數(shù)據(jù)表明，相比于MEF，miNSC10和SCR029細(xì)胞中Notch信號(hào)相關(guān)基因Notch1、Dll1、Hes1和Hey1均顯著上調(diào)，并且這些位點(diǎn)也顯示出差異的ATAC-seq圖譜，說(shuō)明miNSC和NSC中的Notch信號(hào)均被激活以促進(jìn)其更新和維持。與Notch1、Dll1和Hes1基因的上調(diào)一致，它們的啟動(dòng)子與MEF相比，在miNSC10和SCR029細(xì)胞中被低甲基化。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)還表明，Ptf1a誘導(dǎo)的MEF中Notch1、Dll1和Hes1的表達(dá)具有時(shí)間依賴性，但對(duì)Rbpj表達(dá)無(wú)影響。為了確定Notch信號(hào)是否參與Ptf1a重編程MEF形成的神經(jīng)球的自我更新和維持，作者在重編程過(guò)程中應(yīng)用了Notch信號(hào)抑制劑DAPT。作者發(fā)現(xiàn)DAPT不僅減少了神經(jīng)球的數(shù)量，而且對(duì)Notch信號(hào)效應(yīng)基因Hes1和Hes5的下調(diào)作用具有劑量依賴性，說(shuō)明Ptf1a可以激活Notch信號(hào)通路，而Notch信號(hào)通路又是Ptf1a重編程的miNSC自我更新和維持所需要的。
7.Ptf1a將人成纖維細(xì)胞重編程為iNSC
使用類似于MEF重編程的方法，作者通過(guò)Dox可誘導(dǎo)的Ptf1a慢病毒的感染，從人包皮成纖維細(xì)胞（HFF）中生成神經(jīng)球（圖9a, b）。只有在沒(méi)有Dox的條件下擴(kuò)增和傳代時(shí)，才能獲得完整的單層hiNSC（圖9c,d）。無(wú)Dox傳代到20代時(shí)，開(kāi)始停止形成任何神經(jīng)球，而Dox的存在時(shí)，傳代到32代時(shí)仍可產(chǎn)生許多神經(jīng)球，這表明Dox可誘導(dǎo)的外源Ptf1a對(duì)典型的單層iNSC生成有抑制作用。qRT-PCR試驗(yàn)表明，在缺乏Dox的hiNSC中NSC標(biāo)志物SOX2、PAX6、OLIG2、NESTIN的表達(dá)水平比含有Dox的高幾倍，解釋了為什么缺乏Dox的hiNSC表現(xiàn)得更像典型的NSC。值得注意的是，在沒(méi)有Dox的情況下，hiNSC中內(nèi)源性PTF1a的表達(dá)水平比Dox存在時(shí)更高。
根據(jù)qRT-PCR結(jié)果，ptf1a重編程的hiNSC幾乎不表達(dá)多能性基因OCT4和NANOG。相反，它們高表達(dá)NSC標(biāo)志蛋白，包括SOX2、PAX6、NESTIN、OLIG2和FABP7（圖9 e-i）。體外分化試驗(yàn)表明hiNSC具有三能性（圖9p,j-n）因此，Ptf1a具有類似的活性，可將人類成纖維細(xì)胞重編程形成三能性NSC。作者通過(guò)突觸素染色標(biāo)記試驗(yàn)、電生理特性分析表明，ptf1a重編程的miNSC能夠分化為功能神經(jīng)元（圖9q,r-u）。
作者進(jìn)一步研究了ptf1a重編程hiNSC在體內(nèi)分化成神經(jīng)和膠質(zhì)細(xì)胞系的潛力。將帶GFP標(biāo)記的hiNSC移植到成年小鼠海馬區(qū)，發(fā)現(xiàn)ptf1a重編程的hiNSC在體外和體內(nèi)都具有分化成神經(jīng)和膠質(zhì)細(xì)胞系的多能性。
圖9 Ptf1a將人成纖維細(xì)胞重編程為iNSC
????????目前，人類胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的臨床應(yīng)用受到其致瘤風(fēng)險(xiǎn)的影響。相比之下，神經(jīng)干細(xì)胞（NSC）被證明是一種不容易發(fā)生腫瘤的安全細(xì)胞來(lái)源，因此為患者特異性細(xì)胞替代療法提供了強(qiáng)有力的策略，并為藥物發(fā)現(xiàn)和體外疾病建模提供了有用的工具。
在這項(xiàng)研究中，通過(guò)miNSC10、SCR029和MEF的RNA-seq基因的表達(dá)水平和功能確認(rèn)了miNSC的NSC身份。且相比于MEF，miNSC10和SCR029細(xì)胞中Notch信號(hào)相關(guān)基因均顯著上調(diào)，并且這些位點(diǎn)也顯示出差異的ATAC-seq圖譜，說(shuō)明miNSC和NSC中的Notch信號(hào)均被激活以促進(jìn)其更新和維持。并且采用抑制劑DAPT抑制Notch信號(hào)后Hes1和Hes5表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明Ptf1a可以激活Notch信號(hào)通路，且Notch信號(hào)也作用于Ptf1a重編程的miNSC自我更新和維持。
總而言之，文章數(shù)據(jù)表明非神經(jīng)前體細(xì)胞TF Ptf1a可獨(dú)立將小鼠和人類成纖維細(xì)胞成功地重編程為iNSC，其具有三能性，能夠高效分化為功能性神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，并可在移植后改善AD小鼠模型的認(rèn)知障礙。
作者簡(jiǎn)介
向孟清
中山大學(xué)中山眼科中心眼科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室課題組長(zhǎng)，博士，教授，博士生導(dǎo)師。研究方向：視網(wǎng)膜發(fā)育、再生和發(fā)病的分子機(jī)理和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究、視網(wǎng)膜和神經(jīng)干細(xì)胞的研究。領(lǐng)導(dǎo)課題組獲得了多項(xiàng)重大原創(chuàng)性和系統(tǒng)性的成果以及多項(xiàng)榮譽(yù)和獎(jiǎng)勵(lì)，其中包括Basil O’Connor起步學(xué)者研究獎(jiǎng)，Sinsheimer學(xué)者獎(jiǎng)，Wolf， Block， Schorr and Solis-Cohen， LLP聽(tīng)覺(jué)科學(xué)獎(jiǎng)等?，F(xiàn)已在Neuron、PNAS、J Neurosci、Development等雜志上發(fā)表學(xué)術(shù)論文60余篇。
肖冬長(zhǎng)（第一作者）
2013-2018年就讀于中山大學(xué)中山眼科中心分子醫(yī)學(xué)專業(yè)，期間參與多項(xiàng)課題，并已發(fā)表或者接收4篇SCI，包括Nature communications, Molecular brain，F(xiàn)rontiers in neuroscience和Developmental Neurobiology。
參考文獻(xiàn)
Dongchang Xiao, Mengqing Xiang, et al. Direct reprogramming of fibroblasts into neural stem cells by single non-neural progenitor transcription factor Ptf1a. Nature Communications. 2018,9:2865.
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