哺乳動物生長發(fā)育過程一直是一個經典的話題，隨著單細胞技術發(fā)展，單細胞轉錄組研究揭示哺乳動物大腦皮層細胞的異質性，但是對于表觀調控研究還未深入。為了在單細胞水平研究轉錄組和表觀調控的關系，百邁客可以提供單細胞多組學ATAC&基因表達檢測（scATAC&GEX-seq），真實反映同一個細胞內表觀調控與基因表達內在聯(lián)系，確定假定的調控元件（啟動子，調節(jié)因子）和它們的靶基因之間的聯(lián)系。此外百邁客業(yè)務還包括單細胞轉錄組、空間轉錄組、、單細胞免疫組庫等，有興趣的老師可以聯(lián)系當?shù)劁N售。接下來我們看看Nature發(fā)表單細胞水平表觀基因組學研究思路，文章詳情如下：
發(fā)表期刊：Nature
影響因子：49.962
原文鏈接：https://international.biocloud.net/zh/article/detail/34616060
發(fā)表日期：2021-10-06
摘要
在哺乳動物發(fā)育過程中，染色質狀態(tài)的差異與細胞分化相一致，反映了基因調控圖譜的變化。在大腦發(fā)育過程中，細胞命運和圖譜特征對于定義細胞特征和賦予神經發(fā)育障礙選擇脆弱性非常重要。為了確定發(fā)育中人腦的特定細胞類型的染色質可及性模式，作者使用了一種單細胞轉座酶可及性測序分析方法(scATAC-seq)，對來自人前腦的原始組織樣本進行了測序分析。應用無偏估計來識別在神經形成過程中經歷了廣泛的細胞類型和大腦區(qū)域特異性可及性變化的基因組位點，并應用綜合分析來預測特定細胞類型的候選調控元件。結果發(fā)現(xiàn)，腦類器官包含了大多數(shù)假定的細胞類型特異性增強子可及性模式，但缺乏許多體內發(fā)現(xiàn)的細胞類型特異性開放染色質區(qū)域。對腦區(qū)域染色質可及性進行系統(tǒng)比較，發(fā)現(xiàn)了大腦皮層神經前體細胞之間出人意料的差異，表明視黃酸信號在前額葉皮質神經元譜系確定中起著重要作用。總之，結果揭示了染色質狀態(tài)對細胞類型多樣性和細胞命運特異性的發(fā)展模式具有重要作用，并評估了腦類器官作為皮層發(fā)育模型的√確度和穩(wěn)定性。
背景介紹
大腦皮層的細胞類型通常是根據(jù)少數(shù)形態(tài)學、解剖學和生理學特征進行分類的(圖1)。新興的單細胞轉錄學，包括single-cell RNA sequencing (scRNA-seq)，已經能夠大規(guī)模平行分析單個細胞的數(shù)千個分子特征，并揭示了密切相關的細胞類型之間的差異，例如位于大腦皮層不同區(qū)域的興奮性神經元。盡管取得了一些進展，但人大腦皮層中出現(xiàn)不同神經元譜系的發(fā)育機制仍然基本未知。
染色質狀態(tài)通過調節(jié)基因調控元件(如增強子)的可及性來確定基因組的功能結構，這些元件是轉錄調節(jié)因子的結合位點。在發(fā)育過程中，轉錄因子的順序級聯(lián)逐漸重塑，并且不同細胞類型呈現(xiàn)出染色質可及性的差異化。盡管染色質的可及性是細胞特性的一個基本特征，但關于大腦發(fā)育過程中染色質狀態(tài)變化的研究相對較少。目前單細胞基因組學已經能夠使用scATAC-seq以細胞分辨率對染色質狀態(tài)進行可伸縮分析。在發(fā)育中的小鼠大腦中，scATAC-seq揭示了作為神經發(fā)育過程基礎的染色質可及性的高度動態(tài)變化。有必要將這些研究擴展到人類初級組織，以便更好地了解非編碼調控元件(包括人類特有的神經發(fā)育增強子)的突變如何干擾正常的發(fā)育過程，并導致精神神經發(fā)育障礙的遺傳基礎。
圖1：發(fā)育中皮質的橫截面示意圖，顯示了主要細胞類型。
發(fā)育中大腦的染色質狀態(tài)
為了在單細胞分辨率下觀察發(fā)育中人腦的染色質狀態(tài)，作者對6例妊娠中期的人前腦進行了scATAC-seq，包括背外側前額葉皮層(PFC)、初級視覺皮質(V1)、初級運動皮質(M1)、初級軀體感覺皮層、背外側頂葉皮質、顳葉皮質、島葉皮質和內側神經節(jié)隆起(MGE)。共有77,354個細胞通過質控進行下游分析。scATAC數(shù)據(jù)庫的聚類結果與并行產生的混合ATAC-seq測序的數(shù)據(jù)高度相關，并且生物學重復之間的相關性系數(shù)也很高。對數(shù)據(jù)進行了降維處理與批次效應校正。使用Leiden群落檢測算法識別了25個不同的clusters。有力地鑒定了皮質和皮質下(MGE)兩種不同的細胞類型。
圖2實驗流程與scATAC-seq細胞的細胞類型
使用基因活性分數(shù)來區(qū)分細胞類型，鑒定了多種主要的細胞類型，包括放射狀膠質細胞(RGS)、中間前體細胞(IPC)、深層(皮質V-VI層)興奮性神經元(dlENs)、上層(皮質II-IV層)興奮性神經元(UlENs)、MGE和CGE來源的皮質中間神經元(分別為IN-MGES和IN-CGES)、胰島神經元、MGE的前體細胞、小神經膠質細胞、少突膠質前體細胞（OPCs）、內皮細胞以及壁細胞。此外，結合scRNA-seq數(shù)據(jù)，使用CellWalker將scATAC-seq細胞與細胞類型匹配。CellWalker以更精細的分辨率識別細胞類型和更廣泛的細胞亞型。此外，作者可以在兩種亞型(TRGS和ORGS)之間識別出不同的開放區(qū)，這兩種亞型分別表達CRYAB和HOPX，這表明scATAC-seq能夠在高分辨率下區(qū)分細胞亞型，具有更高的靈敏度。
圖3細胞類型標記基因的特異性
識別特定細胞類型的增強子
為了確定候選的基因調控元件，從每種細胞類別中找出總的單個細胞的開放區(qū)。將重疊的開放區(qū)合并，總計459,953個開放區(qū)。對基因組中開放區(qū)進行注釋，其在基因內含子和遠端基因間隔區(qū)以及轉錄起始點附近區(qū)域富集。將開放區(qū)與Roadmap Epicenomics 25-state chromatin model相交，發(fā)現(xiàn)啟動子和增強子state強烈富集，以及轉錄、異染色質和靜止state的耗盡。每種細胞類型確定了特定于細胞類型的差異可及的開放區(qū)，共有265,123個開放區(qū)，大多數(shù)細胞類型具有數(shù)千個特異的開放區(qū)。此外，還確定了八個大腦區(qū)域之間可區(qū)別訪問的開放區(qū)信號值。
為了鑒定候選增強子，整合了ATAC-seq、CUT&Tag、Hic和基因表達數(shù)據(jù)，并使用接觸活性算法來預測所有類型的皮質細胞的增強子-基因相互作用。共預測了25,659個基因連鎖增強子。其中在發(fā)育中的人皮層分離的細胞上進行了染色質免疫沉淀和測序(PLAC-seq)，發(fā)現(xiàn)了67,493個開放區(qū)以及10,050個預測的增強子，這些開放區(qū)和預測的增強子與預測的細胞類型特異性增強子相關的基因被富集。為了進一步驗證注釋的z確性，將開放區(qū)與從人類皮質組織樣本生成的公開可用數(shù)據(jù)進行關聯(lián)分析。發(fā)現(xiàn)scATAC-seq鑒定到了混合測序數(shù)據(jù)注釋的大多數(shù)開放區(qū)，并且還鑒定了許多在混合數(shù)據(jù)中未預測的細胞類型特異性peaks，特別是富集在諸如小神經膠質細胞和內皮細胞的稀有細胞群體中的開放區(qū)。在功能驗證的前腦增強子中，大多數(shù)(319個中的304個)與染色質可及性開放區(qū)重疊，但只有67個重疊的增強子是通過激活接觸方法進行預測。總之，這些分析表明，scATAC-seq是一種從異質組織樣本中檢測染色質可及性模式的可靠方法。然而，預測的增強子與以前發(fā)表的研究的有限重疊表明，迫切需要更好地理解預測調控潛力的計算機算法的相關特征。
為了確定細胞類型的調節(jié)“語法”，計算了已知的轉錄因子結合基序在細胞類型特異的開放區(qū)中的富集。轉錄因子基序的富集與標記基因富集的細胞類型注釋密切相關。為了在單細胞水平上檢查轉錄因子基序的富集，作者還使用了ChromVAR(方法)，發(fā)現(xiàn)每個cluster的排列靠前的基序富集基本一致。這些發(fā)現(xiàn)確定了scATAC-seq在不同細胞類型中識別出與已知轉錄因子表達模式一致的染色質可及性模式，并為發(fā)現(xiàn)細胞圖譜和細胞命運的轉錄因子編碼提供了路徑。
圖4 不同細胞類型、原始scATAC-seq細胞中每個區(qū)域的特異性peaks以及預測增強子-基因相互作用
調控區(qū)突變引發(fā)的疾病風險
不同發(fā)育階段和分化狀態(tài)的染色質狀態(tài)的細胞分辨率數(shù)據(jù)可能提供突變和發(fā)育中的不同細胞類型選擇性脆弱性之間的聯(lián)系。為此，研究者將特定細胞類型的ATAC-seq peaks和預測的增強子與疾病相關的常見和罕見的非編碼突變體記性關聯(lián)分析。首先分析了細胞類型特異性的peaks sets、預測的增強子、啟動子相互作用區(qū)域與基因組區(qū)域重疊的peaks值，這些區(qū)域在發(fā)育遲緩的個體中富集了拷貝數(shù)變異；結果發(fā)現(xiàn)dlEN、內皮/壁層和小神經膠質細胞特異性peaks顯著富集，以及中間神經元中重疊啟動子相互作用區(qū)的peaks顯著富集。
由于這些區(qū)域不提供針對單個調控元件或基因的特異性，所以又測試了特定細胞類型的peaks、預測的增強子以及與ASD、神經發(fā)育延遲(NDD)相關基因附近區(qū)域的啟動子相互作用區(qū)域重疊peaks的富集情況，并發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)細胞類型中這些區(qū)域顯著富集或缺失。還對ASD和NDD患者的細胞類型特異性peaks和預測的DNMs的增強子進行了比較分析；但與同胞家系相比，在先證者中注釋的DNMs沒有顯著富集。此外，將預測的增強子與包含神經發(fā)育疾病相關基因的拓撲結構域(TADS)相交，發(fā)現(xiàn)在幾種細胞類型的TADS中有顯著的共定位。
最后，研究者評估了在預測的每種細胞類型的增強子中與神經精神疾病風險相關的常見變異的富集程度。對精神分裂癥、ASD、重度抑郁癥和雙相情感障礙進行了部分遺傳連鎖不平衡(LD)回歸分析。結果發(fā)現(xiàn)，與精神分裂癥相關的常見突變的興奮性和抑制性神經元增強子富集?？偠灾毎愋吞禺愋匀旧|狀態(tài)數(shù)據(jù)有可能在皮質發(fā)育過程中確定特定的調控程序，這些程序很有可能導致神經發(fā)育障礙，特別是提高的疾病相關的突變。
圖5：scATAC-seq peaks中疾病相關變異的富集和耗盡
神經發(fā)生中染色質的動態(tài)變化
為了更好地理解轉錄組和表觀基因組變化如何在神經發(fā)生過程調節(jié)細胞命運，聯(lián)合分析了來自視覺皮質的相關細胞類型的scRNA-seq和scATAC-seq數(shù)據(jù)。基因表達和基基因活性在共嵌空間的預測顯示，不同細胞類型分群不受特征模式的影響。為了確定興奮性神經元分化和成熟后的染色質可及性軌跡，在共嵌空間對細胞進行了擬時間排序，恢復了已知的興奮性神經元分化的細胞類型的發(fā)育序列。發(fā)現(xiàn)了超過25000個開放區(qū)，在擬時間內具有瞬時可及性，包括超過5000個預測的增強子，其中許多與細胞類型識別相關的基因相互作用。
圖6：人腦皮層神經發(fā)生過程中染色質可及性的動態(tài)變化
區(qū)域特異性染色質狀態(tài)
在神經發(fā)生的早期，出現(xiàn)了特定區(qū)域類型的皮質興奮性神經元，但在不同區(qū)域的前體細胞之間只發(fā)現(xiàn)了有限的轉錄差異。調控元件的可及性變化通常先于基因表達。研究者比較了頭-尾軸兩端、PFC和V1的興奮性譜系細胞的scRNA-seq和scATAC-seq圖譜。在每種模式中，對細胞進行擬時間分析，確定分化軌跡，并沿著該軌跡確定PFC和V1譜系之間轉錄或染色質狀態(tài)差異變得明顯的“分支點”。與轉錄組數(shù)據(jù)揭示了興奮性神經元的區(qū)域特異性分群不同的是，染色質狀態(tài)特征表明PFC和V1中間前體細胞群體之間存在顯著差異。在轉錄水平上，PFC和V1IPCs只有少數(shù)幾個基因有差異表達，而染色質可及性分析發(fā)現(xiàn)這些細胞類型之間有1800多個差異可及區(qū)。
為了確定可能導致PFC和V1譜系分化的調控程序，又對PFC和V1細胞之間可區(qū)分的開放區(qū)進行了轉錄因子結合位點富集分析。該分析鑒定了幾個轉錄組研究預測的轉錄因子。該分析還在PFC細胞中發(fā)現(xiàn)了視黃酸(RA)信號通路的組成部分——在妊娠中期的PFC中RA活性增加。
圖7：祖細胞染色質狀態(tài)的區(qū)域差異預示著區(qū)域特異性興奮神經元的出現(xiàn)
視黃酸在大腦皮層區(qū)域化中的作用
在哺乳動物大腦發(fā)育的過程中，視黃酸信號在神經組織中發(fā)揮著重要的作用。為了測試RA是否促進人類PFC的分化，在含有或不含有維生素A(RA合成的前體)的情況下培養(yǎng)皮質類器官。同時利用DEAB(一種有效的RA合成抑制劑)處理與維生素A一起培養(yǎng)的腦類器官。在分化的第10周，此時深層神經正在發(fā)生，利用scRNA-seq分析了腦類器官。發(fā)現(xiàn)在維生素A存在下培養(yǎng)的興奮性前腦神經元與不含維生素A或在DEAB存在下培養(yǎng)的腦類器官的神經元是分開聚類的。還發(fā)現(xiàn)了區(qū)分PFC和V1皮層神經元的信號。利用目前的分類方法注釋類器官神經元中的PFC和V1神經元的特征；與未使用維生素A培養(yǎng)或使用DEAB處理的神經元相比，維生素A培養(yǎng)的類器官中PFC類似神經元的比例始終較高。免疫染色證實了基因產物的差異表達，并發(fā)現(xiàn)與含有維生素A培養(yǎng)的腦類器官的PFC特性一致。這些發(fā)現(xiàn)表明，RA信號通路有助于人類皮質發(fā)育過程中PFC神經元譜系的發(fā)育。
圖8：視黃酸在發(fā)育中的皮質PFC-V1分裂的作用
基準測試腦類腦類器官
由于人體原代組織比較稀缺，對人類神經發(fā)育的研究需要合適的體外模型，如腦類器官。之前單細胞轉錄組學和整體表觀基因組學強調了大腦類器官細胞與體內同類細胞之間的相似性。利用三個遺傳正常的樣本在三個分化時間點的23,555個皮質類器官細胞進行了scATAC-seq。為了驗證所產生的細胞系，從來自同一細胞系的類器官中生成了scRNA-seq數(shù)據(jù)，并進行了平行培養(yǎng)，結果表明所有細胞系都表達FOXG1和主要細胞類型的標記。scATAC-seq數(shù)據(jù)中確定了主要的細胞類型，但是單個分群包含的細胞類型特異性開放區(qū)比來自原代細胞少。隨后，通過從原代細胞的開放區(qū)量化了類器官細胞之間的染色質可及性。在原代細胞中共確定了459,953個開放區(qū)，然而在類器官只確定了239,661個開放區(qū)。隨后又發(fā)現(xiàn)在類器官中未檢測到包括小膠質細胞、內皮細胞、星形膠質細胞和OPCs等細胞類型的特定開放區(qū)。當從分析中去除這些開放區(qū)的peaks信號后，在類器官開放區(qū)中尚未發(fā)現(xiàn)V1興奮神經元富集。然而，除了小膠質細胞增強子外，大多數(shù)(超過80%)的預測增強子都存在于類器官中。還鑒定了在原始細胞中沒有發(fā)現(xiàn)的109,960個類器官開放區(qū)。
圖9：腦類器官和原代組織的peaks比較揭示染色質圖譜的顯著差異
討論
在這項研究中，分析了發(fā)育中的人腦中單個細胞的染色質狀態(tài)，并發(fā)現(xiàn)了數(shù)千個追蹤神經元分化的瞬時可及位點。這些狀態(tài)可能揭示了在神經發(fā)生過程中控制細胞命運建立的機制，將它們與來自成人大腦的數(shù)據(jù)關聯(lián)分析，可能使表觀基因組神經發(fā)育軌跡的完全重建成為可能。與以前的研究一致，與疾病變異相關的染色質與神經精神障礙發(fā)病中的有絲分裂期后發(fā)育的皮質興奮性神經元相關。未來需要探索這些調控區(qū)域中的疾病相關變異如何改變發(fā)育中的皮層中的細胞命運。通過比較發(fā)育過程中不同皮層區(qū)域(V1和PFC)的調控情況，發(fā)現(xiàn)了不同的轉錄因子結合位點，它們在這兩個譜系之間存在差異富集。該結果擴展了RA信號在前腦發(fā)育中的作用，表明RA信號有助于人類PFC興奮性神經元的發(fā)育。RA信號調節(jié)失調與一系列神經發(fā)育和精神疾病有關，因此該研究結果可能促進對這些疾病的研究。
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