The Architecture of SARS-CoV-2 Transcriptome SARS-CoV-2的轉(zhuǎn)錄組結(jié)構(gòu)
發(fā)表期刊：Cell
發(fā)表時(shí)間：2020年5月
IF：38.637
研究背景
COVID-19是由一種被稱為嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）的乙型冠狀病毒引起的。SARS-CoV-2與SARS-CoV、中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV），分別具有80％和50％的同源性，這些病毒在人群中的爆發(fā)表明冠狀病毒具有跨越物種壁壘并在人與人之間傳播的非凡能力。
這篇文章結(jié)合了兩種測(cè)序方法，Direct RNA sequencing (DRS)和sequencing-by-synthesis (SBS)，明確地繪制了SARS-CoV-2的亞基因組RNA（subgenomic RNAs），ORF和轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列（TRS）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)了許多與常規(guī)TRS介導(dǎo)的聚合酶跳躍不同的非常規(guī)RNA融合事件。發(fā)現(xiàn)了RNA修飾位點(diǎn)，并測(cè)量了gRNA和sgRNA的poly(A)的長(zhǎng)度。
研究方法
1.實(shí)驗(yàn)材料：
2.實(shí)驗(yàn)方法：
研究結(jié)果
1. SARS-CoV-2的轉(zhuǎn)錄組結(jié)構(gòu)
用MinION納米孔測(cè)序儀進(jìn)行了DRS測(cè)序，獲得了879,679個(gè)reads（1.9 Gb）（圖1A）。大部分（65.4％）的reads定位于SARS-CoV-2，表明病毒轉(zhuǎn)錄本占據(jù)主導(dǎo)地位，而宿主基因的表達(dá)被嚴(yán)重抑制。已知DRS無(wú)法對(duì)末端12 nt進(jìn)行測(cè)序，因此序列的5’末端缺失了12 nt（圖1B）。病毒基因組3’端的覆蓋度明顯高于5’端，這也反映了RNA直接測(cè)序從RNA3’端開(kāi)始測(cè)序的特點(diǎn)。病毒RNA中前導(dǎo)序列（72nt）的普遍存在導(dǎo)致在5’末端出現(xiàn)一個(gè)顯著的峰。在sgRNA的leader-body junction位點(diǎn)檢測(cè)到覆蓋度的明顯下降。此外，觀察到反映出非常規(guī)的“拼接”事件的reads，這樣的融合轉(zhuǎn)錄本導(dǎo)致5’末端覆蓋度的增加（圖1B，插圖）。
?圖1 Direct RNA?seq數(shù)據(jù)分析圖
用DNB-seq確認(rèn)和檢查CoV基因組的junctions。在junctions處繪制了5’和3’斷點(diǎn)，并通過(guò)計(jì)算跨越j(luò)unctions的reads來(lái)估算融合頻率（圖2A）。如所預(yù)期的，leader代表了最突出的5’ 位點(diǎn)（圖2A，x軸上的紅色星號(hào)）。TRS-B被檢測(cè)為3’位點(diǎn)的頂端（圖2A，y軸上的紅點(diǎn)）。這些結(jié)果證實(shí)，SARS CoV-2使用標(biāo)準(zhǔn)的TRS介導(dǎo)的模板轉(zhuǎn)換機(jī)制進(jìn)行不連續(xù)轉(zhuǎn)錄，以產(chǎn)生主要的sgRNA（圖2B）。跨越j(luò)unctions reads的定量比較顯示，N RNA是表達(dá)最豐富的轉(zhuǎn)錄本，其次是S，7a，3a，8，M，E，6和7b（圖2C）。
?圖2 病毒亞基因組RNA及其重組位點(diǎn)圖
ORF10僅由DNB數(shù)據(jù)中的一個(gè)reads表示（占病毒junction-spanning reads的0.000009％），并且DRS數(shù)據(jù)完全不支持它。ORF10與已知蛋白沒(méi)有顯著同源性。因此，ORF10可能不被表達(dá)?？偠灾琒ARS-CoV-2表達(dá)了9種規(guī)范性sgRNA（S，3a，E，M，6、7a，7b，8和N）和gRNA。
?圖3 SARS-CoV-2基因組結(jié)構(gòu)示意圖
SARS-CoV-2除了具有預(yù)期結(jié)構(gòu)和長(zhǎng)度的經(jīng)典sgRNA（圖4D），結(jié)果還顯示出許多次要的junction sites（圖4E–4G）。這種融合事件有三種主要類型。第一組中的RNA在位于ORF或UTR中間非預(yù)期的3’位點(diǎn)，前導(dǎo)序列（leader）與下游編碼序列（body）結(jié)合（圖4E，TRS-L-dependent noncanonical）。第二組顯示了與前導(dǎo)序列沒(méi)有相似性的序列之間的遠(yuǎn)距離融合（圖4F， TRS-L-independent distant）。最后一組局部融合，這導(dǎo)致較小的缺失，主要發(fā)生在結(jié)構(gòu)基因和輔助基因中，包括S ORF（圖4G，TRS-L-independent local recombination）。
?圖4 典型和非典型融合事件圖
2. SARS-CoV-2的poly(A)長(zhǎng)度
由于納米孔DRS基于RNA的單分子檢測(cè)，因此它提供了獨(dú)特的機(jī)會(huì)來(lái)檢查單個(gè)RNA分子的多個(gè)轉(zhuǎn)錄組特征。本文使用自己開(kāi)發(fā)的軟件根據(jù)DRS數(shù)據(jù)來(lái)測(cè)量ploy(A)尾的長(zhǎng)度（Y. Choi and H.C., unpublished data)。使用此軟件測(cè)量發(fā)現(xiàn)，與其他CoV一樣，SARS-CoV-2 RNA帶有ploy(A)尾（圖5A–5B）。病毒RNA尾的中位長(zhǎng)度為47 nt。全長(zhǎng)gRNA的尾巴比sgRNA更長(zhǎng)。值得注意的是，sgRNA具有兩個(gè)種群：一個(gè)在30 nt處的小峰和一個(gè)在45nt處的主峰（圖5B，箭頭）。之前研究發(fā)現(xiàn) bovine CoV mRNA的ploy(A)尾長(zhǎng)度在感染過(guò)程中發(fā)生了變化，在這項(xiàng)研究中觀察到的30 nt的短尾可能代表易于衰變的老化RNA。與宿主核基因組編碼的mRNA不同，病毒RNA具有均勻的長(zhǎng)度分布（圖5C）。
圖5 ?Poly(A) tail長(zhǎng)度圖
3. SARS-CoV-2的RNA修飾
研究人員用DRS數(shù)據(jù)檢測(cè)了SARS-CoV-2的表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)。病毒RNA修飾在40多年前就已描述過(guò)（Gokhale and Horner，2017）。為了明確研究RNA修飾，作者通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄病毒序列生成了陰性對(duì)照RNA，并對(duì)陰性對(duì)照進(jìn)行了直接RNA測(cè)序。注意到陰性對(duì)照和病毒轉(zhuǎn)錄本之間的離子電流之間的差異非常有趣（圖6A）。至少有41個(gè)位點(diǎn)顯示出實(shí)質(zhì)性差異（頻率超過(guò)20％），表明存在潛在的RNA修飾位點(diǎn)。值得注意的是，某些位點(diǎn)顯示的頻率取決于sgRNA的種類。圖6A–6C，S RNA上比N RNA修飾的位點(diǎn)更多，與S RNA相比ORF8 RNA上的修飾頻率更高。此外，修飾的堿基（圖6D，右）的停留時(shí)間比未修飾的堿基（圖6D，左）的停留時(shí)間長(zhǎng)，表明修飾會(huì)干擾RNA分子過(guò)孔速度。
圖6 RNA修飾位點(diǎn)圖
在41個(gè)潛在的修飾位點(diǎn)中，最常見(jiàn)的motif是AAGAA（圖7A和7B）。在整個(gè)病毒基因組中都發(fā)現(xiàn)了“AAGAA-like”motif的修飾位點(diǎn)（包括AAGAA和其他富含A/G的序列），尤其是在基因組28,500-29,500處特別豐富（圖7C）。病毒長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本（gRNA，S，3a，E和M）比短RNA（6、7a，7b，8和N）的修飾頻率更高（圖7D），表明該修飾是特定于某些RNA種類。因?yàn)镈RS可以同時(shí)檢測(cè)單個(gè)分子上的多個(gè)特征，所以作者交叉檢測(cè)了poly（A）尾長(zhǎng)和內(nèi)部修飾位點(diǎn)。有趣的是，修飾的RNA分子的poly（A）尾比未修飾的短（圖7E）。這些結(jié)果表明內(nèi)部修飾和3’尾之間存在聯(lián)系。由于poly（A）尾巴在RNA周轉(zhuǎn)中起重要作用，因此很容易推測(cè)所觀察到的內(nèi)部修飾與病毒RNA穩(wěn)定性控制有關(guān)。
圖7 檢測(cè)到的RNA修飾差異調(diào)節(jié)圖
討論
在這項(xiàng)研究中，作者描述了SARS-CoV-2的轉(zhuǎn)錄組和表觀轉(zhuǎn)錄組。對(duì)sgRNA和ORF的明確定位為病毒蛋白功能研究，復(fù)制機(jī)制以及致病性中宿主-病毒相互作用的提供前提。與RNA病毒一樣，冠狀病毒也經(jīng)常重組，這可能會(huì)使它們迅速進(jìn)化，從而改變其宿主/組織特異性和藥物敏感性，在這項(xiàng)研究中檢測(cè)到的頻繁融合可能為變異提供基礎(chǔ)。新的ORF可以作為輔助蛋白，調(diào)節(jié)病毒復(fù)制和宿主免疫反應(yīng)。RNA修飾也可能有助于感染組織中的病毒存活和免疫逃逸。ORF和RNA修飾是SARS-CoV-2特有的還是在其他冠狀病毒中保守的，有待檢查。對(duì)它們的分布和功能意義的比較研究將有助于我們更全面地了解SARS-CoV-2和冠狀病毒。
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