文獻(xiàn)名稱：Key role for CTCF in establishing chromatin structure in human embryos
期刊：Nature
導(dǎo)讀
在細(xì)胞周期的中間階段，染色質(zhì)以分級(jí)結(jié)構(gòu)排列在核中，這在調(diào)節(jié)基因表達(dá)方面具有重要作用。但是，人類胚胎發(fā)生過(guò)程中3D染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的動(dòng)力學(xué)仍然未知。在這里作者報(bào)告，與小鼠精子不同，人類精子細(xì)胞不表達(dá)染色質(zhì)調(diào)節(jié)劑CTCF，其染色質(zhì)不包含拓?fù)潢P(guān)聯(lián)域（TADs）。人類受精后，TAD結(jié)構(gòu)在胚胎發(fā)育過(guò)程中逐漸建立。此外，A / B區(qū)室化在人類胚胎2細(xì)胞階段中消失，并在后續(xù)胚胎發(fā)育過(guò)程中重新建立。值得注意的是，阻斷合子基因組激活（ZGA）可以抑制人類胚胎中TAD的建立，而不能抑制小鼠或果蠅中的TAD。值得注意的是，CTCF在ZGA之前以非常低的水平表達(dá)，然后在觀察到TAD時(shí)在ZGA階段高表達(dá)。CTCF基因被敲除后，胚胎中TAD結(jié)構(gòu)顯著減少，這表明合子基因組激活（ZGA）階段，人類胚胎中的TAD建立需要CTCF表達(dá)。結(jié)果表明，CTCF在人類胚胎發(fā)生過(guò)程中的3D染色質(zhì)結(jié)構(gòu)建立中具有關(guān)鍵作用。
實(shí)驗(yàn)方法
材料：小鼠精子和桑椹胚
方法：Hi-C, 免疫染色，DNA甲基化測(cè)序，ATAC-seq, RNA-seq，Smart-seq2
研究?jī)?nèi)容
1、人類早期胚胎的TAD結(jié)構(gòu)
作者檢測(cè)了人類精子和胚胎中的染色質(zhì)相互作用。但是沒(méi)有檢測(cè)到人類2細(xì)胞胚胎中TAD結(jié)構(gòu)的特征性“三角”相互作用。在8細(xì)胞胚胎中這些相互作用的水平很低，并且在人類胚胎發(fā)育過(guò)程中相互水平逐漸升高（圖1a）。為了排除read深度對(duì)分析的影響，在繪制每個(gè)階段的相互作用熱圖時(shí)，作者隨機(jī)選擇了相同數(shù)量的read。 作者進(jìn)一步調(diào)查了人類胚胎發(fā)育過(guò)程中的TAD重編程。使用TAD分離分?jǐn)?shù)方法（Methods）來(lái)獲得TAD結(jié)構(gòu)和TAD邊界。即使read深度很低，也可以檢測(cè)到大多數(shù)TAD域。作者還計(jì)算了TAD信號(hào)和方向指數(shù)。本文的數(shù)據(jù)表明，TAD信號(hào)方差和方向指數(shù)在2細(xì)胞階段最低，并隨著發(fā)育而逐漸增加（圖1b）。為了排除人胚TAD分析中可能的實(shí)驗(yàn)偏差，本文使用了小鼠morula胚胎作為對(duì)照，將其與人2細(xì)胞，8細(xì)胞和morula胚胎混合。然后，為這些混合樣品構(gòu)建了Hi-C庫(kù)。同時(shí)，還為未與人類樣品混合的小鼠桑morula胚胎生成了Hi-C庫(kù)。這些結(jié)果表明，混合樣品中的TAD結(jié)構(gòu)在人類2細(xì)胞胚胎中仍然模糊不清，在8細(xì)胞胚胎和桑胚胎中變得更清晰，而所有摻入的小鼠morula胚胎均清晰可見(jiàn)TAD結(jié)構(gòu)。來(lái)自混合樣品的TAD信號(hào)分析支持了作者的發(fā)現(xiàn)，即TAD結(jié)構(gòu)在人類胚胎發(fā)生過(guò)程中得以確立。
總之，這些數(shù)據(jù)表明，TAD結(jié)構(gòu)在人的2細(xì)胞胚胎中基本上不存在，在8細(xì)胞胚胎中很少存在，并且在胚胎發(fā)育過(guò)程中變得越來(lái)越明顯。
圖a 人類精子，人類胚胎和H1人類ES細(xì)胞（hESCs）中高階染色質(zhì)結(jié)構(gòu)相互作用熱圖，分辨率為40 kb（合并的生物學(xué)重復(fù)；n = 2-3）。
圖b 用相等數(shù)量的reads（每個(gè)階段從2-3個(gè)生物學(xué)復(fù)制中產(chǎn)生）計(jì)算出的人類胚胎中TAD信號(hào)的相對(duì)方差。每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)染色體。顯示P值；雙面Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)為平均值±s.e.m。
圖c 人類胚胎中500kb分辨率的5號(hào)染色體的PC1值軌跡和Pearson相關(guān)熱圖，具有相同的read次數(shù)（每個(gè)階段2-3次生物復(fù)制）。
圖d 具有相同reads的人胚胎中的compartment強(qiáng)度。數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，通過(guò)自舉獲得（n = 100）。通過(guò)單側(cè)t檢驗(yàn)計(jì)算P值。
圖1. 人類精子和胚胎的三維染色質(zhì)結(jié)構(gòu)
2、人類精子不包含傳統(tǒng)的TAD結(jié)構(gòu)
先前的研究表明，TAD結(jié)構(gòu)存在于成熟的小鼠精子中。令人驚訝的是，本文沒(méi)有在人類精子中觀察到典型的三角TAD結(jié)構(gòu)（圖1a）。例如，人類精子的HOXA簇區(qū)域沒(méi)有TAD邊界，但存在于人類胚泡（圖2a）和小鼠精子中。為了驗(yàn)證該觀察結(jié)果，繪制了人類精子和胚泡在不同讀取深度下的TAD信號(hào)方差。與小鼠精子和人類胚泡不同，人類精子系的y截距接近0（圖2b），表明人類精子中不存在TAD。本文進(jìn)一步比較了人類精子和小鼠精子之間相互作用插入物大小的密度，結(jié)果表明，人類精子在4 Mb（中程）附近出現(xiàn)一個(gè)主峰，而小鼠精子在933 kb附近出現(xiàn)肩峰，在41 Mb左右出現(xiàn)遠(yuǎn)距離主峰。此外，人的精子和小鼠的精子之間的接觸概率衰減曲線也有差異?？傊?，這些結(jié)果表明人類精子不含TAD。
為了排除潛在的實(shí)驗(yàn)偏見(jiàn)，本文將小鼠精子與人類精子混合，并為精子混合物構(gòu)建了一個(gè)Hi-C庫(kù)（方法）。平行地，本文混合了人類HeLa細(xì)胞和小鼠HT22細(xì)胞。與本文之前的結(jié)果一致，本研究在精子混合物中觀察到了來(lái)自小鼠精子而非人精子的TAD。相比之下，在人類HeLa細(xì)胞和小鼠HT22細(xì)胞中均觀察到TAD結(jié)構(gòu)。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了人類精子中沒(méi)有TAD。
CTCF-cohesin復(fù)合物在高級(jí)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)中具有重要作用。本研究調(diào)查了人類和小鼠精子中CTCF和粘著蛋白的水平。RAD21是黏附蛋白復(fù)合物的一個(gè)亞基，存在于人類和小鼠的精子中）;但是，在人類精子中未檢測(cè)到CTCF，并且在使用短干擾RNA（siRNA）耗盡CTCF的細(xì)胞系中表達(dá)很弱，但是在小鼠精子，人類和對(duì)照小鼠細(xì)胞系中檢測(cè)到了CTCF（圖2c）。由于CTCF的消耗會(huì)導(dǎo)致TAD結(jié)構(gòu)的破壞，因此CTCF的缺乏可能是人類精子中TAD結(jié)構(gòu)喪失的基礎(chǔ)。
圖a 人類精子和胚泡中HOXA簇周圍的相互作用熱圖，分辨率為10 kb（生物學(xué)重復(fù); n = 3）。
圖b 人精子和胚泡中TAD信號(hào)方差與read深度（1 /讀取次數(shù)）的線性回歸曲線。在y軸上標(biāo)記了人類胚泡和精子的回歸線的線性外推。在每個(gè)讀取深度進(jìn)行降采樣分析3次（n = 3）。
圖c 用Ponceau染色的小鼠精子，人精子和體細(xì)胞系中CTCF的Western印跡。黑色箭頭表示CTCF波段。每個(gè)樣品在兩個(gè)生物學(xué)獨(dú)立的重復(fù)樣本上重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
圖2. 人類精子不包含傳統(tǒng)的TAD結(jié)構(gòu)
3、TAD邊界的建立
TAD結(jié)構(gòu)在人類2細(xì)胞胚胎中并不明顯。但是，兩細(xì)胞胚胎中的某些區(qū)域顯示出絕緣子結(jié)合的跡象，可以分隔上游和下游相互作用。在胚胎后期，這些區(qū)域大部分成為T(mén)AD邊界（圖3a）; 這些區(qū)域因此可以被視為未成熟的TAD邊界。在這項(xiàng)研究中，本研究將未成熟的TAD邊界和成熟的TAD邊界都定義為絕緣邊界。然后，本研究分析了人類胚胎發(fā)育過(guò)程中絕緣邊界的動(dòng)力學(xué)。本研究的數(shù)據(jù)表明，分別在2細(xì)胞，8細(xì)胞，morula 和胚泡階段分別形成635、905、317和306個(gè)絕緣邊界（圖3a）。本研究還在小鼠2細(xì)胞胚胎中發(fā)現(xiàn)了未成熟的TAD邊界，并確定了小鼠階段獲得的絕緣邊界。比較了人類樣品中2細(xì)胞階段的絕緣邊界與胚泡階段的總邊界，結(jié)果表明2細(xì)胞邊界與胚泡邊界的30％重疊（圖3b）。本研究的數(shù)據(jù)還顯示ZGA階段包含胚泡中67％的邊界，這與小鼠模型中的比例相似（圖3b）。此外，當(dāng)將ZGA階段的人類邊界與小鼠的邊界進(jìn)行比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)存在明顯的重疊（圖3c）。例如，本研究在人和小鼠的ZGA階段發(fā)現(xiàn)了TTC1和CCNG1基因周圍的絕緣邊界。
接下來(lái)，作者試圖確定在早期階段優(yōu)先形成絕緣邊界的基因組區(qū)域。在2細(xì)胞階段首先獲得邊界的基因組區(qū)域與持家基因的距離小于在后期階段獲得邊界的邊界區(qū)域的距離（圖3d）。在小鼠胚胎中觀察到了類似的結(jié)果。這些數(shù)據(jù)表明，在較早階段獲得的絕緣邊界往往位于人和小鼠的看家基因周圍。作者還發(fā)現(xiàn)邊界附近的管家基因的表達(dá)水平傾向于高于其他管家基因的表達(dá)水平。
據(jù)報(bào)道，重復(fù)元素與細(xì)胞系中的TAD邊界相關(guān)。因此，作者分析了胚胎中特定于階段獲得的邊界周圍重復(fù)元件的富集。作者的數(shù)據(jù)表明，在人類早期階段，Alu重復(fù)序列（而不是LINE或MIR重復(fù)序列）（圖3e）富集在絕緣邊界周圍。在小鼠胚胎中觀察到了相似的結(jié)果。例如，在人類或小鼠RAB5A基因周圍的2細(xì)胞階段獲得的絕緣邊界被建立在Alu密集區(qū)。此外，作者的數(shù)據(jù)表明AluS元素在2細(xì)胞階段獲得的絕緣邊界周圍高度富集（圖3e）。此外，與其他階段相比，在2細(xì)胞階段獲得的絕緣邊界周圍的AluS重復(fù)序列在裂解階段得到了高度表達(dá)?？傮w而言，這些結(jié)果表明，人類胚胎中絕緣的邊界傾向定位在Alu密集區(qū)周圍。
圖a 絕緣得分的熱圖，以在特定階段（±1 Mb范圍）獲得的絕緣邊界為中心。n，特定階段獲得的絕緣邊界的數(shù)量；b，絕緣邊界中心。
圖b 相對(duì)于胚泡邊界數(shù)，每個(gè)階段中絕緣邊界數(shù)的累積百分比。
圖c 維恩圖，顯示人ZGA邊界和小鼠ZGA邊界之間的重疊（χ2檢驗(yàn)）。
圖d 累積分布函數(shù)圖，用于特定階段獲得的邊界與人類胚胎中最接近的管家基因的距離（來(lái)自2-3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的合并數(shù)據(jù)）。虛線表示200 kb的距離。P = 3.24×10?8（2單元vs 8單元階段）; P = 9.95×10-8（2細(xì)胞期與桑ula鼠比較）; P = 3.83×10-11（2細(xì)胞期vs胚泡）;雙面Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)。
圖e 在人類胚胎的特定階段獲得的絕緣邊界處AluS元素的富集。
圖3. 在人類胚胎發(fā)育過(guò)程中建立絕緣邊界
4、TAD的建立依賴于ZGA以及CTCF調(diào)控染色體
先前的報(bào)道表明，TAD的建立獨(dú)立于小鼠和果蠅胚胎中的ZGA。作者調(diào)查了這些特征在人類中是否保守。作者用α-amanitin處理人合子以抑制ZGA，并在8細(xì)胞階段收集了胚胎。令人驚訝的是，在經(jīng)過(guò)α-amanitin處理的8細(xì)胞胚胎中，TAD的結(jié)構(gòu)模糊不清（圖4a）。用α-amanitin處理的胚胎中TAD信號(hào)的相對(duì)方差也顯著低于未處理的8細(xì)胞胚胎（圖4b）。因此，在人類胚胎中建立TAD需要ZGA。
接下來(lái)，作者旨在鑒定ZGA期間參與TAD建立的蛋白質(zhì)。粘著蛋白復(fù)合物和CTCF在高階染色體結(jié)構(gòu)中具有重要作用。因此，作者研究了這些蛋白質(zhì)表達(dá)的差異。粘附蛋白復(fù)合物的亞基，例如RAD21，已經(jīng)在ZGA之前在人類胚胎中高度表達(dá)。相比之下，當(dāng)在人類胚胎中首次觀察到TAD結(jié)構(gòu)時(shí)，CTCF的表達(dá)在ZGA階段之前非常有限，并且在8細(xì)胞階段急劇增加（圖4c）。在經(jīng)α-amanitin處理的8細(xì)胞胚胎中，CTCF表達(dá)受到抑制。一致地，免疫染色圖像顯示在2細(xì)胞核中幾乎未觀察到CTCF蛋白（圖4d）。CTCF明顯存在于未經(jīng)處理的8細(xì)胞核中，但在經(jīng)α-amanitin處理的8細(xì)胞核中卻不存在（圖4d）。這些結(jié)果表明CTCF表達(dá)需要人ZGA。
接下來(lái)，作者研究了在人類胚胎中建立TAD對(duì)CTCF的需求。作者通過(guò)將CTCF siRNA（siCTCF）注入人受精卵來(lái)抑制CTCF的表達(dá)，并在morula期收集胚胎（圖4d）。值得注意的是，在siCTCF morula中幾乎沒(méi)有觀察到三角形TAD結(jié)構(gòu)（圖4e）。相對(duì)的TAD信號(hào)方差支持抑制siCTCF morula中TAD的建立。一致地，大多數(shù)TAD邊界在對(duì)照morula中消失，而在siCTCF morula中變?nèi)?。因此，本研究的?shù)據(jù)表明ZGA期間CTCF表達(dá)是人類胚胎中TAD建立所必需的。
圖a 人8細(xì)胞和經(jīng)α-amanitin處理的8細(xì)胞胚胎中的相互作用熱圖。
圖b 人2細(xì)胞（n = 3），8細(xì)胞（n = 3）和經(jīng)α-amanitin處理的8細(xì)胞胚胎（n = 3）中TAD信號(hào)相對(duì)方差的箱形圖。方框顯示第25、50和75個(gè)百分位，胡須顯示1.5倍的四分位間距。***對(duì)于8細(xì)胞和α-amanitin處理過(guò)的8細(xì)胞之間的所有成對(duì)比較，校正后的P <0.001（帶有Benjamini-Hochberg多重檢驗(yàn)校正的雙面Wilcoxon秩和檢驗(yàn)）。
圖c 人類胚胎發(fā)育過(guò)程中CTCF表達(dá)的動(dòng)態(tài)（來(lái)自參考文獻(xiàn)22的表達(dá)數(shù)據(jù)；每個(gè)階段3至20個(gè)細(xì)胞）。數(shù)據(jù)為平均值±s.e.m。RPKM，每百萬(wàn)個(gè)映射讀操作的每千個(gè)轉(zhuǎn)錄本的讀操作數(shù)。
圖d CTCF在人類胚胎中的免疫熒光（n = 2-3）。比例尺40μm。
圖e 跟蹤未處理的對(duì)照morula和siCTCF morula中的TAD結(jié)構(gòu)，其中覆蓋了基因表達(dá)。
圖4. CTCF調(diào)控人類胚胎中染色質(zhì)的建立
總結(jié)
盡管人類和小鼠胚胎都顯示出高階染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的全基因組重編程，但人類和小鼠胚胎之間的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)存在很大差異。本研究的數(shù)據(jù)為哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育過(guò)程中染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的建立提供了寶貴的資源和機(jī)制的見(jiàn)解。
文獻(xiàn)下載：
https://international.biocloud.net/zh/article/detail/31801998
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