全長(zhǎng)微生物多樣性—醫(yī)學(xué)科研微生物研究精準(zhǔn)利器

細(xì)菌16S rRNA基因全長(zhǎng)約1,550個(gè)堿基對(duì)，由8個(gè)高度保守區(qū)和9個(gè)高變區(qū)(這些區(qū)域命名為V1至V9；圖1)組成。在進(jìn)行16S rRNA基因測(cè)序研究時(shí)，二代測(cè)序由于讀長(zhǎng)限制，往往使用通用引物擴(kuò)增一個(gè)或幾個(gè)高變區(qū)，而PacBio全長(zhǎng)16S測(cè)序能夠一次獲得V1-V9區(qū)9個(gè)高變區(qū)序列，從而個(gè)獲得更多信息，在種水平注釋具有重要優(yōu)勢(shì)。尤其中在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，全長(zhǎng)16S rRNA基因測(cè)序已得到廣泛運(yùn)用，其中包括人腸道菌群研究、皮膚、鼻腔、母乳、癌組織、宮腔、口腔等。

圖1.16S rRNA基因保守區(qū)和可變區(qū)的示例圖。

今天給大家分享3篇全長(zhǎng)微生物多樣性的研究案例，快來(lái)看看吧！

案例一

標(biāo)題：High-Level Acquisition of Maternal Oral Bacteria in Formula-Fed?Infant Oral Microbiota

譯名：配方奶喂養(yǎng)的嬰兒口腔微生物群中母體口腔細(xì)菌的高水平獲取[1]

期刊：mBio?[IF:7.867]

發(fā)表時(shí)間：2022年1月

研究方法：全長(zhǎng)16S rDNA測(cè)序

文章簡(jiǎn)介

背景：母體口腔微生物的大量涌入被認(rèn)為在嬰兒口腔微生物群的獲得和發(fā)育中起著重要作用。

方法：研究者收集了448對(duì)母嬰在4個(gè)月體檢時(shí)的舌拭子樣本，運(yùn)用PacBio的16S rRNA全長(zhǎng)基因單分子測(cè)序和擴(kuò)增序列變異(ASV)方法研究每個(gè)樣本的細(xì)菌組成。

結(jié)果：盡管嬰兒口腔微生物區(qū)系與母親口腔微生物群明顯不同，但與其親生母親共享的ASV的相對(duì)豐度中位數(shù)顯著高于與非親緣母親共享的ASV。這種共享豐度與嬰兒的喂養(yǎng)方式密切相關(guān)，而不是他們的分娩方式或抗生素暴露，配方奶喂養(yǎng)的嬰兒比純母乳喂養(yǎng)的嬰兒共享豐度更高。該研究提供了口腔細(xì)菌母嬰傳播的菌株水平證據(jù)，并表明在配方奶喂養(yǎng)的嬰兒中，母親口腔細(xì)菌的定殖率更高。

結(jié)論：通過(guò)全長(zhǎng)16S rRNA基因測(cè)序和ASV序列分析的方法觀察到母體口腔微生物群向嬰兒的傳播，配方奶喂養(yǎng)的嬰兒獲得母體口腔細(xì)菌的數(shù)量明顯較高。此外，區(qū)分嬰兒細(xì)菌的來(lái)源使嬰兒口腔微生物群的細(xì)菌組成評(píng)估具有更高的分辨率。這種新的信息和方法可以為進(jìn)一步研究口腔微生物群的發(fā)展奠定基礎(chǔ)，并最終可為建立新的預(yù)防和治療策略提供數(shù)據(jù)，運(yùn)用于控制口腔微生物群的細(xì)菌平衡和致病性。

(A)?基于BrayCurtis距離的母親和嬰兒樣本的PCoA圖。(B)優(yōu)勢(shì)OTU的平均相對(duì)豐度和共享指數(shù)。(C)母嬰配對(duì)(n=448)和無(wú)關(guān)母嬰配對(duì)(n=198,464)的Bray-Curtis距離的小提琴曲線圖。(D)每名嬰兒與親生母親(n=448)和與無(wú)親緣關(guān)系的母親(n=198,464)分享的ASV總相對(duì)豐度的小提琴曲線圖。(E，F(xiàn))與Veillonella dispar和?Streptococcus salivarius相對(duì)應(yīng)的ASV的分布。

案例二

標(biāo)題：Jia Wei Xiao Yao San ameliorates chronic stress-induced depression-like behaviors in mice by regulating the gut microbiome and brain metabolome in relation to purine metabolism

譯名：加味逍遙散通過(guò)調(diào)節(jié)與嘌呤代謝有關(guān)的腸道微生物組和腦代謝組改善慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁樣行為[2]

期刊：Phytomedicine??[IF: 5.340]

發(fā)表時(shí)間：2022年1月

研究方法：全長(zhǎng)16S rDNA測(cè)序、非靶向代謝組學(xué)、行為測(cè)試、免疫熒光染色、細(xì)胞因子的定量等

文章簡(jiǎn)介

背景：抑郁癥的發(fā)病機(jī)制很大程度上仍不清楚。越來(lái)越多的證據(jù)表明，腸道微生物群組成和腦功能之間存在著復(fù)雜的關(guān)系。加味逍遙散(JWXYS)被認(rèn)為是一種潛在的抗抑郁藥物，但其藥理作用機(jī)制尚未闡明。該文章探討了加味逍遙散散對(duì)慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的小鼠抑郁行為的影響。

方法：建立慢性束縛應(yīng)激抑郁小鼠模型。給予加味消炎散，通過(guò)多項(xiàng)行為學(xué)測(cè)試評(píng)價(jià)小鼠對(duì)治療的反應(yīng)。用特異性熒光標(biāo)記法檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的活性；對(duì)腸道和腦組織中的炎性細(xì)胞因子進(jìn)行定量。采用全長(zhǎng)16S rRNA測(cè)序和非靶向代謝組學(xué)相結(jié)合的方法，從物種水平上研究腸道微生物群、代謝腦功能和JWXYS之間的關(guān)系。

結(jié)果：發(fā)現(xiàn)行為癥狀與動(dòng)物乳桿菌(?L. animalis)的相對(duì)豐度有關(guān)。經(jīng)JWXYS處理后，描述了具有潛在參與嘌呤代謝的酶的Ileibacterium valens菌的相對(duì)豐度。星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的激活與動(dòng)物乳桿菌的相對(duì)豐度呈負(fù)相關(guān)。結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，在加味消炎散治療的基礎(chǔ)上預(yù)測(cè)的幾個(gè)靶點(diǎn)集中在嘌呤代謝上，嘌呤代謝也富含JWXYS調(diào)節(jié)的腦代謝物。

結(jié)論：動(dòng)物乳桿菌參與了小鼠的抑郁樣行為，加味消炎散可增加大腦嘌呤代謝相關(guān)酶的活性，并與杏仁核星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活呈正相關(guān)。

圖3.(A)不同群體的阿爾法多樣性指數(shù)(Chao1、PD_Whole_Tree.、Shannon、Simpson)的變化。(B)不同組樣本的beta多樣性指數(shù)(Bray-Curtis，未加權(quán)UniFrac)的特征。(C)基于對(duì)照組、模型組和JWXYM組之間的Lefse分析，確定腸道微生物組的潛在生物標(biāo)志物。

案例三

標(biāo)題：Evaluations and comparisons of microbial diversities in four types of?body fluids based on two 16S rRNA gene sequencing methods

譯名：基于兩種16S rRNA基因測(cè)序方法對(duì)四種體液微生物多樣性的評(píng)價(jià)與比較[3]

期刊：Forensic Science International ?[IF: 2.395]

發(fā)表時(shí)間：2021年11月

研究方法：全長(zhǎng)16S rDNA測(cè)序、二代16S rDNA測(cè)序

文章簡(jiǎn)介

背景：體液是犯罪現(xiàn)場(chǎng)常見(jiàn)的生物痕跡之一。了解這些生物痕跡的類型可以為法醫(yī)案件的調(diào)查提供關(guān)鍵線索。近年來(lái)，16S rRNA基因部分高變區(qū)測(cè)序和全長(zhǎng)16S rRNA基因測(cè)序引起了研究人員的興趣，

方法：采用二代16S rRNA基因V3-V4短讀長(zhǎng)測(cè)序和基于單分子實(shí)時(shí)測(cè)序的16S rRNA基因全長(zhǎng)測(cè)序，對(duì)唾液、外周血、陰道分泌物和月經(jīng)血中的微生物進(jìn)行分類。

結(jié)果：短讀長(zhǎng)測(cè)序的α多樣性指數(shù)大于全長(zhǎng)測(cè)序。兩個(gè)平臺(tái)采集的4種體液中細(xì)菌類群水平相似，但豐度不同。主坐標(biāo)分析和分子方差分析結(jié)果表明，陰道分泌物和經(jīng)血的微生物組成相似，唾液、外周血、陰道分泌物和經(jīng)血的微生物組成有顯著差異。線性判別分析表明，四種體液中篩選出的差異細(xì)菌在兩種測(cè)序結(jié)果中存在差異。兩種測(cè)序方法均可用于檢測(cè)4種不同體液中的細(xì)菌多樣性，為微生物鑒定4種體液提供了潛在的工具，其中全長(zhǎng)測(cè)序能提供更準(zhǔn)確的分類。

圖4.屬水平上四種體液細(xì)菌豐度柱狀圖。

全長(zhǎng)微生物多樣性研究現(xiàn)狀

根據(jù)PubMed檢索結(jié)果，我們可以看到運(yùn)用全長(zhǎng)微生物多樣性發(fā)表的文章逐年遞增。一方面隨著測(cè)序技術(shù)也越來(lái)越成熟；另一方面PacBio sequel II通量的提升使得研究成本大幅降低，全球越來(lái)越多的研究學(xué)者開(kāi)始采用全長(zhǎng)微生物多樣性測(cè)序來(lái)進(jìn)行微生物組學(xué)研究。

全長(zhǎng)微生物多樣性優(yōu)勢(shì)一：數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性高

PB全長(zhǎng)多樣性測(cè)序基于HIFI模式對(duì)單一片段進(jìn)行多輪測(cè)序的方式來(lái)提升準(zhǔn)確性。由于PacBio的原始錯(cuò)誤為隨機(jī)錯(cuò)誤，可通過(guò)獲取CCS（Circular Consensus Sequencing）進(jìn)行自身糾正來(lái)提升數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

 

細(xì)菌16S全長(zhǎng)約1.5Kb，目前PacBio Sequel II測(cè)序平臺(tái)平均酶讀長(zhǎng)可以達(dá)到70 Kb，當(dāng)測(cè)序酶讀長(zhǎng)達(dá)到?8Kb時(shí)，就可以滿足一條1.5Kb的16S全長(zhǎng)糾錯(cuò)5次，同一片段測(cè)序?5?次后，單一Read的準(zhǔn)確性至少達(dá)到Q20（99%）

全長(zhǎng)微生物多樣性優(yōu)勢(shì)二：種水平注釋率高

運(yùn)用三代測(cè)序，可以輕松跨越V1-V9區(qū)，進(jìn)而獲得全長(zhǎng)序列，序列中攜帶的特征信息更多，可以支持“種”水平的分辨率，在文章撰寫中可在種水平進(jìn)行深入挖掘和討論，尤其是在biomarker的尋找。常規(guī)樣本平均種水平注釋率可達(dá)60%。

全長(zhǎng)微生物多樣性優(yōu)勢(shì)三：群落結(jié)構(gòu)更準(zhǔn)

不同物種不同高變區(qū)的變異程度不同，部分高變區(qū)研究可能嚴(yán)重低估或者高估群落中微生物的多樣性，不同高變區(qū)短讀長(zhǎng)擴(kuò)增子的PCR引物選擇會(huì)影響推斷的群落準(zhǔn)確性和某些細(xì)菌類群的敏感性，使得微生物組研究很難在全局水平上進(jìn)行比較；全長(zhǎng)微生物多樣性一次獲得全部保守區(qū)和高變區(qū)序列，能夠精準(zhǔn)還原微生物群落結(jié)構(gòu)。

橫軸表示物種，縱軸表示豐度，黑色柱子表示全長(zhǎng)16S鑒定準(zhǔn)確而V4區(qū)測(cè)序失真；白色柱子表示V4區(qū)鑒定準(zhǔn)確而全長(zhǎng)16S結(jié)果失真，對(duì)比可以看出，全長(zhǎng)16S的覆蓋度和準(zhǔn)確度更高。E Singer et al.?ISME J

 

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