?近年來，單細胞組學領域發(fā)展非常迅速，廣泛應用于人類和動物的研究中，為人們研究細胞異質性以及微生物群落的生態(tài)多樣性提供了新的視角。在植物中，由于細胞壁的存在，大大阻礙了單細胞RNA測序（scRNA-seq）的應用，雖然原生質體已用于scRNA-seq分析，但僅僅限于適合消化細胞壁的組織。許多細胞類型在原生質體制備過程中可能出現基因異位表達或細胞類型偏好等問題。隨著scRNA-seq技術的發(fā)展，單細胞核RNA測序（snRNA-seq）讓植物單細胞測序不再受制于制備原生質體，能夠更好的解決傳統(tǒng)研究中存在的細胞異質性的問題，為研究者們提供更多選擇。
本文介紹的是利用snRNA-seq技術，解密番茄莖尖的發(fā)育軌跡，在這里，本文展示了一種用于高通量單核RNA測序（snRNA-Seq）的方法，該方法可用于分析番茄莖尖細胞。
獲得的高分辨率表達圖鑒定了主要的莖尖組織和發(fā)育階段的不同細胞類型，描繪了葉肉細胞，脈管系統(tǒng)細胞，表皮細胞和毛狀體細胞的發(fā)育軌跡。這項研究證明了snRNA-seq在植物研究中的作用，并為異質莖尖細胞提供了時空基因表達圖譜。該文章已發(fā)表在預印本雜志BioRxiov上。
文章題目：Single-nucleus RNA-seq resolves spatiotemporal developmental trajectories in the tomato shoot apex
細胞核提取方法
材料預處理：在解剖顯微鏡下對番茄莖尖進行解剖，保留了2周齡植株的莖尖分生組織區(qū)和早期葉原基，葉原基到P3(第三片葉的葉原基）。
細胞核提取方法：將冷凍番茄莖尖分生組織重懸于10ml含0.1%蛋白酶抑制劑的核分離液（NIB：10 mM MES-KOH（pH = 5.4），10 mM NaCl，10 mM KCl，2.5 mM EDTA，250 mM蔗糖，0.1 mM精胺，0.5 mM亞精胺，1 mM DTT）中，在冰上使用勻漿器低速勻漿，冰上裂解30分鐘后，將勻漿物在三層尼龍網中過濾兩次。同時為了消除葉綠體，將10％Triton X-100滴加到溶液中，使其最終濃度為0.1％（v / v），直到大多數葉綠體降解為止。然后將核懸浮液以1000 g離心5分鐘。將沉淀的核洗滌兩次，然后將其懸浮在NIB中。通過臺盼藍染色確定細胞核的質量和濃度，并在顯微鏡下計數。
結果
1.原生質體引起異位基因表達
莖尖分生組織和早期葉片原基具有復雜的細胞結構，該結構由嵌入不同組成的細胞壁中的異質細胞組成。制備原生質體，需要長時間的酶消化。異位激活和隨機基因的表達與原生質體形成相關。為了評估原生質體對基因表達的影響，本文檢測擬南芥葉片和葉肉原生質體中的基因表達，并觀察到頻繁的異位激活。例如，WOX2未在葉子中表達（圖1a）。追蹤了10,000多個原生質體，觀察到超過21％的原生質體表達了WOX2（圖1b）。該觀察結果強烈暗示通過原生質體化存在基因表達的異位隨機激活。
圖1葉片和原生質體中WOX2的表達模式
2.snRNA-seq鑒定了番茄莖尖的主要細胞類型
根據本文細胞核提取的方法，得到正常形態(tài)的番茄莖尖分生組織的細胞核，進行snRNA-seq。（圖2a）。經過質量控制和過濾，獲得了13377個核，檢測到基因數為21402。為了評估snRNA-seq數據的可重復性和敏感性，本文用番茄莖尖進行Bulk RNA-seq。snRNA-seq檢測到的基因，有92.3%可以通過Bulk RNA-seq檢測到（FPKM > 1），表明snRNA-seq具有較高的敏感性，snRNA-seq和Bulk RNA-seq的相關性達到0.9（圖2b），表明具有很高的重現性。
圖2 snRNA-seq繪制番茄莖尖細胞圖譜
為了鑒定不同的細胞類型，本文采用無監(jiān)督聚類分析。采用t-SNE算法，將細胞核分組為16個clusters(圖2c)。每個cluster具有顯著差異的基因表達模式。鑒定了每個cluster的一系列特異性標記基因(圖3a)。為了注釋這些clusters，本文將cluster的marker基因與已知的marker基因進行了關聯(lián)。此外，本文還與擬南芥富集于相應細胞結構域的同源基因相關聯(lián)。本文發(fā)現在幾個clusters中，顯著富集到擬南芥細胞域特異性的同源基因，這些結構域包括表皮，葉肉和脈管系統(tǒng)域（圖4）。此外，在擬南芥分生組織中廣泛表達的marker基因SlSTM和SlBP在clusters 0、3、4、5、6、7中特異性表達，由此得出，本文的樣本中有相當一部分與莖尖分生組織相對應?；谝陨闲畔?，將clusters分為4個cluster clouds，分別對應于番茄的表皮和毛狀體（clusters 2、7、9、10和16），葉肉（clusters 1、12和14），脈管系統(tǒng)（clusters 4、11和15）和分生組織細胞（clusters 0、3、5、6、8和13）（圖2c，d）。
總之，本文鑒定了莖尖的主要的細胞類型，提供了莖尖細胞空間分布的基因表達信息（圖3b,d）.
圖3 marker 基因的表達模式和細胞空間分布
圖4 細胞類型特異性基因的富集分析
3.番茄莖尖細胞軌跡分析
單細胞轉錄組學可以捕獲具有過渡狀態(tài)的細胞，從而使本文能夠追蹤特定細胞類型的發(fā)育軌跡。為了獲得莖尖細胞發(fā)育軌跡圖，本文用uMAP算法分析clusters聚類和等級結構（圖3c），鑒定出相似的clusters，對應分生組織細胞的clusters位于中心。起源于分生組織細胞的莖尖細胞連續(xù)分化形成表皮細胞，毛狀體細胞，葉肉細胞和脈管系統(tǒng)細胞。
根據細胞軌跡分析，在莖尖分生組織的外圍區(qū)域處葉片開始萌發(fā)，葉肉細胞分化，伴有脈管系統(tǒng)的形成。細胞發(fā)育軌跡起始于分生組織細胞（cluster 3），葉肉細胞（clusters 1和12）與脈管系統(tǒng)細胞（clusters 4,11和15）明顯分離，隨后，脈管系統(tǒng)細胞分離為木質部細胞和韌皮部細胞（圖5a，b）
圖5 葉肉細胞和脈管系統(tǒng)的發(fā)育軌跡
結論
細胞壁的存在極大阻礙了單細胞轉錄組學在植物研究中的應用。在這項研究中，本文開發(fā)了一種處理組織的方法，可對幾乎任何植物細胞類型進行snRNA-seq分析。此外，snRNA-seq有望減輕與原生質體形成相關的異位基因表達變化。本文用snRNA-seq已獲得番茄莖的高分辨率細胞表達圖譜，可識別大多數已知的細胞類型，并在細胞和分子水平上表現出顯著的異質性。綜上所述，本文提供了一個強大的單核轉錄組分析流程，可以廣泛應用于其他物種和組織，并為研究干細胞穩(wěn)態(tài)和早期器官發(fā)生提供了寶貴的資源。
京公網安備 11011302003368號