蔬菜基因定位的方法

表型調(diào)查：

分別2014、2015和2017年種植親本、F1及DH群體，2次田間重復(fù)，每個(gè)重復(fù)種植3株；由于2014年環(huán)境影響表型數(shù)據(jù)缺失度較高，如果用這個(gè)數(shù)據(jù)可能影響QTL定位分析，因此，后續(xù)作者利用BLUE分析來(lái)解決這種由于多年表型數(shù)據(jù)偏差，使得3年數(shù)據(jù)均得到利用。因空心莖這個(gè)表型調(diào)查比較困難，所以只簡(jiǎn)單的分為空心莖和非空心莖2種類(lèi)型。

方法：SLAF測(cè)序，HighMap構(gòu)建遺傳圖譜，IciMapping進(jìn)行QTL定位，MapQTL進(jìn)行BLUE分析及QTL定位

1、SLAF遺傳圖譜

測(cè)序數(shù)據(jù)與 TO1000基因組進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)率為75.99%，有24.01%是沒(méi)有比對(duì)上的，比對(duì)率較低主要是可能由于2種原因?qū)е隆蚪M差異和結(jié)構(gòu)變異。因?yàn)槲魈m花和甘藍(lán)型TO1000是2個(gè)品種，由此可見(jiàn)一個(gè)物種中一個(gè)品種的基因組并不能包含這個(gè)物種所有的信息。

開(kāi)發(fā)了185,349個(gè)SLAF標(biāo)記，其中，20,250個(gè)SLAF標(biāo)記可以成功分型，最終上圖的標(biāo)記為4787個(gè)，分布于9個(gè)LG中，構(gòu)建一張平均圖距為0.22cM的遺傳圖譜（如下圖），標(biāo)記間最大gap超過(guò)10cM，這可能是由于小孢子培養(yǎng)構(gòu)建DH群體的過(guò)程中，可能某種基因型更容易形成胚胎和再生植株，從而產(chǎn)生偏分離或某段染色體區(qū)域中無(wú)個(gè)體發(fā)生重組。

圖2 西蘭花遺傳圖譜

2、QTL定位

利用3年表型數(shù)據(jù)定位到8個(gè)相關(guān)位點(diǎn)，其中QHS.C09-1的表型變異率為15.6%（叮咚——有主效位點(diǎn)了，盤(pán)它），其余位點(diǎn)均為小于10%。還有上面的小助手BLUE也幫助找到了一個(gè)位點(diǎn)QHS.C09-2，其表型變異率為14.1%。其中QHS.C09-1和QHS.C09-2存在部分重疊，因此認(rèn)為QHS.C09-2也是與空心莖相關(guān)的主效QTL。

圖3 QTL定位結(jié)果

圖4 BLUE分析結(jié)果

開(kāi)發(fā)了406,563個(gè)SLAF標(biāo)簽，171,413個(gè)是為多態(tài)的，其中94,733個(gè)SLAF標(biāo)簽可成功分型，最終構(gòu)建了含有9,038 個(gè)標(biāo)記的遺傳圖譜，12個(gè)LGs，總圖距為1,586.78 cM，平均圖距為0.18 cM。基因組與遺傳圖譜共線性均≥0.9。

2、QTL定位

雙親、F1及F2:3家系，3年3個(gè)環(huán)境下的表型調(diào)查，發(fā)現(xiàn)雙親均為極端類(lèi)型，而F1和F2:3家系均趨向于中親類(lèi)型，認(rèn)為花期和單節(jié)花數(shù)為數(shù)量性狀。利用R/QTL定位到6個(gè)QTL，3個(gè)與花期相關(guān)，3個(gè)與單節(jié)花數(shù)相關(guān)。他們分別能夠解釋46.35-50.37%和99.13-99.76%的花期和單節(jié)花數(shù)的表型變異。利用QTL.gCIMapping.GUI定位到了2個(gè)與單節(jié)花數(shù)相關(guān)的新微效QTL。

3、候選基因預(yù)測(cè)

花期相關(guān)基因：針對(duì)主效QTL——Ft2.1進(jìn)行重點(diǎn)分析，它處于遺傳圖譜上的區(qū)間為0.763cM，對(duì)應(yīng)的Zunla-1基因組上物理區(qū)間為210Kb，包含25個(gè)基因，其中存在之前鑒定到的Capana02g000700基因，編碼花器官同源異型蛋白。進(jìn)化分析表明Capana02g000700的同源基因，金魚(yú)草LIP1和LIP2、擬南芥APETALA2和辣椒CaAP2，均在花器官發(fā)育階段存在重要作用。同時(shí)，比對(duì)雙親間序列差異，發(fā)現(xiàn)8個(gè)SNP標(biāo)記和1個(gè)6bp的InDel標(biāo)記，這導(dǎo)致親本CA1存在2個(gè)氨基酸的缺失和5個(gè)氨基酸的改變。繼DNA層面分析之后，RNA層面的分析qRT-PCR和RNA-seq表明，這個(gè)基因在雙親間存在差異表達(dá)，且在花器官中表達(dá)量最高，最終認(rèn)為Capana02g000700就是控制花期的候選基因。

單節(jié)花數(shù)相關(guān)基因：主效QTL——Mf2.1，它處于遺傳圖譜上的區(qū)間為0.382cM，對(duì)應(yīng)的Zunla-1基因組上物理區(qū)間為1400Kb，包含98個(gè)基因。單節(jié)花數(shù)是基于芽尖的分生組織變化產(chǎn)生的差異，已由報(bào)道表明營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變?yōu)樯成L(zhǎng)過(guò)程中，產(chǎn)生明顯表達(dá)差異的為轉(zhuǎn)錄因子（TF）。且Mf2.1定位區(qū)間內(nèi)也包含很多TFs。結(jié)合已報(bào)道的中間營(yíng)養(yǎng)分生組織、過(guò)渡分生組織和成花分生組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在過(guò)渡分生組織中多數(shù)基因表達(dá)是上調(diào)，其中包含不同家族的TF，因此將這些上調(diào)的TF作為控制單節(jié)花數(shù)的候選基因。

圖6 主效QTLFt2.1的局部連鎖圖和基因表達(dá)分析

4、基因共表達(dá)分析

WGCNA（加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析），是一種分析多個(gè)樣本表達(dá)模式的分析方法。該分析方法旨在尋找協(xié)同表達(dá)的基因模塊(module)，并探索基因模塊與關(guān)注的表型之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系，以及網(wǎng)絡(luò)中的核心基因。

利用之前研究的不同發(fā)育階段和不同組織部的WGCNA分析結(jié)果，找到了花器官發(fā)育特定模塊，其中包含107個(gè)基因。這些基因中10個(gè)為T(mén)Fs，其中就包含已鑒定的Capana02g000700，這表明這些TFs可能與花發(fā)育的轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)。這107個(gè)基因中，發(fā)現(xiàn)9個(gè)基因與Capana02g000700高度共表達(dá)，分為3個(gè)家族，且其功能均與花發(fā)育相關(guān)。上述，均表明Capana02g000700通過(guò)抑制靶基因和/或TF表達(dá)來(lái)控制花器官發(fā)育，進(jìn)而影響花期。

圖7 基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

1. 利用F2:3家系對(duì)F2群體表型進(jìn)行多年考查；
2. 利用BLUE分析解決當(dāng)不同年份的環(huán)境變化大的問(wèn)題；
3. 利用WGCNA找到目標(biāo)性狀調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和其中的核心基因。