研究背景
肝臟由超過20種細胞類型組成，包括肝細胞、肝內皮細胞、膽管細胞、間皮細胞、ER細胞和各種循環(huán)免疫細胞。在人類胎兒的發(fā)育過程中，肝臟是重要的造血器官。造血干細胞和祖細胞（HSPC）在大約6周時在人體內遷移到肝芽中。然后，胎兒肝臟成為主要的造血器官，并為HSPC增殖和分化提供了特定的生態(tài)位。肝臟是人體的重要器官之一，易受體內外多種致病因素的影響，引起炎癥和損傷。肝臟疾病是導致發(fā)病率和死亡率的主要因素。此外，肝臟有很強的再生能力。肝部分切除術后，肝臟的再生依賴于殘余肝組織的再生能力。因此，對胎兒肝臟發(fā)育的研究對于我們了解肝臟發(fā)育和再生機制也至關重要。
結論
本文中作者結合了單細胞RNA測序和空間轉錄組學（ST）技術的優(yōu)點，對人類從受孕后8周（PCW）到17周（PCW）的胎兒肝臟進行了分析。系統(tǒng)地鑒定了9種細胞類型，并確定了主要細胞類型的發(fā)育途徑。結果表明，人胎肝在實驗期間經(jīng)歷了血液的快速生長和遷移，并鑒定了紅系細胞發(fā)育過程中的差異表達基因和代謝變化。此外，作者還對肝病相關基因的表達進行了研究，發(fā)現(xiàn)17個已發(fā)表并與肝病相關的基因主要在巨核細胞和內皮細胞中表達，在其他細胞類型中幾乎不表達。總之，作者的研究結果提供了一個全面而清晰的了解人類胚胎肝臟中所有主要細胞類型的分化過程，這可能為肝臟疾病的治療和肝臟再生提供參考數(shù)據(jù)和信息。
中文題目：整合空間轉錄組學和單細胞轉錄組揭示了人類胚胎肝臟的基因表達譜
英文題目：Integrating Spatial Transcriptomics and Single-Cell RNA-seq Reveals the Gene Expression Profling of the Human Embryonic Liver.
期刊：Front Cell Dev Biol
發(fā)表時間：2021.5
作者：Xianliang Hou
材料與方法
材料：受孕后8周和17周人類發(fā)育中的肝組織；
方法：10× Genomics Visium Spatial Gene Expression Slides。
實驗結果
一、細胞聚類與類型鑒定
為了研究胎兒肝臟中免疫細胞和紅細胞的發(fā)育，作者利用ST技術分析了人類肝臟發(fā)育過程中基因表達的時空動態(tài)。在篩選數(shù)據(jù)后，在8周PCW肝臟中檢測到1267個高質量spots，平均每個spot包含204,628條reads，檢測到1,132個基因和5,924個UMIs。在17周PCW中，肝臟由3,489個單獨spots組成，平均78,576條reads，8,829個UMI，過濾后每個點檢測到2,266個基因。通過對每個ST陣列的spots進行降維和聚類，根據(jù)基因表達模式在8周PCW肝臟（圖1A）和17周PCW肝臟（圖1B）中確定了6個和10個主要cluster。由于ST缺乏細胞分辨率，作者利用scRNA-seq技術研究了8周PCW和17周PCW活組織的基因表達異質性。在應用質量控制過濾器和標準化后，scRNA序列數(shù)據(jù)分別25,186個細胞和9,153個細胞組成，每個細胞中有2,454和2,705個獨特表達的基因。為了探索活體器官的細胞組成，作者處理了單細胞數(shù)據(jù)，并在8和17周PCW肝臟中鑒定了31和25種細胞狀態(tài)，每種狀態(tài)都根據(jù)文獻中已知的標記基因進行了注釋（圖1C-F）。作者將這些cluster鑒定為B細胞、樹突狀細胞（DC）、DC1、DC2、早期成紅細胞、內皮細胞、HSC_MPP、成纖維細胞、肝細胞、kuper、ILC、晚期成紅細胞、MEMP、肥大細胞、巨核細胞、中成紅細胞、單核細胞、中性粒細胞、NK、pDC、Pre、Pre-B、Pro-B和VCAM1+。
圖1
二、Multimodal交互式分析
為了整合scRNA-seq和ST數(shù)據(jù)集，作者應用了先前報道的Multimodal Intersection Analysis(MIA)進行分析。通過MIA方法發(fā)現(xiàn)在跨空間區(qū)域識別細胞類型的消耗和富集方面是穩(wěn)健的（圖2A，B）。例如，作者發(fā)現(xiàn)肝細胞、kuper細胞、內皮細胞和巨核細胞的高表達基因在ST和scRNA序列數(shù)據(jù)之間顯著重疊（圖2C）。8周 PCW肝臟由kuper、中成紅細胞、肝細胞、晚期成紅細胞、早期成紅細胞組成（圖2D）。17 周PCW肝臟由肝細胞、中性粒細胞、早期成紅細胞、中期成紅細胞、晚期成紅細胞、巨核細胞、內皮細胞和巨核細胞組成（圖2E）。基于平均對數(shù)變化，每個cluster的前10個基因的熱圖顯示了cluster之間的高度異質性（圖3A，B）。此外，作者在每種細胞類型中選擇一個最明顯的特征基因，并以點圖的形式呈現(xiàn)以比較差異（圖3C）。根據(jù)轉錄相似性，用單核細胞按預測的發(fā)育軌跡（擬時序）組織細胞。它產(chǎn)生了一個緊密相連的分化軌跡，分為兩個主要分支，分別對應于不同時期的8和17 PCW（圖3D）
圖2
圖3
三、人胎肝細胞的空間分辨異質性
如圖3E所示，肝細胞是17 PCW肝臟的主要實質細胞。作者觀察到三個不同的肝細胞cluster（cluster1、3和4）沿著17周PCW肝臟的空間深度分布（圖4A、B）。作者發(fā)現(xiàn)MEG3、ITIH3和HMGCS1呈cluster1高表達。FGB、IGFBP1和A2M基因在cluster3中表達更高，表明區(qū)域DEGs可能參與了相應區(qū)域特異性功能的形成。此外，cluster4組中的肝細胞高表達數(shù)個基因，包括MT-CO1、MT-CO2、MT-CO3，它們參與線粒體電子傳遞和氧化磷酸化。值得注意的是，cluster1和3主要聚集在肝組織的中心區(qū)域，cluster4主要聚集在肝的周圍區(qū)域（圖4a）。差異表達分析的熱圖顯示肝細胞分化過程中逐漸下調或上調的基因。GO分析表明，1-3-4cluster中逐漸上調的基因主要與細胞極性通路、Wnt信號通路和GTPase活性的調節(jié)有關，而逐漸下調的基因則參與壞死細胞死亡、糖原生物合成過程的調節(jié)，肝臟再生。此外，作者描述了cluster1-3-4細胞之間的細胞通訊（圖4C），為將來的研究提供了潛在的信號轉導信息。值得注意的是，盡管cluster3和cluster1的距離更近，但cluster3與cluster4細胞的信號轉導比cluster1細胞更為顯著。此外，作者還發(fā)現(xiàn)了一些共享的和活躍的配體-受體對，如DLK1-NOTCH2、EFNA1EPHA2、AGT-AGTR1，這些配體-受體對既存在于cluster1細胞與cluster4細胞的細胞通訊中，也存在于cluster3細胞與cluster4細胞的細胞通訊中。
在17周PCW肝臟的scRNA序列數(shù)據(jù)中，肝細胞可進一步細分為三個cluster。熱圖顯示了每個cluster的前十個標記基因（圖4D）。作者檢測了LGR5的表達模式，并根據(jù)scRNA-seq數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)了一部分LGR5+肝母細胞（圖4E）。在8 周PCW肝臟，5.68%的肝母細胞表達LGR5，而在17周 PCW肝臟，LGR5+細胞的比例下降到3.80%。此外，在8和17 PCW肝臟存在HNF4A+ID3+肝母細胞亞群（圖4F）。作者將這些HNF4A+ID3+細胞命名為ID3+肝母細胞。scRNA-seq數(shù)據(jù)顯示，8周PCW肝母細胞中25.26%（475個細胞中120個細胞）和17周PCW肝母細胞中15.76%（184個細胞中29個細胞）屬于這個cluster。此外，DLK1在ID3+肝母細胞中高表達，而NCAM1在ID3+肝母細胞中不表達。作者在17 PCW胎肝中鑒定出巨核細胞的兩種主要細胞狀態(tài)（cluster7和cluster10）（圖2E）。結果顯示，第7組中PF4、PPBP、ITGA2B、GP9和MYL9上調，第10組中JCHAIN、IGLC3、IGLC2、IGHM和IGKC上調。
圖4
四、人胎肝組織紅細胞分化與成熟途徑研究
在8PCW肝臟中，小的紅細胞簇散布在整個肝臟中（圖5A）。在17PCW肝臟中，肝臟充滿了紅細胞，并且完全變紅（圖5b）。值得注意的是，早期的紅細胞位于肝組織的外圍，而中期紅細胞和晚期紅細胞則分散在肝組織的中心區(qū)域（圖5B）。這一戲劇性的形態(tài)學變化表明，在實驗研究期間，人類胎兒肝臟都經(jīng)歷了血液的快速生長和遷移。在8和17PCW肝中均有早、中、晚期成紅細胞。為了研究紅細胞的發(fā)育過程，作者研究了這三種類型紅細胞間差異表達的基因。在8PCW肝臟中，818個基因在早、晚分化過程中逐漸下調，2648個基因在早、晚分化過程中逐漸上調。逐漸上調的基因富含乙醛酸和二羧酸代謝、嘧啶代謝、果糖和甘露糖代謝、丙酮酸代謝和嘌呤代謝，而逐漸下調的基因與丁酸代謝相關（圖5C）。在17PCW肝組織中，有812個基因在分化早期、中晚期逐漸下調，880個基因在分化早期、中晚期逐漸上調。
對下調基因的KEGG富集分析顯示，最顯著的包括果糖和甘露糖代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、牛磺酸和低?；撬岽x、組氨酸和硫胺代謝相關的信號通路。上調基因的高度富集項與丙酸代謝有關（圖5D）。作者進行了早、中、晚期細胞間的配體-受體相互作用分析，發(fā)現(xiàn)在早期-中晚期細胞通訊中發(fā)現(xiàn)了促紅細胞生成素（EPO）、蛋白酪氨酸磷酸酶受體C（PTPRC）、連接蛋白細胞粘附分子3（NECTIN3）（圖5E）。此外，還對紅細胞的分化軌跡進行了分析，得出了一條緊密相連的分化軌跡，分化成五個主要分支（圖5F）。這表明系統(tǒng)是通過一個連續(xù)的而不是幾個斷開的譜系來維持的。此外，在8PCW肝臟和17PCW肝臟的早期、中期和晚期紅細胞中分別鑒定了617、674和503個DEGs。為了進一步了解8PCW肝臟和17PCW肝臟之間紅細胞的差異，對兩個胚胎階段的基因表達模式進行了PCA分析。從每種細胞類型中取樣50個點以產(chǎn)生平衡的數(shù)據(jù)集，并且發(fā)現(xiàn)基于它們的轉錄相似性可以區(qū)分8 PCW和17 PCW肝臟中的所有點（圖5G，H）。
圖5
五、人胎肝組織中肝病相關基因的表達模式
為了確定與肝臟疾病胎兒起源相關的功能基因，作者將胎兒肝臟ST數(shù)據(jù)與公開的網(wǎng)絡資源整合，以直觀地探索與肝臟疾病相關的細胞類型和空間區(qū)域。17個已發(fā)表并與肝病相關的基因主要在巨核細胞和內皮細胞中表達，在任何其他細胞類型中幾乎不表達（圖6A，B）。例如，SPP1、TGFB1、JAG1、STAT1和VIM與先天性膽道閉鎖有關，并被證實在內皮細胞和巨核細胞中強烈表達。TGFB1和THBS1（先天性肝纖維化相關）在巨核細胞和內皮細胞中也有高表達。此外，兒童肝細胞癌相關基因SPP1和TGFB1在內皮細胞和巨核細胞中也有強表達。值得注意的是，SPP1和TGFB1基因不僅與先天性（和兒童期）肝病有關，也與成人肝病有關。在此，作者還分析了一些與成人肝病相關的基因的特異性表達。例如，乙型肝炎相關基因（GP1BA、HSPG2、CCL5和SPP1）、脂肪肝相關基因（COL3A1、CCL5和SPP1）、酒精性肝病相關基因（CAV1、ELANE、CCL5和SPP1）、原發(fā)性膽汁性肝硬化相關基因（TGFB1、PDE5A、COL1A1、CCL5和SPP1）和原發(fā)性惡性肝腫瘤相關基因（SELP、PECAM1、，HSPG2和THY1）主要表達于內皮細胞和巨核細胞，在其他細胞中幾乎不表達。
為了進一步揭示這一現(xiàn)象，作者分析了這17種肝病相關基因在17PCW胚胎腎臟中的表達水平。除PECAM1外，其余基因在17PCW腎中表達。但其表達模式與肝臟不同，主要不在巨核細胞和內皮細胞中表達，說明這些肝病相關基因在胚胎肝臟中具有獨特的基因表達模式。此外，對這17個肝病相關基因的蛋白質相互作用網(wǎng)絡分析顯示TGFB1、COL1A1、SPP1、PECAM1和THBS1在表達網(wǎng)絡中起關鍵作用，而PDE5A與其他基因沒有相互作用（圖6C）。
圖6
六、人胎肝組織發(fā)育基因分析WGCNA分析
為了更好地了解與肝臟發(fā)育相關的基因調控變化和細胞類型之間的相互作用，作者使用WGCNA算法構建了一個基于主要細胞簇中差異表達基因的ST數(shù)據(jù)無偏共表達分析。在8PCW肝臟中確定了5個主要的共表達模塊，并在17PCW肝臟中定義了兩個基因表達模塊（相關指數(shù)>0.56）（圖7A）。每個模塊在細胞cluster中顯示出不同的相關性。分析這些模塊發(fā)現(xiàn)，許多模塊是由基因優(yōu)先表達在特定的細胞群。此外，高相關性模塊往往包含豐富的KEGG途徑、GO生物過程和蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網(wǎng)絡，這進一步突出了基因功能的協(xié)作模式（圖7B）。在8 PCW肝臟中，KEGG分析顯示藍色模塊富集了多種途徑，包括核糖體、DNA復制和谷胱甘肽代謝。黃色模塊23個基因的共表達網(wǎng)絡顯示了PF4和PPBP在表達網(wǎng)絡中的重要作用。此外，細胞群之間的細胞通訊和信號轉導調控是胎兒肝臟發(fā)育的過程。為了研究胎兒肝臟中的細胞通訊和空間串擾，作者進行了配體-受體相互作用分析，發(fā)現(xiàn)細胞cluster之間存在活躍的細胞通訊（圖7C、D）。CD74-MIF、DLK1-NOTCH3、IGF2-IGF1R、AGT-AGTR1和CCL2-ACKR1等配體-受體對在8PCW肝臟中更常見，ESAM-ESAM、TIMP1-FGFR2、JAG1-NOTCH3、LTBR-LTB和PLXNB2-PTN等配體-受體對在17PCW肝臟中更常見。此外，8PCW和17PCW肝臟共有129個配體-受體對。
圖7
討論
人類胎兒肝臟在子宮內的發(fā)育至今仍知之甚少。在這項研究中，作者應用了一種方法來識別和空間定位胎兒肝組織中不同的細胞狀態(tài)、亞群和細胞類型。該方法首先通過scRNA-seq對活組織中存在的cluster和細胞類型進行表征，同時通過ST鑒定轉錄組區(qū)域。通過MIA，可以完美地整合ST數(shù)據(jù)和scRNA-seq數(shù)據(jù)，并以無偏的方式分析感興趣區(qū)域的數(shù)據(jù)。
在ST和scRNA-seq數(shù)據(jù)中鑒定了三個肝細胞亞群，它們在每個亞群中顯示出不同的基因表達和功能富集。提示不同區(qū)域的肝細胞可能具有不同的功能。在這些亞群的細胞通訊中，發(fā)現(xiàn)了幾種活性配體-受體對，如DLK1NOTCH2、EFNA1-EPHA2、AGT-AGTR1。
自從Barker（1990）發(fā)表了《成人疾病的胎兒和嬰兒起源》以來，人們對宮內環(huán)境及其對成人疾病的影響給予了極大的重視。環(huán)境的變化會引起身體的反應和調整。在胚胎階段，所有組織器官都處于發(fā)生、分化和發(fā)育的最敏感階段。如果宮內環(huán)境不利于胚胎分化和發(fā)育，那么胚胎會發(fā)生結構和功能變化，包括表觀遺傳機制，這種胚胎的適應性變化將對其生命造成嚴重甚至不可逆轉的損害。在本研究中，作者重點研究了肝臟疾病相關基因在胚胎肝臟中的表達，發(fā)現(xiàn)17個已發(fā)表并與肝臟疾病相關的基因主要在巨核細胞和內皮細胞中表達，在其他細胞中幾乎不表達。
綜上所述，將scRNA-seq數(shù)據(jù)與空間信息相結合，識別出一套全面的基因探針，這些探針可以總結空間和細胞信息，并提供對人類胎兒肝臟中所有細胞類型分化過程的清晰而全面的了解。本研究所得的結果有助于今后的研究免疫性和感染性肝病發(fā)病機制的研究及治療靶點的確定。
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