單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是在單細(xì)胞水平進(jìn)行高通量基因表達(dá)譜檢測(cè)的技術(shù)，可以對(duì)復(fù)雜細(xì)胞群深入分析，表征單個(gè)細(xì)胞的表達(dá)譜，避免單個(gè)細(xì)胞的異質(zhì)性生物學(xué)信息被大量細(xì)胞的均質(zhì)化覆蓋。通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，可鑒定細(xì)胞群、細(xì)胞亞群、篩選細(xì)胞群特有marker基因，并完成對(duì)細(xì)胞分化軌跡的追蹤，從而解析細(xì)胞異質(zhì)性和發(fā)育軌跡。但是單純通過單細(xì)胞測(cè)序得到的細(xì)胞分群，是不能將惡性與非惡性細(xì)胞區(qū)分開的。因此單細(xì)胞CNV分析應(yīng)運(yùn)而生，可以輔助區(qū)分腫瘤組織中的惡性與非惡性細(xì)胞。
什么是infer CNV
InferCNV是TrinityCTAT工具包的一個(gè)組成部分，可以用于腫瘤scRNA-seq數(shù)據(jù)中鑒定大規(guī)模染色體拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV），例如整個(gè)染色體或大片段染色體的擴(kuò)增或缺失。它的原理是：用一組“正?！奔?xì)胞（如癌旁組織來源的細(xì)胞）作為對(duì)照，分析腫瘤基因組上各個(gè)位置的基因表達(dá)量強(qiáng)度變化，通過熱圖的形式展示每條染色體上的基因的相對(duì)表達(dá)量，那么相較于正常細(xì)胞，腫瘤基因組會(huì)表現(xiàn)出過表達(dá)或者低表達(dá)。
Infer CNV的輸入數(shù)據(jù)如下：
(1) scRNA-seq表達(dá)原始矩陣：該矩陣為基因（行）與細(xì)胞（列）矩陣，是以制表符分隔的文件。
(2) 注釋文件：用于定義腫瘤和正常細(xì)胞。共兩列，第一列是cluster，第二列表示已知細(xì)胞類型，以制表符分隔。
(3) 基因或染色體位置文件：提供每個(gè)基因的染色體位置。文件共4列，分別是基因名稱、染色體和基因跨度，文件以制表符分隔。
代碼實(shí)操
1.安裝infercnv
2.Docker安裝
3.sudo docker pull trinityctat/infercnv:latest\
4.R安裝
5.安裝infercnv之前需要安裝軟件JAGS(Just Another Gibbs Sampler)
1.##安裝infercnv
2.if (!requireNamespace(“BiocManager”, quietly = TRUE))
3. install.packages(“BiocManager”)
4.BiocManager::install(version = “devel”)
5.BiocManager::install(“infercnv”)
6.library(infercnv)
7.##將制作好的文件作為輸入
8.#raw_counts_matrix：scRNA-seq表達(dá)原始矩陣
9.#annotations_file：注釋文件
10.#ref_group_names：基因或染色體位置文件
11.infercnv_obj = CreateInfercnvObject(raw_counts_matrix=system.file(“extdata”, “oligodendroglioma_expression_downsampled.counts.matrix.gz”, package = “infercnv”),
12. annotations_file=system.file(“extdata”, “oligodendroglioma_annotations_downsampled.txt”, package = “infercnv”),
13. delim=”\t”,
14. gene_order_file=system.file(“extdata”, “gencode_downsampled.EXAMPLE_ONLY_DONT_REUSE.txt”, package = “infercnv”),
15. ref_group_names=c(“Microglia/Macrophage”,”Oligodendrocytes (non-malignant)”))
16.
17.##將infercnv_obj對(duì)象作為輸入
18.infercnv_obj = infercnv::run(infercnv_obj,
19. cutoff=1, # cutoff=1 works well for Smart-seq2, and cutoff=0.1 works well for 10x Genomics
20. out_dir=tempfile(),
21. cluster_by_groups=TRUE,
22. denoise=TRUE,
23. HMM=TRUE)
24.##輸出文件在當(dāng)前文件夾
https://sourceforge.net/projects/mcmc-jags/files/JAGS/
https://github.com/broadinstitute/inferCNV/wiki/Installing-infercnv
以上來自InferCNV官方：https://github.com/broadinstitute/inferCNV/wiki
infer CNV的應(yīng)用
1、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的惡性細(xì)胞分析
2014年發(fā)表在science（IF=47.728）上的《Single-cell RNA-seq highlights intratumoral heterogeneity in primary glioblastoma》[1]，通過對(duì)基因相對(duì)表達(dá)水平來推斷每個(gè)細(xì)胞的大規(guī)模拷貝數(shù)變異（CNV）。該研究選擇正常人的腦組織bulk RNA-seq的數(shù)據(jù)作為對(duì)照，單細(xì)胞樣本聚為7組，無監(jiān)督分析確定了9個(gè)異常細(xì)胞，它們具有成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞基因表達(dá)增加和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤基因下調(diào)的特點(diǎn)，剩余的420個(gè)細(xì)胞中沒有一個(gè)顯示出與非惡性細(xì)胞或免疫細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄程序相似的特征。雖然非惡性細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境的關(guān)鍵組成部分，但該研究通過解離和CD45+分選后，已經(jīng)很大程度上排除了非腫瘤細(xì)胞。該研究通過infer CNV有效地將腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的正常細(xì)胞與惡性細(xì)胞區(qū)分開來。
2、轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的惡性細(xì)胞分析
2016年發(fā)表在science（IF=47.728）上的《Dissecting the multicellular ecosystem of metastatic melanoma by single-cell RNA-seq》[2]，使用多步驟方法根據(jù)遺傳和轉(zhuǎn)錄狀態(tài)來區(qū)分黑色素瘤中的不同細(xì)胞類型。首先通過對(duì)各染色體上100個(gè)基因片段的表達(dá)進(jìn)行平均，從表達(dá)譜中推斷出大規(guī)模拷貝數(shù)變異（CNV）。其次，根據(jù)細(xì)胞的表達(dá)譜對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分群，結(jié)合CNV分析，發(fā)現(xiàn)惡性細(xì)胞形成一個(gè)單獨(dú)的簇，表明高度的腫瘤間異質(zhì)性。相比之下，按細(xì)胞類型聚集的非惡性細(xì)胞分別被注釋為T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）和NK細(xì)胞。針對(duì)惡性細(xì)胞，該研究后期進(jìn)行細(xì)胞周期分析，篩選處于高分類狀態(tài)的細(xì)胞，查看它們的分子表達(dá)情況；對(duì)于非惡性細(xì)胞，該研究主要討論了其與黑色素瘤微環(huán)境的相互作用。
3、轉(zhuǎn)移性胰腺導(dǎo)管腺癌的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性分析
2021年發(fā)表在Cell Death Discovery（IF=5.241）上的《Single-cell RNA transcriptome reveals the intra-tumoral heterogeneity and regulators underlying tumor progression in metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma》[3]，基于每個(gè)樣本的inferCNV計(jì)算和識(shí)別大規(guī)模染色體拷貝數(shù)變異（CNV），得到CNV熱圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照樣品相比，5種導(dǎo)管細(xì)胞亞型經(jīng)歷了顯著的CNV事件，其中1型導(dǎo)管細(xì)胞的CNV水平顯著高于其他類型的導(dǎo)管細(xì)胞。這些結(jié)果表明導(dǎo)管細(xì)胞的5種亞型都是轉(zhuǎn)移性病變中的惡性細(xì)胞。針對(duì)篩選到的惡性細(xì)胞，著重研究其轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，惡性導(dǎo)管細(xì)胞和癌癥干細(xì)胞具有不同的基因表達(dá)譜，癌癥干細(xì)胞上調(diào)表達(dá)干性特征基因，包括ALDH1A1、PROM1和NES，而導(dǎo)管譜系細(xì)胞cluster上調(diào)表達(dá)導(dǎo)管marker，如MMP7、TSPAN8和SOX9。
參考文章：
1. Anoop P. Patel, Itay Tirosh, et al. Single-cell RNA-seq highlights intratumoral heterogeneity in primary glioblastoma. Science. 2014 Jun 20: 1396-1401.
2. Tirosh I et al. Dissecting the multicellular ecosystem of metastatic melanoma by single-cell RNA-seq. Science. 2016 Apr 8;352(6282):189-96.
3. Qianhui Xu et?al. Single-cell RNA transcriptome reveals the intra-tumoral heterogeneity and regulators underlying tumor progression in metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma. Cell Death Discov. 2021 Nov 3;7(1):331.
百邁客單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組產(chǎn)品介紹
百邁客單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序產(chǎn)品基于10x Genomics系統(tǒng)利用微流體系統(tǒng)和油滴包裹技術(shù)，在單細(xì)胞水平進(jìn)行高通量基因表達(dá)譜檢測(cè)，對(duì)復(fù)雜細(xì)胞群深入分析，表征單個(gè)細(xì)胞的表達(dá)譜，避免單個(gè)細(xì)胞的異質(zhì)性生物學(xué)信息被大量細(xì)胞的均質(zhì)化覆蓋。通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，可鑒定細(xì)胞群、細(xì)胞亞群、篩選細(xì)胞群特有marker基因，并完成對(duì)細(xì)胞分化軌跡的追蹤，從而解析細(xì)胞異質(zhì)性和發(fā)育軌跡。
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