英文名:?Integrated transcriptome, proteome and?physiology analysis of Epinephelus coioides after?exposure to copper nanoparticles or copper?sulfate
雜志：Nanotoxicology，2017
影響因子：6.248
研究背景
近年來，納米銅粒子(cu-nps)在日常消費品以及電子、醫(yī)療、生物科學(xué)等行業(yè)中的應(yīng)用隨著納米技術(shù)的迅速發(fā)展而不斷增加。盡管預(yù)計納米技術(shù)產(chǎn)品的范圍擴大將帶來明顯的好處，但對其在海洋環(huán)境中的影響及其與水生生物群的可能相互作用的了解并不多。銅納米粒子可在水生生物中積累，并轉(zhuǎn)移到更高的營養(yǎng)水平，對動物和人類健康構(gòu)成危害。常規(guī)生物標志物（例如抗氧化酶，脂質(zhì)過氧化，金屬硫蛋白，DNA損傷）被證明是敏感的評估Cu-NPs毒性作用的指標。盡管如此，可能有更多的特定基因和蛋白質(zhì)可有效評估納米顆粒特異性生物反應(yīng)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用于納米毒理學(xué)可能有助于了解不同類型Cu污染物在水生生物中的主要毒性機制和作用模式，并幫助確定納米顆粒暴露和影響的新穎和無偏見的生物標志物。轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組可能提供了一個洞察分子機制潛在Cu誘導(dǎo)魚類反應(yīng)，并且可能是一種有效的方法識別新蛋白質(zhì)以及評估生態(tài)風(fēng)險。
Epinephelus coioides（橙斑石斑魚），一種原生型雌雄同體的海洋魚類，在中國廣泛流行，因為其優(yōu)良的肉質(zhì)使其具有很高的商業(yè)價值。目前，E. coioides主要在漂浮網(wǎng)箱養(yǎng)殖，在自然環(huán)境中很容易就可以受環(huán)境污染影響。本研究結(jié)合生理分析，轉(zhuǎn)錄組和蛋白組分析研究納米銅或硫酸銅暴露下石斑魚體內(nèi)蛋白及基因的差異變化。
材料和方法
取樣部位為魚肝臟，主要進行轉(zhuǎn)錄組學(xué)，蛋白組學(xué)（iTRAQ）及生理實驗
- 粒子表征分析
將納米顆粒分散在超純水，制備出含1.0 g Cu-1的銅離子溶液。用透射電鏡(tem，jeol jem-2100，日本東京)和納米粒子追蹤分析(nta，Nanosight lm 10)對其粒徑進行表征研究。
- 實驗處理及死亡率評估：
石斑魚被暴露在不同濃度(1.6，1.6，2.4，3.7，5.8或9.0毫克的cu l 1)的cu-np中。這些濃度是根據(jù)初步實驗選擇確定。在暴露期間，魚不被喂食，死魚被移除。急性暴露時間持續(xù)24小時，并在結(jié)束時評估魚的死亡率。
- 取樣：
用1毫升肝素化注射器從尾靜脈抽取血液進行生化分析，取出肝臟，用生理鹽水(鹽度8.6‰w/v，4c)清洗和沖洗脂肪，然后立即將肝臟冷凍在液氮中進行后續(xù)分析（蛋白組和轉(zhuǎn)錄組分析）。為便于組織學(xué)觀察，分別從每個復(fù)制的剩余魚中提取肝臟(左葉)樣本，并在10%v/v緩沖液中固定。
- 脂肪含量和脂肪酸組成分析通過GC/MS進行檢測。
研究結(jié)果
1、Cu-NPS的特性
Cu-NPS呈顆粒狀，呈團聚狀，海水中的平均粒徑(205±83 nm)大于實驗主要的粒徑(95±30 nm)。（見下表）
24小時后，Cu-NPs在海水中釋放后可溶性Cu為0.02毫克Cu L 1（Cu的初始質(zhì)量的0.83％），（補充材料，圖S1）。X射線衍射表明Cu在海水中24小時后被氧化。
2、存活率和組織學(xué)觀察
暴露于cu-nps或硫酸銅可導(dǎo)致石斑魚存活率呈濃度依賴性下降。cu-nps處理下LC 50值為4.8 mg cu l -1，硫酸銅為5.8 mg cu l -1?(圖1(A))。在cu-nps濃度為2.4 mg cu l -1下使死亡率達到20%，驗證了圖1(A)所建立的模型。
組織學(xué)觀察顯示正常肝竇和血管系統(tǒng)正常，而Cu-NPS或硫酸銅處理的魚肝則顯示靜脈內(nèi)有血細胞沉積和竇擴張，竇變不規(guī)則(圖1(B))，Cu-NPS組的肝損傷大于CUO 4組。
3、差異比較分析
分別與對照組比較后，在cu-nps和硫酸銅處理鑒定出差異表達的基因/蛋白。在cu-nps和cu-nps處理中，分別鑒定出1428和2239個表達差異顯著的基因，其中911個基因在這兩個處理中都很常見(圖2(A))，總共有354和140個顯著變化的蛋白質(zhì)，其中75種蛋白質(zhì)共同存在于這兩種處理中(圖2(B))。
4、基因和蛋白基于GO的功能分析
對差異表達的基因和蛋白質(zhì)的功能進行了分類。共有11417個轉(zhuǎn)錄本和3210種蛋白質(zhì)被分為三大類：生物學(xué)過程、細胞成分和分子功能(圖3)。28788個GO被注釋到11417個映射的轉(zhuǎn)錄本，10506個GO注釋到3210個蛋白質(zhì)中。參與“細胞過程”和“代謝過程”的基因和蛋白質(zhì)是生物學(xué)過程中較大的兩類，分別占轉(zhuǎn)錄本的20.4%和15.0%，以及14.8%和13.4%的蛋白質(zhì)。在細胞成分類別中，基因和蛋白質(zhì)涉及“細胞”(27.8%份轉(zhuǎn)錄本和20.7%份蛋白質(zhì))、“細胞部分”(27.8%份轉(zhuǎn)錄本和20.7%份蛋白質(zhì))和“細胞器”(19.2%份轉(zhuǎn)錄本)。在分子功能類別中，“結(jié)合”占49.6%個基因和46.2%個蛋白質(zhì)，30.2%個轉(zhuǎn)錄本和36.1%個蛋白質(zhì)具有“催化活性”(圖3(C))。
5、COG功能分類
3294個蛋白及11619轉(zhuǎn)錄本被功能注釋到(圖4)。這些轉(zhuǎn)錄本和蛋白質(zhì)分別分布在25和24個COG類別中，其中“僅一般功能預(yù)測”是轉(zhuǎn)錄本的較大組(總共1732個)和蛋白質(zhì)(630)，之后是“信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制”，“翻譯后修飾、蛋白質(zhì)翻轉(zhuǎn)、伴侶”、“功能未知”、“轉(zhuǎn)錄”、“細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運、分泌和囊泡轉(zhuǎn)運”、“細胞骨架”和“RNA加工和修飾”。在“脂質(zhì)轉(zhuǎn)運和代謝”這類中轉(zhuǎn)錄本3.2%（總共372個）和蛋白質(zhì)4.6%（153）
6、RNA與蛋白質(zhì)表達的相關(guān)性分析
用蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法獲得的差異表達蛋白與mRNA進行了比較分析；根據(jù)他們的氨基酸序列來匹配轉(zhuǎn)錄本，在Cu-NPs組與對照組及CuSO4和對照組相比較，分別共140（100%）和352（99.4%）個差異表達的蛋白。我們進一步確定在兩種銅粒子下蛋白和基因的表達是否一致，發(fā)現(xiàn)21的轉(zhuǎn)錄和蛋白在同一方向改變（13個上調(diào)，八個下調(diào)）（表2）。有趣的是，大多數(shù)基因（16個基因）的表達在Cu-NPS比CuSO4更強烈，但是蛋白質(zhì)卻相反。
7、肝臟脂質(zhì)含量和脂肪酸組成
與對照組相比，在兩種銅形式下，肝臟中脂類、甘油三酯和膽固醇含量均顯著降低，但兩種銅形式下相比無顯著性差異(P>0.05)。正常脂質(zhì)積累(紅色染色表明的脂滴)在對照組中明顯增加，而Cu-NPS或硫酸銅暴露則減少了脂滴的數(shù)量(圖5(D))，任何一種銅暴露均降低了總多不飽和脂肪酸，但總單不飽和脂肪酸和總飽和脂肪酸(Psfa)較對照組增加，而在Cu-NPS中，多不飽和脂肪酸(圖5(E))的作用更為明顯(圖5(E))。與對照相比，cu-nps或硫酸銅暴露后，脂肪酸、二十碳五烯酸(epa，c20：5)、二十二碳六烯酸(dha，c22：6)和二十二碳五烯酸(dpa，c22：5)均下降，而cu-nps中脂肪酸組分的含量比cu-nps明顯增加(圖5(F))。
文章亮點
- 石斑魚是一種具有較大經(jīng)濟效益的魚類本文研究其對兩種銅形式下的毒害機理有著非常重要的實際應(yīng)用價值。
- 表型數(shù)據(jù)豐富，文章分別從不同銅形式下的粒子表型特征，到不同銅濃度下魚死亡率，脂類物質(zhì)的測定，銅濃度的選擇進行研究及實驗設(shè)計，有理有據(jù)，層次清晰。
- 文章亮點在結(jié)合轉(zhuǎn)錄組及蛋白組數(shù)據(jù)聯(lián)合分析緊密與毒害的表型數(shù)據(jù)相結(jié)合，從DEGs的COG和KEGG注釋和富集分析的結(jié)果來解析毒害的分子機制。
京公網(wǎng)安備 11011302003368號