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摘要
背景：全長轉(zhuǎn)錄組能夠檢測癌細胞中異常剪接異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)。這些亞型有時候被翻譯，被人類白細胞抗原（HLA）分子呈現(xiàn)，并被識別為新抗原。該研究使用(MinION)構(gòu)建了一個非小細胞肺癌中異常剪接的目錄，通過該目錄可以識別新亞型和潛在的新抗原。
結(jié)果：對22組細胞系進行全長轉(zhuǎn)錄組測序，共鑒定出2021種新的剪接異構(gòu)體。其中一些異構(gòu)體的蛋白質(zhì)表達通過蛋白質(zhì)組分析進行驗證。無義介導的mRNA衰減因子(NMD)UPF1的降低和剪接因子SF3B1的減少增加了異常轉(zhuǎn)錄本的比例。NetMHC對每種HLA分子結(jié)合的親和力的評估顯示，一些亞型可能產(chǎn)生新抗原候選體，還在7個非小細胞肺癌標本中發(fā)現(xiàn)了剪接亞型。酶聯(lián)免疫吸附斑點試驗表明，大約一半的候選肽有可能通過與人類白細胞抗原分子的相互作用激活T細胞反應。大約一半的多肽通過與HLA分子的相互作用具有激活T細胞反應的潛力。最后，作者通過參考構(gòu)建的目錄來估計癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫中的亞型數(shù)量，發(fā)現(xiàn)NMD因子的破壞與TCGA-Lung Adenocarcinoma數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)的剪接亞型數(shù)量顯著相關。
結(jié)論：結(jié)果表明，全長轉(zhuǎn)錄組測序?qū)τ凇檀_鑒定癌細胞中異常轉(zhuǎn)錄本至關重要。
材料和方法
實驗材料：22組肺腺癌細胞系（A427、A549、ABC-1、H1299、H1437、H1648、H1650、H1819、H2126、H2228、H2347、H322、II-18、PC-14、PC-3、PC-9、RERF-LC-Ad1、RERF-LC-Ad2、RERF-LC-MS、RERF-LC-OK、RERF-LC-KJ和VMRC-LCD）
實驗方法：全長轉(zhuǎn)錄組測序、RNA-seq測序
結(jié)果
1.肺癌細胞系的全長轉(zhuǎn)錄本
對22個NSCLC細胞系進行了全長轉(zhuǎn)錄組測序，其中肺癌特征基因組表達的突變和轉(zhuǎn)錄組本被表示。從每個細胞系中平均產(chǎn)生了350萬條reads，平均reads長度為1.6 kb，獲得的全長cDNA片段通過Minimap2測序與人類基因組比對。所有的剪接位點都通過二代轉(zhuǎn)錄組測序確認。將獲得的可變剪接進一步與參考序列數(shù)據(jù)庫(RefSeq)當前的轉(zhuǎn)錄本模型進行比較。在映射到RefSeq轉(zhuǎn)錄本的reads中，超過50%的reads成功覆蓋了多達8000個基因的全長轉(zhuǎn)錄本。對于每個基因，MinION的reads(RPM)與二代轉(zhuǎn)錄本reads(TPM)具有很強的相關性。
文章鑒定了轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體的完整外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，并將其分為以下類型：未標記外顯子、外顯子跳躍、互斥外顯子、內(nèi)含子保留、5’可變外顯子和3’可變外顯子(圖 1a)。因此，文章從所有細胞系中鑒定出3474種非RefSeq亞型，并將它們命名為假定的“異常剪接亞型”，以下簡稱為“亞型”，2021種亞型包含至少一個在參考序列或基因代碼數(shù)據(jù)集中沒有出現(xiàn)的剪接事件(圖1b)。還在單個全長轉(zhuǎn)錄本上鑒定了這些剪接事件的新組合，這很難通過短reads測序數(shù)據(jù)的片段reads檢測到。
Fig. 1
每種非小細胞肺癌細胞系的模式和數(shù)量代表特征性異常剪接事件(圖一d)。轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量從323到725不等。不同細胞系的轉(zhuǎn)錄本組成不同。例如，內(nèi)含子保留和替代的最后一個外顯子構(gòu)成了RERF-LC-Ad2中大比例的同種類型，而未標記的外顯子和外顯子跳躍是H1819的特征。這些結(jié)果表明，即使在細胞系中，異常剪接轉(zhuǎn)錄本的模式也是多樣的。剪接事件的一個新的復雜組合轉(zhuǎn)錄本的例子如圖1e所示。CTSV在ABC-1細胞中表達了兩種亞型，其中一種包括發(fā)生在外顯子2和3之間的替代性最后一個外顯子和內(nèi)含子保留的組合。
還觀察到具有多種亞型的基因。例如，HNRNPA2B1顯示了在PC-3細胞的3’UTR內(nèi)包含選擇性剪接事件的四種亞型(圖1f)。作者總共鑒定了663個具有多種亞型的基因(圖1g)。這些結(jié)果反映了全長轉(zhuǎn)錄組測序在全面檢測新的復雜亞型方面的巨大潛力。
為了驗證計算的準確性，比較流程和TALON軟件檢測到的可變剪接。在計算流程中檢測到的725種轉(zhuǎn)錄本中有708種(98%)也在TALON中檢測到，其中676種(93%)成功通過了TALON的過濾條件(圖1h)。TALON檢測不到的17種亞型由reads糾錯工具校正。雖然僅在TALON中檢測到21，745種亞型，但99%的亞型被作者之前的過濾條件過濾掉的reads所覆蓋(歸因于不明確的比對或低表達水平，數(shù)據(jù)未顯示)。作者的過濾條件旨在避免假陽性檢測，并保留更高表達的轉(zhuǎn)錄本，這些轉(zhuǎn)錄本可以翻譯成新抗原；因此，作者的流程提取了比TALON提取的亞型更保守的亞型。
為了確認重復位點導致reads錯位的影響，作者評估了22個細胞系中檢測到的5508個剪接節(jié)點。作者提在剪接位點周圍50 bp的區(qū)域，使用repeatmask搜索重復區(qū)域，結(jié)果，94.9%的拼接位點沒有重疊重復序。這一結(jié)果表明，新的剪接位點與重復序列并不特別相關。
2.檢測到的轉(zhuǎn)錄本
作者進一步發(fā)現(xiàn)了新的轉(zhuǎn)錄本，發(fā)現(xiàn)45%的轉(zhuǎn)錄本在細胞系中共有，在每個細胞系獨有1894種轉(zhuǎn)錄本(圖2a)。共有1354個基因在兩個或多個細胞系中含有異常剪接轉(zhuǎn)錄本(圖2b)。
為了表明富含同種亞型的基因，作者比較了有或無的同種亞型基因長度、外顯子數(shù)量和表達水平。與不含同種亞型的基因相比，含有至少一種同亞型的基因顯示出更短的序列長度，并且由較少數(shù)量的外顯子組成；然而，發(fā)現(xiàn)含有同種亞型的基因的表達水平明顯升高。作者還發(fā)現(xiàn)，同種亞型的多樣性與基因長度和表達水平有關。具有一種同種亞型的細胞系的基因顯示了具有兩種或多種同種亞型在基因長度和表達水平上的顯著差異。例如，在VMRC-LCD中，富含同種亞型的基因往往比只有一種同亞型的基因長度更短，表達量更高(圖2c–e)。
為了檢驗表達水平和檢測概率的關系，作者將VMRC-LCD細胞的測序reads再抽樣至1/2、1/5、1/10、1/50和1/100(n= 100)并計算每個亞型的檢測概率。作者將這些亞型分為三類，高、中、低，三類中的每一類如下:(1)基因的TPM(總基因表達)，它是根據(jù)短reads RNA測序數(shù)據(jù)；(2)isoform-reads ratio(基因內(nèi)的轉(zhuǎn)錄本頻率)；(3)isoform-reads。因此，作者發(fā)現(xiàn)三類isoform在“TPM”和“isoform-reads ratio”類別中顯示出相似的檢測概率，這表明isoform檢測在某種程度上與這些類別無關。然而，在本研究進行的測序深度中，每個病例似乎都達到了飽和狀態(tài)。平均單個肺癌細胞中有360000個mRNA分子。因此，每個細胞一個mRNA拷貝相當于3個TPM。在VMRC-LCD中，檢測到至少一種亞型的基因的*小TPM為6 TPM。這些事實表明，作者能夠識別細胞內(nèi)表達水平非常低的亞型。
作者還使用具有至少一種轉(zhuǎn)錄本靶基因進行了基因本體分析，發(fā)現(xiàn)參與翻譯途徑的RNA結(jié)合蛋白顯著富集。這一結(jié)果與先前對MDS臨床標本的研究一致。該報道研究了患有SF3B1、U2AF1和SRSF2突變的患者中的異常剪接事件。一些核糖體蛋白基因和剪接相關基因的表達通常通過可變剪接事件來調(diào)控，因此可能容易受到可變剪接的影響。一般來說，核糖體蛋白基因比其他基因更短，表達水平更高。這一特征可能導致富含轉(zhuǎn)錄本的基因具有較短的基因長度和較高的表達水平(圖2c–e)。
在細胞系中，未發(fā)現(xiàn)異常剪接異構(gòu)體數(shù)量與EGFR、KRAS或NRAS驅(qū)動基因突變之間存在顯著關聯(lián)(圖2g)。值得注意的是，作者發(fā)現(xiàn)異常剪接異構(gòu)體的數(shù)量與基因組TMB相關性較差，而TMB是新抗原的來源，也是ICI有效性的已知標記之一(r = 0.3，圖2h)。本研究檢測到的異常剪接異構(gòu)體也可能被翻譯并作為新抗原呈現(xiàn)。
Fig. 2
3.異常剪接異構(gòu)體的生物學驗證
接下來，作者研究了癌細胞中異常剪接轉(zhuǎn)錄本的潛在原因。由于作者能夠?qū)⑥D(zhuǎn)錄本作為全長轉(zhuǎn)錄本的一種形式進行分析，作者計算了含有PTCs的異常轉(zhuǎn)錄本，它們可能是NMD的靶點。作者發(fā)現(xiàn)約30%的異常亞型含有PTCs(圖3)。事實上，當作者檢查VMRC-LCD的情況時，它顯示了高數(shù)量的異常剪接異構(gòu)體，作者發(fā)現(xiàn)這個細胞系含有一個剪接位點突變UPF1，這是一個關鍵的NMD因子。為了更直接地驗證異常轉(zhuǎn)錄本積累的原因，作者在UPF1中對A549進行了siRNA敲除(圖3b)。作者同樣結(jié)合Illumina平臺RNA測序數(shù)據(jù)分析了獲得的全長cDNA MinION reads。正如預期的那樣，UPF1敲除顯著增加了nmd靶向異構(gòu)體的比例(圖3c)。例如，SURF2基因中內(nèi)含子保留的亞型僅在UPF1敲除細胞中檢測到，盡管該亞型含有PTC并可能被NMD靶向(圖3d)。為了驗證這種異構(gòu)體在upf1缺失細胞中的特異性表達，作者使用引物進行RT-PCR。SURF2外顯子2的5剪接位點對UPF1敲除實驗的響應增加了兩到三倍(圖3e)。這種增加也被檢測到在PCR產(chǎn)物之間的大小差異。
SF3B1是一種眾所周知的剪接因子，在多種疾病中發(fā)生突變，并導致異常剪接亞型的增加。作者通過SF3B1敲除評估剪接損傷的影響以及研究剪接因子的畸變是否影響轉(zhuǎn)錄本的產(chǎn)生。作者發(fā)現(xiàn)外顯子跳躍的比例顯著增加(圖3f)，例如，PSMD7的外顯子3和6 在敲除后被改變(圖3g)。SF3B1-depleted的A549細胞中，外顯子跳躍亞型的表達PSMD7在中顯著增加，相反，RefSeq類型減少。為了確認剪接位點近端區(qū)域的共有序列，作者收集了僅在SF3B1在A549細胞中敲除檢測到的外顯子跳躍異構(gòu)體。在這項分析中，作者用新的剪接連接的10 bp的區(qū)域，并跳過了外顯子。具有外顯子跳躍亞型的基因在翻譯和泛素-蛋白酶體途徑中顯示出顯著的富集，因此，這些因素的中斷可能會改變至少一些異常剪接亞型，并可能導致它們在肺癌細胞中的積累。
K700E是位于SF3B1 的HEAT-repeat區(qū)域常見的突變之一。如先前的研究所示，K700E熱點突變下調(diào)內(nèi)含子保留并上調(diào)替代3’剪接位點事件。除了外顯子跳躍，較受影響的是內(nèi)含子保留。這個結(jié)果和預期一致，因為它被認為會對SF3B1產(chǎn)生相反的結(jié)果。其他3’剪接位點事件沒有受到顯著影響，這并不總是與之前的結(jié)果一致，這表明其他細胞環(huán)境也起作用。
Fig. 3
4. 異常轉(zhuǎn)錄本作為產(chǎn)生新抗原的潛在模板
據(jù)報道，腫瘤中積累的異常剪接轉(zhuǎn)錄本可能是新抗原的來源。為了研究檢測到的轉(zhuǎn)錄本是否可以作為新抗原，作者試圖分析由這些異常剪接轉(zhuǎn)錄本編碼的異常肽的潛在抗原性。在多肽方面，通過考慮所有可能的 9-mer肽的全長轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)，推導出轉(zhuǎn)錄本的改變的多肽序列。事實上，異常剪接轉(zhuǎn)錄本通過引起移碼或翻譯的早期終止而頻繁而劇烈地改變蛋白質(zhì)序列。這些新抗原在大多數(shù)細胞系中占總潛在新抗原的*大比例(圖4a)，異常剪接轉(zhuǎn)錄本和移碼突變導致了更多新多肽的產(chǎn)生(圖4b)。正如預期的那樣，被NetMHC預測為“強結(jié)合物”的新抗原的數(shù)量在剪接轉(zhuǎn)錄本和移碼突變中也更多(圖4c)。在對來自每種肽的*高NetMHC比較中，來自那些異常亞型的肽顯示出比通常使用TMB檢測方法鑒定的錯義和內(nèi)突變的多肽更高的評分分布(圖4d)。
為了從實驗上驗證異常的轉(zhuǎn)錄本是否被翻譯成蛋白質(zhì)，對11種細胞系(A427、A549、H1650、H2228、II-18、PC-9、RERF-LC-Ad1、RERF-LC-Ad2、RERF-LC-KJ、RERF-LC-MS和VMRC-LCD)采用了使用液相色譜結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜(LC/MS/MS)對于多肽識別，作者基于每個細胞系的MinION數(shù)據(jù)定制了肽序列數(shù)據(jù)庫。如前所述，普通轉(zhuǎn)錄組測序由于其測序能力，顯示出比LC/MS/MS蛋白質(zhì)組學更高的基因覆蓋率。通過液相色譜/質(zhì)譜/蛋白質(zhì)組學檢測的每個基因的肽數(shù)與通過轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)計算的TPM相關(r= 0.52，圖4e)而且LC/MS/MS蛋白質(zhì)組學檢測到的大部分基因也被轉(zhuǎn)錄組測序覆蓋(圖4f)。作者成功地檢測到7個翻譯自異常剪接亞型特異性區(qū)域的多肽。例如，衍生自外顯子3中具有選擇性5’剪接的轉(zhuǎn)錄本的多肽KRT7存在于RERF-LC-Ad1(圖4g)。在GENCODE數(shù)據(jù)庫中沒有發(fā)現(xiàn)這種轉(zhuǎn)錄本，但是在ENST00000547613中觀察到了這種同中型特異性連接，其被認為是處理過的轉(zhuǎn)錄本。MinION也證實了在H1437、H2126和II-18中的表達(表1).此外，這種轉(zhuǎn)錄本有可能產(chǎn)生幾個新抗原，這些新抗原是由NetMHC預測的。這些結(jié)果表明，一些異常剪接亞型被真正翻譯成肽，并可能在癌癥中產(chǎn)生新抗原中發(fā)揮作用。
Fig. 4
5.肺癌標本中的異常剪接異構(gòu)體
為了檢查體內(nèi)癌細胞中是否也存在異常剪接轉(zhuǎn)錄本，作者接下來分析了臨床肺癌標本。應用與臨床樣本細胞系分析相同的分析方案，能夠識別每個患者的異常剪接亞型(圖5a)。作者選擇了在腫瘤樣本中表達水平比非腫瘤樣本高至少兩倍的轉(zhuǎn)錄本(圖5b)在所有臨床樣本中鑒定出982種富含癌癥的剪接亞型。其中，448種亞型在參考序列或基因代碼。異常亞型的數(shù)量和TMB之間沒有顯著的相關性(圖5c)。作為檢測到的轉(zhuǎn)錄本的一個例子，在SMOC2如圖1所示5d和僅在病例3的腫瘤中表達。類似于細胞系分析的結(jié)果，作者可以識別獨立剪接事件的幾種獨特組合模式，這些模式占這些未標記亞型的14.5%。還確定了保留在癌細胞中的潛在的NMD靶向亞型，這表明NMD機制在相應的癌癥中被破壞。值得注意的是，在病例3和4中，發(fā)現(xiàn)*大數(shù)量的潛在NMD靶向亞型在關鍵NMD因子中存在移碼或無義突變，UPF3B和SMG8(圖5a)。
與用于分析細胞系數(shù)據(jù)集的方法類似，進行了NetMHC分析以鑒定可能是潛在新抗原的多肽。為此，作者使用臨床樣本的基因組測序數(shù)據(jù)。作者在每個病例中檢測到101–255個新抗原候選物(圖5e)。作者發(fā)現(xiàn)，與來自錯義突變的多肽相比，來自剪接轉(zhuǎn)錄本的肽顯示出更高的分布分數(shù)(圖5f)。事實上，在大多數(shù)樣品中，它們占了總新抗原候選肽的大部分(圖5e)。這些結(jié)果支持了這樣一個事實，即臨床樣本中的異常剪接事件可以被MinION檢測到，并且比錯義突變更有可能產(chǎn)生更多的新抗原候選肽。
Fig. 5
6.對臨床樣本中異常剪接異構(gòu)體的評估
為了評估從異常剪接亞型和移碼突變中鑒定的肽的抗原性，作者根據(jù)圖6a所示的方案用候選肽免疫HLA-A24轉(zhuǎn)基因小鼠。作者根據(jù)人類白細胞抗原-α:24:02的網(wǎng)絡MHC評分選擇了17種候選肽(表2)。作者通過BLAST-P證實了該肽序列與人或小鼠蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的序列沒有相似性，最后一次接種疫苗一周后，作者從小鼠中分離出脾細胞，并對分離物進行酶聯(lián)免疫吸附斑點(ELISpot)分析。通過這樣做，作者試圖檢測新抗原特異性脾淋巴細胞反應。酶聯(lián)免疫吸附試驗結(jié)果顯示，17個多肽中有8個誘導顯著高的干擾素-γ產(chǎn)生(n= 2)與PBS組和單獨佐劑組相比(圖6b，c)。這些結(jié)果表明，來自剪接亞型和移碼突變的多肽可以通過與人類白細胞抗原的相互作用激活T細胞反應。
Fig. 6
結(jié)論
在這項研究中，作者指出腫瘤中全長轉(zhuǎn)錄組測序?qū)τ凇檀_識別被普通轉(zhuǎn)錄組測序忽略的異常轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)至關重要。異常剪接亞型顯示出在腫瘤中產(chǎn)生大量新抗原的巨大潛力。從全長轉(zhuǎn)錄組測序中獲得的這些新的轉(zhuǎn)錄本特征將有助于評估腫瘤免疫治療的結(jié)果，當與目前僅使用基因組突變的指標結(jié)合使用時，這可能會提高免疫治療應答預測的準確性。
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