多倍體是指含有 3 套或 3 套以上完整染色體組的生物體，根據(jù)染色體來(lái)源的不同分為同源多倍體與異源多倍體，其形成途徑主要有：①二倍體親本經(jīng)過(guò)基因組加倍直接形成同源四倍體；②通過(guò)種間雜交形成單倍體雜種，然后經(jīng)過(guò)染色體加倍形成異源多倍體；③自然產(chǎn)生的雌雄非減數(shù)配子通過(guò)融合形成異源多倍體；④兩個(gè)同源四倍體親本通過(guò)雜交形成異源四倍體；⑤異源多倍體通過(guò)染色體間的重組形成節(jié)段異源多倍體。也有利用突變體產(chǎn)生多倍體的途徑[1]。多倍化能夠拓寬物種的遺傳變異并有利于新物種的形成。此外，多倍化有利于創(chuàng)建新型種質(zhì)資源，增加物種變異，改良作物
近10年來(lái), 隨著DNA測(cè)序等技術(shù)的進(jìn)步, 植物多倍化研究進(jìn)入了基因組學(xué)時(shí)代, 植物多倍化研究也轉(zhuǎn)移至基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)化及其對(duì)物種分化與表型性狀形成的作用機(jī)制領(lǐng)域[2]。
PART ONE
高質(zhì)量基因組獲得
異源多倍體
異源多倍體是指不同染色體組來(lái)自于已經(jīng)產(chǎn)生生殖隔離(reproductive isolation)的不同物種間的雜交并加倍。常見(jiàn)的異源多倍體有很多，比如普通小麥（AABBDD），二粒小麥（AABB），芥菜（AABB），油菜（AACC），陸地棉/海島棉（AADD），栽培花生(AABB)等。
正是因?yàn)槭加诓煌嫦龋沟卯愒炊啾扼w基因組的亞基因組通常能被“輕松”組裝出來(lái)。如圖1所示，組裝好的基因組是一個(gè)“混合體”，需要與祖先種/近似祖先種序列比對(duì)來(lái)拆分不同的亞基因組。(詳情可見(jiàn)→基因組技術(shù)分享|多倍體如何區(qū)分亞基因組？）
圖1 異源多倍體基因組組裝與區(qū)分亞基因組示意圖
（由百度圖片拼接整理，侵刪）
例如研究的較為成熟的花生，作者將組裝好的異源四倍體栽培花生（AABB）與兩種野生二倍體花生（A、B的可能祖先種）的組裝結(jié)果進(jìn)行全基因組比較，直接鑒定出相應(yīng)的亞基因組。成功地將96.07%以上的序列分為A.mon-A和A.mon-B亞基因組。
圖2 祖先種序列比對(duì)以及分亞基因組的Hi-C熱圖
同源多倍體
同源多倍體是指所有染色體組來(lái)源于一個(gè)個(gè)體的染色體組自我復(fù)制或同一個(gè)物種內(nèi)不同個(gè)體間的雜交與多倍化。通常二倍體基因組裝出單套基因組，異源四倍體能組裝出兩套基因組。而由于早期的技術(shù)限制，同源多倍體物種往往只能組裝1-2套（例如2017年甘薯基因組）。隨著技術(shù)的發(fā)展以及研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)僅單套的基因組數(shù)據(jù)難以完全演示該物種的全面信息。尤其是一些同源多倍體的物種，同源染色體之間不同遺傳位點(diǎn)的組合對(duì)生物表型有重要影響，如動(dòng)植物中的雜種優(yōu)勢(shì)、某些物種雜交不育現(xiàn)象等。單倍型等位基因間差異對(duì)基因表達(dá)、功能及其表型都有著重要影響，大多數(shù)雜交品種的優(yōu)勢(shì)表型都受等位基因調(diào)控。
圖3 當(dāng)前基因組模式與新興基因組模式
目前主要通過(guò)識(shí)別差異位點(diǎn)來(lái)區(qū)分這些基因組單倍型，在準(zhǔn)確度足夠的情況下，測(cè)序結(jié)果即可支持單堿基變異（SNV）的分析，其中雜合基因座表明了同源染色體對(duì)之間的序列差異。長(zhǎng)reads組裝算法可以準(zhǔn)確地糾正和解決不同的單倍型，使組裝體超過(guò)單倍體基因組的大小。但基因組的單倍型之間同源性非常高，僅存在少量雜合位點(diǎn)。常規(guī)三代測(cè)序由于其需要reads間相互糾錯(cuò)，會(huì)將這些差異位點(diǎn)整合與糾正，最終導(dǎo)致難以區(qū)分雜合率較低的單倍型。這也是傳統(tǒng)的低精度長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序的技術(shù)瓶頸，無(wú)法判斷差異是來(lái)自于變異，還是本身就是讀取時(shí)產(chǎn)生的錯(cuò)誤。
困難有多少那辦法也就有多少，通過(guò)不斷的技術(shù)改進(jìn)，已有幾種有效單倍型區(qū)分方式：
（1）通過(guò)對(duì)父本母本區(qū)分單倍型——Trio-binning[3]、graph-binning[4]
通過(guò)父母本二代測(cè)序數(shù)據(jù)獲得兩個(gè)親本特有的kmer，將三代reads區(qū)分為來(lái)自父本、母本以及部分無(wú)法區(qū)分的reads。而后將區(qū)分后的reads分別組裝，便獲得子代兩套單倍體序列。（詳情可見(jiàn)→基于hifi數(shù)據(jù)的組裝軟件–hifiasm介紹）
圖4 單倍型組裝材料構(gòu)建示意圖
（2）HiFi+Hi-C技術(shù)區(qū)分單倍型
大多研究是天然材料材料，這種就難以構(gòu)建如上遠(yuǎn)源雜交的親系。PacBio平臺(tái)的HiFi技術(shù)基于其高準(zhǔn)確率，無(wú)需reads間進(jìn)行糾錯(cuò)，從而可以更為有效區(qū)分同源對(duì)之間的差異，再結(jié)合現(xiàn)有的Hifiasm、HiCanu等具有更強(qiáng)的區(qū)分單倍型的組裝軟件，使得多倍體的多套組裝成為了可能。例如同源四倍體紫花苜蓿使用~22X CCS（HiFi）reads進(jìn)行基因組組裝后用ALLHiC進(jìn)行同源染色體聚類(lèi)，最終組裝出四套單倍型[5]。李恒等大牛發(fā)布Hi-C結(jié)合HiFi的 DipAsm算法也為二倍體物種染色體規(guī)模的分相組裝提供了可能[6]。
圖5 紫花苜蓿Hi-C互作熱圖評(píng)估
（每個(gè)等位基因?qū)?yīng)4條染色體)
（3）單細(xì)胞技術(shù)輔助分型Bar-coding[7]、Strand-seq[8]
Bar-coding：將花粉單細(xì)胞結(jié)合構(gòu)建的人工染色體（BAC，artificialchromosome）進(jìn)行單倍型分型。Strand-seq：短reads結(jié)合單細(xì)胞通過(guò)胸苷類(lèi)似物選擇性標(biāo)記去除一條DNA鏈，并可與長(zhǎng)reads測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)合使用來(lái)完成單倍型分型。
圖6 Bar-coding及Strand-seq方法概要
從以上幾種區(qū)分單倍型的方法我們不難發(fā)現(xiàn)，這三種方法均能有效的解決二倍體物種的單倍型區(qū)分，但針對(duì)同源多倍體材料來(lái)說(shuō)，目前方法（2）是最合適也是操作相對(duì)簡(jiǎn)單的方式。當(dāng)然也并不是所有同源多倍體材料都能直接組裝出完整的單倍型，與物種本身的特性也有相當(dāng)大的關(guān)系，這里篇幅有限，小編就不再贅述了。
PART TWO
多倍體基因組深入挖掘
基因組的差異——變異分析
隨著單倍型的解析，不少研究發(fā)現(xiàn)在同源染色體間有大量的變異信息，而這些突變累積很可能引起等位基因的有害/有益替代。從而可以對(duì)亞基因組（同源染色體）間基因含量、GC含量、基因結(jié)構(gòu)、重復(fù)元件分布等比較、亞基因組間結(jié)構(gòu)變異（倒置、易位），結(jié)合TE分布等進(jìn)行亞基因組（同源染色體）間差異分析。
例如在高雜合二倍體馬鈴薯中，作者發(fā)現(xiàn)馬鈴薯的兩套單倍體間存在著大量的SNP、InDel、SV、PAV，甚至有超過(guò)106個(gè)長(zhǎng)度大于100kb的SV。展示了基因組內(nèi)單體型間存在2.1%的序列多樣性，并檢測(cè)到有害等位基因的緊密連鎖[9]。
圖7 馬鈴薯中同源染色體間SNP差異與共線性展示
不對(duì)稱(chēng)演化
大多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)在多倍體植物中，其中一個(gè)亞基因組傾向擁有更多蛋白編碼基因、保留較高的基因表達(dá)水平、維持較低的甲基化水平、經(jīng)歷較強(qiáng)的純化選擇（負(fù)選擇）。這種現(xiàn)象稱(chēng)為亞基因組優(yōu)勢(shì)（subgenome dominance），例如異源四倍體芥菜、異源四倍體金魚(yú)等研究中都有報(bào)道。而二倍體馬鈴薯的案例給我們成功展示了單倍型間，同樣也有不對(duì)稱(chēng)的演化現(xiàn)象，該現(xiàn)象可能也同樣存在于同源多倍體物種中。
圖8 馬鈴薯基因組的單倍型差異（有害變異、甲基化水平、基因數(shù)等）
（1）不對(duì)稱(chēng)演化——選擇壓力
多倍體物種中，兩個(gè)亞基因組（同源基因組）所受到的選擇壓力往往不同：某亞（同源）基因組經(jīng)歷更強(qiáng)的純化選擇，另一個(gè)則經(jīng)歷較寬松的選擇，同源多倍體中可能同樣有這種現(xiàn)象。
圖9 金魚(yú)A、B亞基因組Ka/Ks
（Xu P et al., Nature communications.2019）
（2）不對(duì)稱(chēng)演化——表達(dá)差異
優(yōu)勢(shì)亞基因組受到較高的純化選擇，往往會(huì)使其維持較高的基因表達(dá)水平，這些可能與物種的生理生態(tài)等特性相關(guān)。且在芥菜、金魚(yú)，異源八倍體草莓，雜合二倍體馬鈴薯等眾多物種中都發(fā)現(xiàn)明顯的表達(dá)差異。
圖10 亞基因組、單體型間基因表達(dá)差異研究
（Xu P et al., Nature communications.2019；P.E P et al., Nature genetics.2019；Zhou Q et al., Nature Genetics.2020）
起源與進(jìn)化
（1）起源與進(jìn)化——祖先來(lái)源
對(duì)于多倍體物種，其二倍體祖先種的探尋，一直是廣大科研工作者重要的研究方向。近緣種初步找尋：①?gòu)V泛收集已有的二倍體近緣物種，通過(guò)重測(cè)序/轉(zhuǎn)錄組加遺傳分析找到哪種是可能的祖先，基于SNP進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建來(lái)初步判斷哪個(gè)種是更有可能的祖先材料（結(jié)果不一定理想）；②構(gòu)建線粒體和核基因序列的進(jìn)化樹(shù)等。深入研究，后續(xù)則還需要再將該疑似祖先種的材料進(jìn)一步做denovo，并結(jié)合相關(guān)的細(xì)胞生物學(xué)及進(jìn)化等分析來(lái)進(jìn)一步深入的研究祖先。
（2）起源與進(jìn)化——演化歷程
除了祖先來(lái)源的探索，物種的進(jìn)化與傳播歷程也是每一個(gè)種質(zhì)資源研究者的重點(diǎn)關(guān)注對(duì)象。
圖11 油菜傳播歷程及草莓形成歷程
（Wu D et al., Molecular Plant.2018;P.E P et al., Nature genetics.2019)
三維基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控
（1）同源/亞基因組間
早期研究先前的研究廣泛地研究了平均染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，一直忽視了同源染色體間的表觀調(diào)控差異。近期研究表明，同源染色體間的三維結(jié)構(gòu)同樣具有差異。例如靳文菲課題組通過(guò)多組學(xué)技術(shù)研究雜交小鼠揭示同源染色體間的相互作用模式、三維結(jié)構(gòu)、染色質(zhì)動(dòng)態(tài)、組蛋白修飾及其對(duì)基因表達(dá)的影響。
圖12 小鼠子代單倍型間以及與雙親本間TAD邊界比較
（Han Z et al., Genome Research.2020)
（2）祖先二倍體與多倍化
與祖先材料做研究比較更是多倍體中亙古不變的話題。物種在由祖先進(jìn)化、加倍而成現(xiàn)代多倍體材料的過(guò)程中，三維結(jié)構(gòu)發(fā)生如何的變化，是否引起相關(guān)功能的差異？例如相比于二倍體亞洲棉陸地棉和海島棉的A/B compartment比較分析，發(fā)現(xiàn)存在大量A到B的轉(zhuǎn)換，以及一定區(qū)域出現(xiàn)了B到A的轉(zhuǎn)換。同時(shí)相對(duì)于祖先基因組，亞基因組發(fā)生了不同程度的Compartment的轉(zhuǎn)換，At亞基因組轉(zhuǎn)換明顯高于Dt。
圖13 棉花中A/B Compartment分布
（Wang M et al., Nature Plants. 2018）
小結(jié)
多倍體研究嚴(yán)重依賴(lài)于一個(gè)優(yōu)質(zhì)的基因組，單倍體基因組技術(shù)的出現(xiàn)使得自交不親和的二倍體、同源多倍體的組裝成為了可能，基因組的完整信息將一點(diǎn)點(diǎn)的被揭露。通過(guò)祖先的推演使得我們更充分的了解到現(xiàn)代多倍體物種的進(jìn)化歷程，也將更利于優(yōu)良品種的改良與育種。除了上述幾種方式之外其實(shí)還有很多研究方向，例如LTR類(lèi)轉(zhuǎn)座子爆發(fā)豐度和時(shí)間分析、加倍事件、分化時(shí)間、基因編輯還有近年研究火爆的泛基因組分析，都能從不同的層面進(jìn)行解析。
參考文獻(xiàn)
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