NAFLD肝源性小細(xì)胞外囊泡通過傳遞novel-microRNA-7誘導(dǎo)冠狀微血管通透性增加

背景介紹

非酒精性脂肪肝（Non-alcoholic?fatty?liver?disease,?NAFLD）是最常見的慢性肝病。近期研究發(fā)現(xiàn)，在非酒精性脂肪肝患者中，冠脈微循環(huán)障礙（Coronary?microvascular?dysfunction,?CMD）較為常見，并且能夠獨立于非酒精性脂肪肝因素而預(yù)測主要心臟不良事件的發(fā)生，但鮮有報道用于預(yù)測CMD的疾病標(biāo)志物以及治療靶點。因此，開展NAFLD誘導(dǎo)冠狀動脈并發(fā)癥的機制研究具有重要意義。

材料方法

小鼠模型：C57BL/6N小鼠通過蛋氨酸膽堿缺陷飲食（MCD）和高脂肪飲食(HFD)構(gòu)建NAFLD模型

測序技術(shù)：miRNA高通量測序技術(shù)

主要結(jié)果

一、NAFLD小鼠冠狀動脈微血管的內(nèi)皮細(xì)胞通透性增強

為建立小鼠NAFLD模型，作者分別給雄性C57BL/6?N小鼠喂食MCD?4周或HFD?16周。結(jié)果顯示，MCD飲食和HFD喂食均誘導(dǎo)了NAFLD拌嚴(yán)重肝臟脂肪變性的預(yù)期特征（圖1A）。肝內(nèi)甘油三酯積累（圖1A、B）、肝-腎比的升高（圖1A、C）、轉(zhuǎn)氨酶活性升高（圖1D、E）。值得注意的是，小鼠喂食高脂膳食增加了體重和肝臟重量以及發(fā)展的血脂異常。相反，喂食MCD的小鼠不會出現(xiàn)與人類NAFLD相關(guān)的代謝綜合征。隨后，作者通過測量伊文思藍(lán)滲漏來估計MCD和HFD誘導(dǎo)的NAFLD小鼠冠狀動脈微血管的通透性變化。如圖1F所示，深藍(lán)色表示NAFLD小鼠的冠狀動脈微血管比對照組小鼠更具滲透性。此外，ZO-1/2與血管內(nèi)皮標(biāo)志物血友病因子(vWF)的相對熒光強度比顯示，MCD組和HFD組冠狀動脈微血管內(nèi)皮細(xì)胞中ZO-1/2的完整性均明顯降低。綜上所述，這些結(jié)果表明，在NAFLD期間，冠狀動脈微血管發(fā)生了內(nèi)皮屏障功能障礙，而這并不依賴于其代謝特征。

二、NLRP3炎癥小體介導(dǎo)NAFLD小鼠冠狀動脈微血管內(nèi)皮高通透性

為了探討NAFLD過程中微血管通透性變化的上游機制，作者利用GeneCards數(shù)據(jù)庫中的人類微血管高通透性靶點進(jìn)行GO和KEGG富集分析。GO富集的結(jié)果表明，細(xì)胞因子活性和細(xì)胞因子受體結(jié)合在微血管高通透性的發(fā)展中起重要作用。為了確定關(guān)鍵的介質(zhì)，作者從這兩個途徑中篩選出了共同的基因(圖2B)。KEGG通路富集結(jié)果表明，目的基因主要富集于Toll樣受體(TLR)信號通路、非酒精性脂肪肝和Nod樣受體(NLR)信號通路NLRP3是NLR家族中最重要的成員，需要TLR和NLR通路參與形成免疫酶體并介導(dǎo)IL-1β、IL-18和HMGB1的釋放。說明NLRP3免疫酶體參與微血管高通透性的形成。作者給NLRP3+/+和NLRP3-/-小鼠喂食MCD飲食或HFD。NAFLD小鼠冠狀動脈微血管內(nèi)皮中裂解半胱天冬酶-1和IL-1β的表達(dá)水平明顯升高，而NLRP3基因則明顯地改善了這些影響(圖2C、D)。此外，NLRP3-/-小鼠的心臟組織中IL-1β和HMGB1的含量也降低了。相應(yīng)地，通過NLRP3基因敲除，NAFLD小鼠的冠狀動脈微血管中ZO-1/2完整性和內(nèi)皮細(xì)胞高通透性的破壞在冠狀動脈微血管中顯著恢復(fù)(圖2E-H)。這些結(jié)果表明，NAFLD冠狀動脈的微血管內(nèi)皮屏障完整性的破壞是由NLRP3免疫酶體的激活介導(dǎo)的。

三、循環(huán)NAFLD肝源性外泌體誘導(dǎo)冠狀動脈微血管中NLRP3免疫酶體依賴性的內(nèi)皮細(xì)胞高通透性

為了探討肝臟外泌體在促進(jìn)微血管內(nèi)皮高通透性中的作用，作者對收集的外泌體通過WB分析檢測了HSP70、CD63和TSG101等典型標(biāo)志物的表達(dá)(圖3A-C)。兩種模型的肝臟外泌體的濃度和平均大小均無變化。然后，作者通過尾靜脈將DiR標(biāo)記的肝臟外泌體注射到小鼠體內(nèi)。12?小時后用活體光學(xué)成像系統(tǒng)觀察心臟、肺、肝、脾組織的熒光信號，發(fā)現(xiàn)肝臟外泌體通過循環(huán)到達(dá)心臟、肺、肝、脾。隨后，將從NAFLD小鼠或?qū)φ战M小鼠的肝組織衍生的外泌體注射到NLRP3+/+和NLRP3-/-小鼠中。結(jié)果顯示，MCD和HFD中肝源性外泌體均能誘導(dǎo)冠狀動脈微血管內(nèi)皮中caspase-1裂解和IL-1β的表達(dá)，而NLRP3基因的表達(dá)明顯逆轉(zhuǎn)了這些影響（圖3E、F）。此外，NAFLD肝源性外泌體增強了NLRP3+/+小鼠心臟HMGB1和IL-1β的含量，但對NLRP3-/-小鼠沒有增強。相應(yīng)地，NLRP3基因敲除恢復(fù)了循環(huán)NAFLD肝源性外泌體誘導(dǎo)的ZO-1/2損傷和微血管高通透性。這些體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，肝源性外泌體在NAFLD冠狀動脈微血管中的?NLRP3?炎癥小體依賴性內(nèi)皮高通透性中具有刺激作用。此外，循環(huán)NAFLD肝源性外泌體顯著誘導(dǎo)肺微血管高通透性，但是沒有改變肝組織和脾臟組織的通透性。

四、NAFLD肝源性外泌體通過激活組織蛋白酶B/NLRP3免疫激酶體軸誘導(dǎo)微血管內(nèi)皮細(xì)胞高通透性

作者進(jìn)一步通過微血管內(nèi)皮細(xì)胞通過體外實驗分析了肝臟外泌體的作用。作者將MVECs與DiI標(biāo)記的肝臟外泌體孵育8小時。結(jié)果表明，肝臟外泌體可被MVECs內(nèi)化，而這種缺陷被一種內(nèi)吞抑制劑明顯阻斷（圖4A）。Z-stack構(gòu)建的三維細(xì)胞模型顯示NAFLD肝源性外泌體的孵育促進(jìn)了caspase-1的裂解、IL-1β的成熟和HMGB1的釋放，但不影響NLRP3蛋白的表達(dá)（圖4B）。使用一種選擇性NLRP3免疫酶體抑制劑進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，進(jìn)一步證實NLRP3免疫酶體的激活（圖4C）.此外，NAFLD肝源性外泌體顯著降低了ZO-1/2的表達(dá)(圖4D)，增加了內(nèi)皮單層中FITC-葡聚糖分子的數(shù)量。作者通過轉(zhuǎn)染NLRP3?siRNA(siNLRP3)，進(jìn)一步驗證了NLRP3基因沉默的效果。與預(yù)期的一樣，siNLRP3顯著降低了caspase-1的活性，改善了微血管內(nèi)膜整體完整性。溶酶體膜通透性升高(LMP)誘導(dǎo)的溶酶體組織蛋白酶B逃逸和激活是NLRP3免疫酶體激活的一個重要機制。因此，作者用吖啶橙(AO)染色法檢測肝臟外泌體對LMP的影響，用魔紅(MR)染色法檢測組織蛋白酶B活性。結(jié)果表明，NAFLD肝臟外泌體可顯著促進(jìn)溶酶體通透性，誘導(dǎo)組織蛋白酶B滲漏。此外，特異性組織蛋白酶B抑制劑CA-074的存在顯著抑制了NLRP3免疫激酶體的激活(圖4G)，并改善了微血管內(nèi)皮細(xì)胞的高通透性(圖4H)。綜上所述，這些結(jié)果表明NAFLD肝源性外泌體顯著激活組織蛋白酶B/NLRP3免疫酶體軸，進(jìn)而促進(jìn)HMGB1的釋放，誘導(dǎo)微血管內(nèi)皮高滲能力。

五、NAFLD含有novel-miR-7肝源性外泌體觸發(fā)NLRP3免疫酶體相關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞高通透性

為了研究NAFLD肝源性外泌體如何誘導(dǎo)NLRP3免疫酶體相關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞高通透性，作者對來自MCS和MCDg的肝源性外泌體進(jìn)行了miRNA測序。10個具有最顯著的miRNAs，其中novel-miR-7的差異最顯著（圖5A）。novel-miR-7在NAFLD肝臟和血漿外泌體中顯著升高（圖5B、C）。此外，NAFLD肝臟外泌體的孵育導(dǎo)致MVECs中novel-miR-7的顯著表達(dá)。隨后，作者通過轉(zhuǎn)染novel-miR-7類似物來研究novel-miR-7對MVECs的影響。結(jié)果表示過表達(dá)novel-miR-7顯著促進(jìn)溶酶體通透性，增加組織蛋白酶B活性(圖5E、F)。在過表達(dá)novel-miR-7的細(xì)胞中，caspase-1的裂解、IL-1β的成熟和HMGB1的釋放的水平增加，而NLRP3的表達(dá)沒有變化(圖5G、H)。因此，novel-miR-7類似物顯著降低了ZO-1/2的表達(dá)（圖5G），并誘導(dǎo)了微血管內(nèi)皮細(xì)胞的高通透性（圖5I）。這些數(shù)據(jù)表明，novel-miR-7可以作為一個重要的肝臟外泌體標(biāo)志物。作者進(jìn)行了miRNA靶基因預(yù)測，發(fā)現(xiàn)LAMP1是noivel-miR-7的靶基因。LAMP1被稱為溶酶體膜糖蛋白，是調(diào)節(jié)LMP的關(guān)鍵。雙熒光素酶報告基因檢測的結(jié)果顯示，與pGL3-LAMP1-3’UTR質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后，熒光強度顯著降低(圖5J)。此外，noivel-miR-7類似物顯著降低了LAMP1蛋白的表達(dá)(圖5K)?？傊髡叩难芯拷Y(jié)果表明，noivel-miR-7直接靶向LAMP1的3’-UTR并誘導(dǎo)溶酶體通透性，進(jìn)而觸發(fā)組織蛋白酶B/NLRP3免疫激酶體軸，促進(jìn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞的高通透性。

六、novel-miR-7的基因抑制可改善NAFLD肝源性外泌體誘導(dǎo)的微血管內(nèi)皮高通透性

為了證實novel-miR-7在NAFLD過程中調(diào)節(jié)肝臟外泌體誘導(dǎo)的微血管內(nèi)皮通透性中的重要作用，作者用一種特殊的novel-miR-7抑制劑轉(zhuǎn)染MVECs，發(fā)現(xiàn)novel-miR-7基因抑制劑恢復(fù)了溶酶體滲透性并改善NAFLD肝臟外泌體誘導(dǎo)的組織蛋白酶B滲漏（圖6A、B）。與這些結(jié)果一致的是，novel-miR-7抑制劑顯著抑制了caspase-1的裂解、IL-1β的成熟和HMGB1的釋放(圖6C-G)。此外，抑制novel-miR-7顯著恢復(fù)了ZO-1/2的表達(dá)（圖6C、E），并改善了微血管內(nèi)皮細(xì)胞的高通透性（圖6H）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，novel-miR-7基因誘導(dǎo)能夠通過調(diào)節(jié)蛋白中和NAFLD肝誘導(dǎo)的微血管內(nèi)皮高通透性。作者還在體內(nèi)初步驗證了novel-miR-7抑制劑的治療效果。結(jié)果表明，novel-miR-7抑制劑不能改善代謝不良MCD飲食或HFD引起的代謝性紊亂和肝損傷，然而，novel-miR-7顯著降低心臟組織中IL-1β和HMGB1的含量，提示抑制NLRP3免疫酶活性和促炎癥細(xì)胞因子的釋放。此外，novel-miR-7顯著降低了心臟和肺的微血管高通透性，這表明novel-miR-7可能作為NAFLD微血管并發(fā)癥的潛在治療靶點。

七、脂肪變性肝細(xì)胞是novel-miR-7的重要來源

為了探索含有novel-miR-7的肝外泌體的來源，作者用100μmol/L棕櫚酸(PA)處理人肝細(xì)胞細(xì)胞系HepG2、Huh7和L0218h，誘導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的積累，但沒有導(dǎo)致細(xì)胞死亡。結(jié)果顯示，novel-miR-7在脂肪變性肝細(xì)胞來源的外泌體中顯著豐富(圖7A)。然后作者用novel-miR-7抑制劑或NC抑制劑轉(zhuǎn)染了人的微血管內(nèi)皮細(xì)胞系1(HMEC-1)，并用HepG2衍生的外泌體處理24小時。結(jié)果顯示，PA-sev導(dǎo)致的LAMP1/組織蛋白酶B/NLRP3免疫軸被novel-miR-7抑制劑明顯消除（圖7B-D）。此外，novel-miR-7抑制劑恢復(fù)了PA-sev誘導(dǎo)的緊密連接破壞和微血管內(nèi)皮高通透性(圖7B，E)。這些結(jié)果表明，脂肪變性肝細(xì)胞是含有novel-miR-7的肝外泌體的重要來源，脂肪變性肝細(xì)胞來源的外泌體能夠通過novel-miR-7促進(jìn)NLRP3免疫酶體依賴的微血管內(nèi)皮高通透性。

總結(jié)

在本研究中，作者通過大量結(jié)論表明在NAFLD期間，冠狀動脈微血管發(fā)生內(nèi)皮細(xì)胞的高通透性。肝內(nèi)脂質(zhì)水平的增強可誘導(dǎo)富含novel-miR-7的肝臟外泌體的分泌，通過調(diào)節(jié)LAMP1/組織蛋白酶B/NLRP3炎癥小體信號通路，促進(jìn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞的高通透性。此外，脂肪變性肝細(xì)胞是含有novel-miR-7外泌體的一個重要來源，而對novel-miR-7的基因抑制可以改善微血管內(nèi)皮屏障的完整性。本研究為肝臟-心臟間器官交流的具體機制帶來了新的見解，并證實novel-miR-7有潛力成為冠脈微血管損傷的疾病標(biāo)志物和治療靶點。

 

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