【文獻(xiàn)精讀】ATAC-seq+RNA-seq聯(lián)手解讀心肌梗死前后的心臟成纖維細(xì)胞的染色質(zhì)可及性圖譜

ATAC-seq技術(shù)是繼FAIRE-seq、MNase-seq、DNase-seq目前最火熱的研究染色質(zhì)開放性的新技術(shù)，自2013年后，文章的發(fā)表量逐年攀升。百邁客已成功開展各種組織類，細(xì)胞類樣本的ATAC-seq，項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)積分滿滿哦！基于ATAC-seq數(shù)據(jù)怎么開展數(shù)據(jù)分析，這里有篇簡(jiǎn)單易學(xué)的套路文章，一起看看吧？

英文名稱：The landscape of accessible chromatin in quiescent cardiac fibroblasts and cardiac fibroblasts activated after myocardial infarction

雜志名稱：Epigenetics

影響因子：4.521

發(fā)表日期：2021年10月25日

摘要

心肌梗死（MI）后，心肌細(xì)胞大量死亡，導(dǎo)致心臟成纖維細(xì)胞增殖和分化，促進(jìn)梗死心肌細(xì)胞外基質(zhì)重塑。最近發(fā)現(xiàn)心臟成纖維細(xì)胞可以進(jìn)一步分化為基質(zhì)纖維細(xì)胞，這是一種新發(fā)現(xiàn)的心臟成纖維細(xì)胞的分化狀態(tài)。不同狀態(tài)的心臟成纖維細(xì)胞具有與其功能密切相關(guān)的不同基因的表達(dá)譜。然而，在這些激活和分化事件發(fā)生期間引起基因表達(dá)變化的機(jī)制仍不清楚。

材料方法

RNA-seq：新鮮分選的來(lái)自小鼠未受傷心肌（靜止的心臟成纖維細(xì)胞）和心肌梗死后第 3 天（早期增殖成肌纖維細(xì)胞）、第 7 天（成熟成肌纖維細(xì)胞）、第 2 周（過(guò)渡基質(zhì)成纖維細(xì)胞）和第 4 周（基質(zhì)成纖維細(xì)胞）梗死區(qū)的心臟成纖維細(xì)胞，每組設(shè)置兩個(gè)重復(fù)

ATAC-seq：新鮮分選的來(lái)自小鼠未受傷心肌和心肌梗死后第3天、第7天、第2周、第4周梗死區(qū)的心臟成纖維細(xì)胞，每組設(shè)置兩個(gè)重復(fù)

實(shí)驗(yàn)方法：共聚焦顯微鏡成像，流式細(xì)胞分選

結(jié)果

一、 不同分化狀態(tài)下心臟成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組分析

本文采用他莫昔芬對(duì)小鼠進(jìn)行處理，并手術(shù)誘導(dǎo)心肌梗死（MI）（圖 1a，b）。未受傷心肌和梗死區(qū)的共聚焦成像顯示MI后心臟成纖維細(xì)胞數(shù)量顯著增加，心臟成纖維細(xì)胞也變大了（圖1c，d））。
對(duì)未受傷心肌和梗死區(qū)分選出來(lái)的心臟成纖維細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq分析（圖2），發(fā)現(xiàn)不同狀態(tài)的心臟成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)有明顯不同。與來(lái)自未受傷心肌的心臟成纖維細(xì)胞相比，總計(jì)5000個(gè)左右的差異基因中有3829個(gè)基因在MI后的心臟成纖維細(xì)胞差異性表達(dá)。差異基因熱圖結(jié)果表明增殖相關(guān)的基因的表達(dá)在MI后第3天達(dá)到峰值，應(yīng)激纖維基因、心肌ECM基因和細(xì)胞遷移基因在MI后第3天和第7天表達(dá)量最高。

圖1 MI后心臟成纖維細(xì)胞的譜系追蹤

圖2 不同分化狀態(tài)下心臟成纖維細(xì)胞的RNA-seq分析

二、 不同分化狀態(tài)下心臟成纖維細(xì)胞的染色質(zhì)圖譜

對(duì)未受傷心肌和梗塞區(qū)的心臟成纖維細(xì)胞進(jìn)行了ATAC-seq分析(圖3)，來(lái)研究在MI后心臟成纖維細(xì)胞的激活和分化過(guò)程中染色質(zhì)的可及性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ATAC-seq峰在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn) (TSS) 和轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn) (TES) 區(qū)域以及外顯子區(qū)域高度富集，而且ATAC-seq峰在可能包含許多啟動(dòng)子的CpG島上高度富集，表明DNA甲基化可能在心臟成纖維細(xì)胞的激活和分化過(guò)程中的染色質(zhì)重塑中起作用。PCA圖和相關(guān)性熱圖說(shuō)明了組內(nèi)重復(fù)樣本的高度一致性及組間的染色質(zhì)可及性的差異性。與來(lái)自未受傷心肌的心臟成纖維細(xì)胞相比，不同差異分組總計(jì)鑒定到100000個(gè)峰，其中36348個(gè)在MI后的心臟成纖維細(xì)胞中具有不同的可及性。

圖3 不同分化狀態(tài)心臟成纖維細(xì)胞的 ATAC-seq 分析

三、 差異基因表達(dá)與動(dòng)態(tài)染色質(zhì)可及性有關(guān)

為了研究啟動(dòng)子可及性是否與心臟成纖維細(xì)胞中的基因表達(dá)相關(guān)，將RNA-seq和 ATAC-seq數(shù)據(jù)結(jié)合起來(lái)進(jìn)行分析（圖4）。發(fā)現(xiàn)至少在一種狀態(tài)下心臟成纖維細(xì)胞中表達(dá)的基因的啟動(dòng)子可及性高于任何狀態(tài)下未表達(dá)的基因。相關(guān)性分析表明在30.77%的基因中發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子可及性和轉(zhuǎn)錄之間有著很強(qiáng)的正相關(guān)性，包括Tcf21（一種靜止的心臟成纖維細(xì)胞標(biāo)記物）、Ki67（一種增殖標(biāo)記物）、Acta2（一種肌成纖維細(xì)胞標(biāo)記物）和Comp（一種基質(zhì)纖維細(xì)胞標(biāo)記物）。
然后根據(jù)檢測(cè)到的啟動(dòng)子的可及性對(duì)它們進(jìn)行分類：高可及性組，低可及性組和動(dòng)態(tài)可及性組。發(fā)現(xiàn)在三個(gè)組中，很多基因的啟動(dòng)子可及性和轉(zhuǎn)錄水平有很強(qiáng)的相關(guān)性，但是在高可及性組中有一些基因的啟動(dòng)子可及性和轉(zhuǎn)錄組水平有著較弱的或者無(wú)相關(guān)性。有趣的是，具有高啟動(dòng)子可及性的基因具有最高的CpG密度，而具有低啟動(dòng)子可及性的基因具有最低的CpG密度（圖4g）。當(dāng)根據(jù)啟動(dòng)子中的CpG密度將5,431個(gè)差異表達(dá)基因分為3組時(shí)，發(fā)現(xiàn)CpG密度較低但具有很強(qiáng)的正相關(guān)性的基因占比最高，進(jìn)一步表明DNA甲基化可以獨(dú)立調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，而與啟動(dòng)子染色質(zhì)可及性無(wú)關(guān)（圖4h）。

圖4 差異基因表達(dá)和啟動(dòng)子可及性的相關(guān)分析

四、 啟動(dòng)子和遠(yuǎn)端區(qū)域的差異染色質(zhì)可及性與差異基因表達(dá)相關(guān)

接下來(lái)選擇了在啟動(dòng)子和遠(yuǎn)端區(qū)域具有差異可及性的基因，研究了它們?cè)诓煌瑺顟B(tài)下心臟成纖維細(xì)胞中表達(dá)水平的變化。共計(jì)鑒定出3518個(gè)具有差異可及性的啟動(dòng)子，其中30.96%的啟動(dòng)子的可及性與基因表達(dá)呈高度正相關(guān)性（圖5a，b）。這表明大部分具有差異可及性的啟動(dòng)子在其相關(guān)基因的表達(dá)中缺乏相應(yīng)的變化。此外，與具有中等或高CpG密度的啟動(dòng)子相比，具有低CpG密度且表現(xiàn)出高度正相關(guān)的啟動(dòng)子占比最高，進(jìn)一步表明啟動(dòng)子區(qū)具有較高的CpG密度的基因，更可能受DNA甲基化而不是啟動(dòng)子可及性的調(diào)節(jié)（圖5b）。
總共確定了41,713個(gè)遠(yuǎn)端ATAC-seq峰，這些峰顯示出不同的可及性。通過(guò)分析這些遠(yuǎn)端ATAC-seq 峰的可及性與其靶基因的表達(dá)之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)一些遠(yuǎn)端ATAC-seq峰有著高度正相關(guān)性，但是這些峰的占比低于啟動(dòng)子區(qū)域中可及性和基因表達(dá)呈正相關(guān)的峰的占比（圖 5c，d）。此外，大多數(shù)遠(yuǎn)端 ATAC-seq 峰具有較低的CpG密度（圖5d），表明DNA甲基化在TF和增強(qiáng)子之間的相互調(diào)節(jié)作用中可能沒(méi)有起主要作用。

圖5 啟動(dòng)子和遠(yuǎn)端區(qū)域的差異可及性和相應(yīng)的基因表達(dá)變化

五、 MI后心臟成纖維細(xì)胞激活和分化的主要增強(qiáng)子和靶向TFs的預(yù)測(cè)

研究發(fā)現(xiàn)，TFs主要靶向遠(yuǎn)端區(qū)域的增強(qiáng)子，這在基因表達(dá)調(diào)控中起重要作用。在遠(yuǎn)端 ATAC-seq 峰中鑒定到440個(gè)已知motif，其中263個(gè)對(duì)應(yīng)的TF 在心臟成纖維細(xì)胞中是有表達(dá)的。為了識(shí)別最有可能導(dǎo)致心臟成纖維細(xì)胞在MI后分化的motif和相應(yīng)的TF，根據(jù)它們?cè)诓煌瑺顟B(tài)的心臟成纖維細(xì)胞中的富集情況，將這些motif分為幾個(gè)組（圖 6a-e)。發(fā)現(xiàn)肌成纖維細(xì)胞中Rora motif的富集顯著下降，并且在肌成纖維細(xì)胞和基質(zhì)纖維細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)了Tcf21 motif富集程度在不斷的逐漸減少（圖 6b）。還發(fā)現(xiàn)一些motif（Nf1、Nfil3、Rela、Ets1 和 AP-1等TFs）的富集在肌成纖維細(xì)胞中暫時(shí)增加，然后在基質(zhì)成纖維細(xì)胞中減少到接近或低于在靜止心臟成纖維細(xì)胞中的富集水平（圖 6c ,d）。

圖6 遠(yuǎn)端ATAC-seq峰中TF motif的鑒定

接下來(lái)分析每個(gè)分組中這17個(gè)TF motif在遠(yuǎn)端ATAC-seq 峰中的結(jié)合位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)與未受傷組相比，對(duì)應(yīng)的靶基因在MI后的分組樣本的心臟成纖維細(xì)胞中是上調(diào)的。分析結(jié)果說(shuō)明除了Ctcf，大多數(shù)MI后的分組樣本中的TF motif在遠(yuǎn)端ATAC-seq峰對(duì)應(yīng)的上調(diào)靶基因區(qū)域中的富集程度高于所有遠(yuǎn)端ATAC-seq峰（圖7a-e）。

圖7 遠(yuǎn)端ATAC-seq峰中TF motif的富集分析

單個(gè)TF靶向的差異表達(dá)基因的比較結(jié)果揭示在Tcf21、Runx1、Tead2、Nf1 和 Fosl1 之間有著最大的交集（圖 8)，表明許多與MI后心臟成纖維細(xì)胞的激活和分化相關(guān)的基因是受多個(gè)關(guān)鍵TF共同調(diào)節(jié)的。

圖8 單個(gè)TF靶向基因的韋恩圖

六、 構(gòu)建心臟成纖維細(xì)胞基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

為了更好地了解這些motif及其相應(yīng)TF在MI后心臟成纖維細(xì)胞基因表達(dá)變化中可能起了哪些調(diào)節(jié)作用，確定了七個(gè)選定的motif（Fosl1、Rora、Stat1、Nf1、Tead2、 Runx1 和 Tcf21)所結(jié)合的基因。在這些基因中挑選了在不同狀態(tài)的心臟成纖維細(xì)胞之間差異最大的前500個(gè)基因，與編碼7個(gè)選定TF的基因（共506個(gè)基因）構(gòu)建基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖（GRN）（圖9a）。506 個(gè)基因中有467個(gè)基因至少受1個(gè)TF調(diào)控，這表明這些TF影響了心臟成纖維細(xì)胞中的基因表達(dá)變化。有趣的是，Tcf21 和 Rora對(duì)大多數(shù)相關(guān)基因有著負(fù)調(diào)控作用。
對(duì)GRN中受7個(gè)TF調(diào)控的基因進(jìn)行GO富集分析，發(fā)現(xiàn)一些與MI后心臟成纖維細(xì)胞生理和功能變化相關(guān)的GO生物學(xué)通路顯著富集，并用于預(yù)測(cè)心肌梗死后心肌成纖維細(xì)胞的激活和分化中單個(gè)TF可能起的調(diào)節(jié)作用（圖 9b）。研究發(fā)現(xiàn) Fosl1、Stat1、Tead2 和 Runx1 可能通過(guò)促進(jìn)促增殖基因表達(dá)或抑制抗增殖基因表達(dá)來(lái)刺激心臟成纖維細(xì)胞增殖。

圖9 心臟成纖維細(xì)胞中的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

利用RNA-seq和ATAC-seq測(cè)序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)在心臟成纖維細(xì)胞的不同狀態(tài)下，啟動(dòng)子的可及性與許多基因的表達(dá)水平之間存在正相關(guān)，提示ATAC-seq是研究心肌梗死后成纖維細(xì)胞啟動(dòng)子可及性的有力工具。有趣的是，心臟成纖維細(xì)胞在不同狀態(tài)下有相當(dāng)數(shù)量的差異表達(dá)基因缺乏相應(yīng)的啟動(dòng)子可及性變化，特別是在CpG密度高的基因中，這表明DNA甲基化可能在不影響啟動(dòng)子可及性的情況下調(diào)節(jié)啟動(dòng)子活性。暗示未來(lái)是需要對(duì)心肌梗死后心臟成纖維細(xì)胞激活和分化過(guò)程中DNA甲基化和染色質(zhì)重塑的的協(xié)同和獨(dú)立作用開展研究。本研究中motif富集分析和 GRN 分析的一個(gè)局限性是缺乏對(duì) TF 與目標(biāo)motif結(jié)合的驗(yàn)證以及驗(yàn)證這些 TF 功能的實(shí)驗(yàn)。本文研究揭示了一些關(guān)鍵TFs在心肌梗死后心臟成纖維細(xì)胞激活和分化中的可能作用，在未來(lái)的研究中，每一種都可以有針對(duì)性地研究，以更詳細(xì)地探討它們的功能作用。

總結(jié)

總的來(lái)說(shuō)，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組和開放染色質(zhì)分析表明，染色質(zhì)可及性可能在心肌梗死后心臟成纖維細(xì)胞的激活和分化中發(fā)揮重要作用。這一綜合分析還表明，在心臟成纖維細(xì)胞的基因表達(dá)調(diào)控中，除了染色質(zhì)可及性外，還有其他機(jī)制的存在。最后，motif分析和GRN構(gòu)建工作確定了幾個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄因子，它們可能通過(guò)對(duì)心臟成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行編程來(lái)協(xié)調(diào)介導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞的順序激活和分化。

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