四川大學(xué)華西第二醫(yī)院陳路老師團(tuán)隊(duì)在《Scientific data》（6.444）在線發(fā)表了研究成果。該研究構(gòu)建了小鼠的長(zhǎng)期和短期造血干細(xì)胞(HSC)和多能祖細(xì)胞(MPP)在批量和單細(xì)胞水平上的短讀長(zhǎng)和長(zhǎng)讀長(zhǎng)RNA測(cè)序數(shù)據(jù)集，數(shù)據(jù)結(jié)果證明了整合短讀長(zhǎng)和長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序可以促進(jìn)已知和未注釋異構(gòu)體的識(shí)別和定量。本文為不同HSC細(xì)胞類型內(nèi)轉(zhuǎn)錄多樣性和異質(zhì)性的全面分析和比較研究提供了基礎(chǔ)。百邁客為該研究提供了ONT三代長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序服務(wù)。三代測(cè)序平臺(tái)的轉(zhuǎn)錄組研究，無需打斷，直接讀取反轉(zhuǎn)錄的全長(zhǎng)cDNA，能夠有效的獲取高質(zhì)量的單個(gè)RNA分子的全部序列，辨別二代測(cè)序無法識(shí)別的同源異構(gòu)體（isoform）、同源基因、超家族基因或等位基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本。ONT三代測(cè)序其優(yōu)點(diǎn)有通量更高、操作過程更簡(jiǎn)單、成本更低，主要應(yīng)用在基因組測(cè)序、甲基化研究、突變鑒定（SNP檢測(cè)）三個(gè)方面。
英文名稱：Short-read and long-read RNA sequencing of mouse hematopoietic stem cells at bulk and single-cell levels
中文名稱：在批量和單細(xì)胞水平上對(duì)小鼠造血干細(xì)胞進(jìn)行短讀長(zhǎng)和長(zhǎng)讀長(zhǎng)RNA測(cè)序
發(fā)表雜志：Scientific data
影響因子：6.444
發(fā)表時(shí)間：2021年11月
摘 要
造血干細(xì)胞(HSC)位于分化層次的頂端。盡管HSC及其直接下游的多能祖細(xì)胞(MPP)具有完全的多向分化能力，但只有長(zhǎng)期(LT-)HSC具有長(zhǎng)期自我更新的能力。隨著單細(xì)胞RNA測(cè)序和譜系追蹤技術(shù)的發(fā)展，HSC群體內(nèi)的異質(zhì)性逐漸得到承認(rèn)。轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控在控制HSC群體內(nèi)的分化和自我更新能力方面發(fā)揮著重要作用。
在這里本文報(bào)告了一個(gè)數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集包括小鼠長(zhǎng)期和短期HSC和MPP在批量和單細(xì)胞水平上的短讀長(zhǎng)和長(zhǎng)讀長(zhǎng)RNA測(cè)序。數(shù)據(jù)結(jié)果證明了整合短讀長(zhǎng)和長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序可以促進(jìn)已知和未注釋異構(gòu)體的識(shí)別和定量。因此，該數(shù)據(jù)集為不同HSC細(xì)胞類型內(nèi)轉(zhuǎn)錄多樣性和異質(zhì)性的全面和比較研究提供了基礎(chǔ)。
背景介紹
造血始于一群自我更新的造血干細(xì)胞 (HSC)，它們產(chǎn)生一系列越來越多的譜系定型祖細(xì)胞，最終產(chǎn)生各種類型的成熟血細(xì)胞。在傳統(tǒng)模型中，長(zhǎng)期(LT)HCS分化為短期(ST) HSC，隨后分化為多能祖細(xì)胞(MPP)。雖然這三個(gè)群體都具有完全的多向分化能力，但它們逐漸失去了自我更新能力。在HSC和MPP群體中都存在異質(zhì)性，具有明顯的譜系偏差。
轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控在平衡造血干細(xì)胞的結(jié)構(gòu)性和低水平周轉(zhuǎn)、下游分化和造血重建方面都是關(guān)鍵。在多細(xì)胞生物中，可變剪接是一種關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制，可以擴(kuò)大轉(zhuǎn)錄本的多樣性。越來越多的研究表明，在造血過程中，可變剪接模式是必不可少的。例如，在血液祖細(xì)胞或巨核細(xì)胞和紅細(xì)胞譜系中鑒定到的特異性可變剪接事件。研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)鍵造血調(diào)節(jié)因子(如HMGA2)的可變剪接模式影響了造血干細(xì)胞的分子鑒定。此外，異常AS是包括白血病等各種癌癥的標(biāo)志物。
利用短讀長(zhǎng)下一代測(cè)序(NGS)或長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序(如PacBio和Oxford Nanopore Technologies)的RNA測(cè)序，是解讀包括血細(xì)胞生成在內(nèi)的各種生物過程中的轉(zhuǎn)錄多樣性和調(diào)控機(jī)制的強(qiáng)大工具。雖然NGS在表達(dá)定量方面更可靠，但是短讀長(zhǎng)在AS事件中只能提供有限的信息。相比之下，長(zhǎng)讀長(zhǎng)的測(cè)序方法提供了一個(gè)獨(dú)特的機(jī)會(huì)，可以實(shí)現(xiàn)在提供全長(zhǎng)信息的基礎(chǔ)上檢測(cè)可變剪接異構(gòu)體。本文使用短讀長(zhǎng)和長(zhǎng)讀長(zhǎng)RNA測(cè)序，在批量和單細(xì)胞水平上對(duì)小鼠HSC和MPP進(jìn)行了全面的轉(zhuǎn)錄圖譜分析。
材料方法
樣本制備：8-9周的雌性成年C57BL/6 J 小鼠，從股骨和脛骨中分離骨髓細(xì)胞。首先使用小鼠造血干細(xì)胞分離試劑盒富集造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞(HSPC)。長(zhǎng)期(LT)和短期(ST)造血干細(xì)胞(HSC)和多能祖細(xì)胞(MPP)根據(jù)其表面標(biāo)志物進(jìn)行分選。對(duì)于單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)，將細(xì)胞單獨(dú)分選到含有裂解緩沖液的8條PCR管中。同時(shí)對(duì)于批量RNA-seq，分選100個(gè)細(xì)胞（P100）到一個(gè)PCR管中作為生物學(xué)重復(fù)。
實(shí)驗(yàn)方法：按照Smart-seq2實(shí)驗(yàn)流程構(gòu)建cDNA 文庫(kù)，基于Illumina平臺(tái)、Pacbio平臺(tái)和Oxford Nanopore Technologies（ONT）（百邁客協(xié)助完成該測(cè)序服務(wù)）平臺(tái)測(cè)序。
圖1?實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及樣本制備流程
技術(shù)驗(yàn)證
- ?短讀長(zhǎng) Illumina 測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)控
無論是單細(xì)胞(圖2a)還是批量細(xì)胞的水平上(圖3a)，在不同細(xì)胞類型的樣本中，每個(gè)堿基的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分布沒有顯著差異，并且兩個(gè)數(shù)據(jù)集的reads在整個(gè)基因體上幾乎均勻分布(圖2b, 3b)，表明RNA的高度完整性。進(jìn)一步檢查了reads被映射到的基因區(qū)域，發(fā)現(xiàn)所有樣本中被映射到外顯子區(qū)域的reads明顯增多，而被映射到內(nèi)含子區(qū)域的reads明顯減少(圖2c和圖3c)，與之前的報(bào)道結(jié)果一致。
對(duì)于單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)，還檢查了映射到線粒體和核糖體基因的reads的比例(圖2d)。每個(gè)細(xì)胞的線粒體基因和細(xì)胞核糖體基因的中位數(shù)百分比為0.29和3.04。MPP檢測(cè)到的基因數(shù)*高(圖2e)，顯著高于LT-HSC，而每個(gè)細(xì)胞的UMI數(shù)在三種細(xì)胞類型之間具有相似性(圖2f)。UMAP圖表明ST-HSC位于LT-HSC和MPP之間(圖2g)。接下來分析細(xì)胞類型之間的差異表達(dá)基因。LT-HSC、ST-HSC和MPP中分別有62、63和266個(gè)差異表達(dá)基因。此外一些已知的HSC特征基因，包括Mpl、c-Myc、Mllt3、Gata2，在LT-HSC中表達(dá)顯著增高(圖2h)。
圖2?單細(xì)胞短讀長(zhǎng)測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控
圖3?批量細(xì)胞的短讀長(zhǎng)測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)控
- 長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)控和一致性
納米孔（ONT）測(cè)序數(shù)據(jù)的平均長(zhǎng)度為1024 bp(圖4a)。而PacBio測(cè)序數(shù)據(jù)的平均長(zhǎng)度為946 bp(圖4)。PacBio測(cè)序的質(zhì)量得分高于納米孔測(cè)序(圖4b)，平均值分別為47.57和10.53。接下來比較了長(zhǎng)短讀長(zhǎng)測(cè)序在有無參考的情況下識(shí)別外顯子和轉(zhuǎn)錄本的√準(zhǔn)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論有無參考，長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序都能提供相對(duì)完整的外顯子鏈，包括轉(zhuǎn)錄水平上的新外顯子(圖4c,d)，而當(dāng)有參考時(shí)，短讀長(zhǎng)測(cè)序在識(shí)別外顯子方面有著更高的√準(zhǔn)性(圖4d)。
為了評(píng)估重復(fù)之間的一致性，計(jì)算了短讀長(zhǎng)和長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序之間的基因定量的相關(guān)性。相關(guān)系數(shù)均在0.93以上(圖4e)，表明重復(fù)樣本間具有較高的一致性。此外，PCA顯示短讀長(zhǎng)和長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序數(shù)據(jù)按細(xì)胞類型進(jìn)行了聚類(圖4f)。結(jié)果表明，長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量高，生物重復(fù)一致性高。此外，長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序能夠?qū)π碌耐怙@子和轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行識(shí)別和定量。
圖4?批量細(xì)胞長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)控
- 整體可變剪接模式分析
為了研究使用長(zhǎng)讀長(zhǎng)數(shù)據(jù)集的整體可變剪接模式，首先使用SUPPA2識(shí)別可變剪接事件和類型。有趣的是，在所有細(xì)胞類型中，常見的選擇性剪接類型是保留內(nèi)含子(RI)，其次是外顯子跳躍(SE)和可變3’或5’端剪接位點(diǎn)(圖5a)。接下來發(fā)現(xiàn)超過21762個(gè)細(xì)胞型特異性的可變剪接事件(圖5b)。SE是三個(gè)細(xì)胞類型中常見的可變剪接類型(圖5c)，其次是RI和可變3’或5’端剪接位點(diǎn)。這些結(jié)果表明，長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序有助于識(shí)別大量可能在造血過程中具有潛在功能的細(xì)胞特異性或共有的可變剪接事件。
圖5?批量細(xì)胞長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序數(shù)據(jù)的整體可變剪接分析
- 可變剪接異構(gòu)體的鑒定和定量
為了進(jìn)一步確認(rèn)長(zhǎng)讀長(zhǎng)在識(shí)別可變剪接異構(gòu)體方面的優(yōu)勢(shì)，使用納米孔和PacBio測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)三種細(xì)胞類型中已知的LT-HSC的標(biāo)志物c-Myc和Gata2(圖2h)的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了可視化。接下來篩選了所有映射到基因c-Myc和Gata2及其注釋的轉(zhuǎn)錄本上的reads。發(fā)現(xiàn)2915個(gè)reads覆蓋到了c-Myc，且LT-HSC的reads數(shù)*多(圖6a)。在納米孔和PacBio測(cè)序數(shù)據(jù)中可視化了全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的reads，發(fā)現(xiàn)所有注釋的亞型都能被鑒定識(shí)別(圖6c)。在c-Myc第一個(gè)外顯子中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)5 ‘的可變剪接起始位點(diǎn)。使用短讀長(zhǎng)測(cè)序數(shù)據(jù)來定量該基因座的剪接百分比(PSI),發(fā)現(xiàn)較長(zhǎng)的異構(gòu)體在所有三種細(xì)胞類型中具有相似的 PSI（剪接百分比），ST-HSC中包含第一個(gè)外顯子的較長(zhǎng)異構(gòu)體的reads占比比較高(圖6 e)。對(duì)于Gata2來說，發(fā)現(xiàn)覆蓋有595個(gè)reads，在LT-HSC中比其他兩種細(xì)胞類型多了近20倍的reads數(shù)(圖6b)。通過對(duì)比全長(zhǎng)reads和注釋的轉(zhuǎn)錄本，發(fā)現(xiàn)在LT-HSC中Ensembl的轉(zhuǎn)錄本中有一個(gè)未注釋的內(nèi)含子保留(圖6d)。隨后利用短讀長(zhǎng)測(cè)序數(shù)據(jù)驗(yàn)證驗(yàn)證了這種內(nèi)含子保留并定量這個(gè)內(nèi)含子的PSI值，發(fā)現(xiàn)該內(nèi)含子在LT-HSC中PSI值*高(圖6f)。接下來展示將長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序與單細(xì)胞RNA-seq結(jié)合的數(shù)據(jù)示例，從長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序數(shù)據(jù)中鑒定到了一個(gè)在Mpl中具有24 bp可變剪接區(qū)域的可5’剪接位點(diǎn)(A5)?；赟mart-seq2的測(cè)序數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)這個(gè)剪接事件在不同細(xì)胞類型中是差異的，其PSI值從LT-HSC，ST-HSC到MPP是依次遞減的(圖6g-j)。使用Smart-seq2數(shù)據(jù)可以觀察到單個(gè)細(xì)胞間的異質(zhì)性(圖6h)，在造血過程中，所涉及的長(zhǎng)和短剪接位點(diǎn)(SJ)是被顯著下調(diào)的(圖6i,j)。這些結(jié)果表明，整合短讀長(zhǎng)和長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序有助于識(shí)別差異表達(dá)的異構(gòu)體。
圖6?長(zhǎng)讀長(zhǎng)結(jié)合短讀長(zhǎng)數(shù)據(jù)識(shí)別定量可變剪接異構(gòu)體
測(cè)序數(shù)據(jù)集說明
大批量短讀長(zhǎng)RNA-seq可在各種組織或細(xì)胞樣本中用于√準(zhǔn)性的定量基因表達(dá)和替代外顯子使用。單細(xì)胞RNA測(cè)序在揭示細(xì)胞類型內(nèi)基因表達(dá)的異質(zhì)性方面是強(qiáng)而有力的。全長(zhǎng)RNA-seq實(shí)驗(yàn)流程，如Smart-seq2，也可以檢測(cè)可變剪接中的異質(zhì)性。然而，使用短讀長(zhǎng)測(cè)序來組裝轉(zhuǎn)錄本仍然很困難。
本文的測(cè)序數(shù)據(jù)集為揭示HSC群體中的轉(zhuǎn)錄本的多樣性提供了獨(dú)特的機(jī)會(huì)。通過整合短讀長(zhǎng)和長(zhǎng)讀長(zhǎng)的批量測(cè)序數(shù)據(jù)集，可以更好地識(shí)別和定量（新型）可變剪接異構(gòu)體。而scRNA-seq數(shù)據(jù)可以進(jìn)一步提供有關(guān)這些轉(zhuǎn)錄本如何在不同HSC細(xì)胞類型中變化的信息。此外，該數(shù)據(jù)集可用于開發(fā)統(tǒng)計(jì)模型以重建異構(gòu)體，并能夠進(jìn)一步在很大程度上研究未探索的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，例如單細(xì)胞水平的可變剪接和RNA編輯。
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