RNA樣品制備、測(cè)序及運(yùn)輸指南

TRIzol 裂解法：

離心收集的細(xì)胞迅速溶于 TRIzol 裂解，參考用量為每 5 X 10^6 個(gè)細(xì)胞加 1 mL TRIzol；細(xì)胞溶于 TRIzol 后，如出現(xiàn)成團(tuán)，需用吸頭將細(xì)胞團(tuán)吹打散，或者激烈震蕩混勻，使細(xì)胞完全溶于 TRIzol 中充分裂解，室溫靜置 5min，之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送。

液氮速凍法：

離心收集的細(xì)胞直接液氮速凍，速凍 2h 后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送。

2．懸浮細(xì)胞

一次 RNA 提取反應(yīng)所需細(xì)胞數(shù)≤1 X 10^7 個(gè)，以 3 X 10^6-1 X 10^7 個(gè)為宜，可以將細(xì)胞經(jīng)裂解液裂解后凍存運(yùn)輸。

1. 確定細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好；離心得到細(xì)胞沉淀（依據(jù)客戶實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過(guò)實(shí)而造成裂解液不能充分滲透，4 度離心機(jī)，轉(zhuǎn)速 3000g

為宜）；

2. 棄去培養(yǎng)基，加入 1 mlLPBS（RNase free，室溫），輕輕將細(xì)胞沉淀懸起， 轉(zhuǎn)移至 2mL 旋蓋尖底離心管（RNase free）中；

3. 離心（依據(jù)客戶實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過(guò)實(shí)而造成裂解液不能充分滲透，4 度離心機(jī)，轉(zhuǎn)速 3000g 為宜）得到細(xì)胞沉淀，棄去 PBS，液氮速凍 2h 之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送。

運(yùn)輸方式：干冰運(yùn)輸。

TRIzol 裂解法：

離心收集的細(xì)胞迅速溶于 TRIzol 裂解，參考用量為每 5 X 10^6 個(gè)細(xì)胞加 1 mL TRIzol；細(xì)胞溶于 TRIzol 后，如出現(xiàn)成團(tuán)，需用吸頭將細(xì)胞團(tuán)吹打散，或者激烈震蕩混勻，使細(xì)胞完全溶于 TRIzol 中充分裂解，室溫靜置 5min，之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送。

全血

1．PAXgene 血液 RNA 管：

用于從 PAXgene Blood RNA Tube 中收集的 2.5 ml 人全血中純化總 RNA。該過(guò)程很簡(jiǎn)單，可以使用手動(dòng)或自動(dòng)程序進(jìn)行。PAXgene Blood RNA Tubes 含有基于 RNA 穩(wěn)定技術(shù)的試劑組合物。該試劑組合物最大程度的保護(hù) RNA 分子降低被 RNase 的降解，并使基因表達(dá)的離體變化最小化。如果 PAXgene 血液 RNA 管為唯一的抽血管，則將血液抽入 PAXgene 血液 RNA 管之前應(yīng)先抽血入“廢棄管”內(nèi)，使抽血過(guò)程中所用的采血器內(nèi)能被預(yù)灌注；否則PAXgene 血液 RNA 管應(yīng)為抽血程序中的最后一只試管。確保血液已停止流入試管再?gòu)某轴樒魃先∠略嚬埽≒AXgene 血液 RNA 管內(nèi)的負(fù)壓設(shè)計(jì)可向管內(nèi)抽 2.5ml 的血）采血后，立即輕輕顛倒 PAXgene 血液 RNA 管 8-10 次，使添加劑和血液充分混合均勻。

將 PAXgene 血液 RNA 管豎直置于室溫（18-25℃）靜置 2-24 小時(shí)，之后可貯藏于-20℃或更低溫度；若試管要貯藏于低于-20℃的溫度，先在-20℃冷凍 24 小時(shí)，然后再將其轉(zhuǎn)移到-70℃或-80℃，可保存至少 50 個(gè)月。大體積干冰運(yùn)輸。

2．EDTA 管采集

要求為全血樣本，使用 EDTA 抗凝的采血管采集樣品（由于會(huì)影響后續(xù)建庫(kù)實(shí)驗(yàn)，禁止使用肝素抗凝），采集血液時(shí)，必須經(jīng)過(guò)抗凝，避免出現(xiàn)凝結(jié)成塊。新鮮采集好的抗凝血液，用移液器轉(zhuǎn)移到 2mL 離心管中，液氮速凍 2h，干冰寄送。注意：由于 EDTA 抗凝采血管大多為玻璃易碎材質(zhì)，切勿使用采血管原管寄送，以防采血管在運(yùn)輸轉(zhuǎn)移途中破裂，造成樣品污染、損失。（使用抗凝管采集好的抗凝血液用移液器吸取 500ul 轉(zhuǎn)移到 2mL 離心管中加入 1000ulTRIzol，振蕩儀振蕩 30-60s，室溫孵育 5min 后轉(zhuǎn)到-80 冰箱保存），每個(gè)樣本建議送兩管。

動(dòng)物組織（不含水產(chǎn)類、昆蟲(chóng)類）

1．液氮速凍法詳細(xì)流程：

1)提前準(zhǔn)備好冷凍組織的足量液氮，預(yù)裝樣品的凍存管，并在做好標(biāo)記（盡量不使用漢字命名，命名字符控制在 5 個(gè)以內(nèi)）

2)活體取下新鮮組織，立即剔除結(jié)締組織等非研究所需的組織類型。對(duì)腫瘤組織的取材，應(yīng)盡可能準(zhǔn)確地判定腫瘤和正常組織，腫瘤組織應(yīng)將周圍的正常組織切除干凈（正常組織也應(yīng)將周圍的腫瘤組織切除干凈），腸道組織一定要把內(nèi)容物清洗干凈；

3)迅速用預(yù)冷的 PBS 溶液（RNase free）或 0.9%生理鹽水將組織表面的殘留血液沖洗干凈

4)如果組織體積較大，將組織切成長(zhǎng)寬高均≤0.5 mm 的小塊（即黃豆大?。?/p>

5)將凍處理好的組織樣本混合均勻后保存于 2 mL 或更大體積的螺口凍存管（RNase free）中，標(biāo)注編號(hào)

5)立即（20s 內(nèi)）置于液氮中冷凍 3~4 h，然后轉(zhuǎn)移至-80 °C 長(zhǎng)期保存

6)干冰運(yùn)輸

2．TRIzol 法：

1) 如果使用 TRIzol 裂解液保存送樣，請(qǐng)務(wù)必先進(jìn)行液氮研磨破碎，樣品量取參考標(biāo)準(zhǔn)送樣量的 1/3，然后溶于 TRIzol 中，組織樣品切勿過(guò)量；

2) 震蕩混勻，常溫裂解 5 min 后，使用低溫離心機(jī) 12000g 離心 10min，將上清液轉(zhuǎn)至新的 2.0ml 離心管中（拍質(zhì)控照片，方便核查），轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，運(yùn)輸時(shí)選擇干冰寄送。

3．RNAlater? Tissue Collection 保護(hù)液法：

1、用 RNAlater? Solution 保存組織之前，需要將組織切割成長(zhǎng)寬高均≤ 0.5 mm 的小塊。

2、如果組織帶血液或其他體液，需要過(guò)夜后更換一次 RNAlater? Solution；不要將剛浸入RNAlater Solution 中的樣本立即冷凍，需將樣本置于 4 °C 保存過(guò)夜（使 Solution 充分浸潤(rùn)組織樣本），然后轉(zhuǎn)移至-20 °C 或-80 °C 長(zhǎng)期保存；

3、RNAlater? Solution 不會(huì)影響組織結(jié)構(gòu)，可以把已保存的組織從 RNAlater? Solution 中取出，切下實(shí)驗(yàn)所需的用量，把剩余的組織再放入到原來(lái)的保存液中繼續(xù)保存；

4、保存于 RNAlater? Solution 中樣本，-20 °C 存放時(shí)，樣本不會(huì)結(jié)凍，但可能會(huì)有晶體析出，這并不影響后續(xù)的 RNA 提取工作；-80 °C 存放時(shí)，樣本會(huì)結(jié)凍， 在進(jìn)行 RNA 提取前，需置于冰上融化再進(jìn)行后續(xù)操作，解凍后的樣本可再次放入-80 °C 保存；

5、一般來(lái)講，生物樣本保存于 RNAlater? Solution 中，37 °C 可存放 1 天，25 °C（室溫）可存放 1 周，4 °C 可存放 1 個(gè)月，-20 °C 或-80 °C 可長(zhǎng)期保存。但鑒于生物樣本的特殊性及實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性，建議所有保存于 RNAlater? Solution 中樣本，都要置于-20 °C 或-80 °C 長(zhǎng)期保存。

植物組織樣品制備指南（不含藻類）

較老組織 RNA 含量低，而且次生代謝物含量相對(duì)較高，用于 RNA 提取的成功率低。因此在不影響實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的前提下，須選擇健康、幼嫩的組織新鮮組織樣采樣流程如下：

1)提前準(zhǔn)備好冷凍組織的足量液氮，預(yù)裝樣品的凍存管，并在做好標(biāo)記（盡量不使用漢字命名，命名字符控制在 5 個(gè)以內(nèi)）

2)植物材料取材后用清水將材料表面的灰塵及泥土沖洗干凈，吸干表面水漬，再?gòu)闹参矬w上取下新鮮組織。注：如果是需要進(jìn)行處理，請(qǐng)?jiān)诨铙w上進(jìn)行處理后再取樣。

3)如果組織體積較大，將組織剪切成 50-100 mg 小塊,約黃豆大小的小塊,放入提前準(zhǔn)備好的凍存管中；

5)立即（20s 內(nèi)）置于液氮中冷凍 3~4 h，然后將單個(gè)樣本放于自封袋中，轉(zhuǎn)移至-80 °C 長(zhǎng)期保存；

運(yùn)送方式：干冰運(yùn)輸。

注：植物組織不建議使用組織保護(hù)液保存。對(duì)于一些需要?jiǎng)內(nèi)シN皮處理的，因樣品速凍后無(wú)法準(zhǔn)確剔除，如有需要?jiǎng)內(nèi)シN皮的老師須自行操作。

水產(chǎn)類樣品制備指南

水產(chǎn)類包括淡水魚(yú)類、海水魚(yú)類、貝類、藻類。送樣需要選擇新鮮采集的樣本，海水類物種需要進(jìn)行淡化處理。

取樣注意事項(xiàng)

優(yōu)先選用新鮮采集的樣品送樣，稀有樣本可酌情選取凍存組織。采集樣品時(shí)應(yīng)選取核酸含量較多的部位。樣品采集時(shí)建議活體取材后用預(yù)冷的 0.9%生理鹽水進(jìn)行漂洗，以去除血漬和污物，將樣品分割成 50 mg 左右的小塊（約黃豆大小，組織塊越小，保存效果越好），樣品分割和處理時(shí)應(yīng)盡量在冰上進(jìn)行，防止樣品降解。避免裝樣太滿以至凍裂，造成樣品污染。藻類樣本：大型藻類送樣量（干重）不少于 3g，單細(xì)胞藻類（干重）不少于 1g。注：水產(chǎn)類樣品需盡量保證為新鮮個(gè)體。盡量避免寄送保存時(shí)間較長(zhǎng)或經(jīng)過(guò)反復(fù)凍融的組織樣品。針對(duì)軟體動(dòng)物可先使用 75%的乙醇進(jìn)行漂洗，漂洗干凈后液氮冷凍，干冰運(yùn)輸；針對(duì)刺胞動(dòng)物，可去除頭部和腸道等部位，保留肌肉外壁用于提取。

昆蟲(chóng)類樣品制備指南

1）昆蟲(chóng)樣本，需進(jìn)行表面微生物的清洗，較大個(gè)體的選取不帶腸道部分的組織，對(duì)于較小個(gè)體只能用整個(gè)個(gè)體的，應(yīng)進(jìn)行適當(dāng)?shù)酿囸I處理（注意保證昆蟲(chóng)的活性）。

2)提前準(zhǔn)備好冷凍組織的足量液氮，預(yù)裝樣品的凍存管，并在做好標(biāo)記（盡量不使用漢字命名，命名字符控制在 5 個(gè)以內(nèi)）

3）個(gè)體大的，如毛毛蟲(chóng)，取得活體組織后，用清水清洗，以去除污物，吸干表面液體。將組織樣品分割成約 50 mg 的小塊（約黃豆大?。?，液氮速凍后，放入干凈的帶螺紋旋蓋保存管中；

4) 轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送。

注：小型昆蟲(chóng)組織務(wù)必在信息單中備注微量樣本需液氮交接防止降解。同時(shí)該類樣本因只滿足一次或低于常規(guī)一次提取用量，我們無(wú)法保證 100%提取合格。

微生物類樣品制備指南

（一）酵母菌

一次反應(yīng)所需酵母菌的量需≤1 X 10^7 個(gè)，以 5 X 10^6-1 X 10^7 個(gè)為宜。單次送樣量滿足 3 次以上提取，建議分裝送樣，每管滿足一次提取量，即 3 X 1 X 10^7 個(gè)。顯微鏡下觀察酵母菌生長(zhǎng)狀態(tài)，收集對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)旺盛的酵母菌將適量體積的酵母菌液轉(zhuǎn)移至將 2 mL 旋蓋尖底離心管（無(wú)菌，無(wú)核酸酶）中，于室溫下14000 X g 離心 1 min,棄盡培養(yǎng)基，將酵母細(xì)胞沉淀迅速置于液氮中冷凍 3~4 h，然后轉(zhuǎn)移至-80 °C 或液氮中長(zhǎng)期保存干冰運(yùn)輸。

（二）真菌

顯微鏡下觀察真菌生長(zhǎng)狀態(tài)，根據(jù)菌類的生長(zhǎng)規(guī)律，收集生長(zhǎng)旺盛的菌體。真菌樣本在進(jìn)行RNA 提取前，需要進(jìn)行稱重，一次反應(yīng)所需的真菌量為 50 ~100mg（由于不同真菌得率差異較大，所以建議送樣量盡量多或根據(jù)客戶經(jīng)驗(yàn)得率送滿足 3 次的量）真菌取樣方式以客戶實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)操作即可，要求取樣后到速凍前時(shí)間短，菌處于快速生長(zhǎng)的活躍期取樣后的真菌置于預(yù)冷的離心管或凍存管中，迅速置于液氮中冷凍 3~4 h，-80 °C 長(zhǎng)久保存干冰運(yùn)輸。

注：請(qǐng)勿直接寄送培養(yǎng)平板，低溫保鮮寄送的真菌培養(yǎng)平板，無(wú)法保證菌體的生長(zhǎng)狀態(tài)。為了提高真菌菌體 RNA 的提取成功率，應(yīng)將生長(zhǎng)旺盛的菌體收集到 2 mL 旋蓋尖底離心管（無(wú)菌，無(wú)核酸酶）中，迅速置于液氮中冷凍 3~4 h，然后轉(zhuǎn)移至-80℃或液氮中長(zhǎng)期保存。

樣品制備注意事項(xiàng)

核酸提取質(zhì)量與物種及組織部位、采集方法及保存狀態(tài)、提取方法及操作、實(shí)驗(yàn)器材及環(huán)境等因素均有密不可分的聯(lián)系，尤其是三代超長(zhǎng)提取對(duì)樣本的質(zhì)量、總量要求更高，望知悉及理解，并做好樣本備份。為了保障獲得高質(zhì)量的核酸，請(qǐng)務(wù)必按照送樣手冊(cè)所規(guī)定的準(zhǔn)備樣本。對(duì)珍貴樣本或者微量樣本，建議自行提取。

1) 組織速凍時(shí)間：組織離體后，胞內(nèi)核酸便開(kāi)始降解，尤其是 RNA，故采集時(shí)，目的組織離體后，需立即速凍，建議 3min 內(nèi)完成，越快越好。

2) 組織送樣量：建議送樣量適用于 95%的物種組織，少部分組織因胞內(nèi)核酸量較低，需適當(dāng)增加送樣量，比如動(dòng)物皮膚、毛發(fā)，植物果實(shí)、根等。請(qǐng)嚴(yán)格按照上方組織送樣量要求送樣，送樣量過(guò)少或過(guò)多均不利于提取實(shí)驗(yàn)。采樣量較少會(huì)導(dǎo)致提取的 RNA 總量、濃度不合格，采樣量過(guò)多反而會(huì)造成速凍不徹底、提取取樣困難、凍融降解等危險(xiǎn)。

3) 組織保存管的選擇：所有組織樣品務(wù)必使用離心管或螺紋管保存，切勿直接裝入密封袋（低溫凍脆易破裂，導(dǎo)致樣品泄露，交叉污染）保存。

4) 組織樣品保存方法選擇：首選液氮速凍；沒(méi)有液氮條件的，可直接放入-80℃冰箱凍存；環(huán)境條件限制的，可使用商組織保護(hù)液保存（這試劑對(duì)動(dòng)物組織可起到一定的效果，植物、菌類、細(xì)胞，微量樣品不可以使用），并嚴(yán)格按相應(yīng)試劑說(shuō)明操作。

5) 凍融組織： 組織凍存后，一旦凍融，RNA 降解概率大于 80%，幾乎不可能提取成功，此類組織不建議送樣。請(qǐng)各位老師送樣前注意組織保存狀態(tài)， 確保組織未發(fā)生過(guò)凍融情況。

6) 長(zhǎng)年保存的組織：保存時(shí)間超過(guò)一年的組織不建議送樣。

7) 組織分離要求：正常組織樣本中不能含有病變組織，而病變組織樣本中也不可以?shī)A帶有正常組織（如目的部位為葉片，就不能含有莖），提取實(shí)驗(yàn)時(shí)無(wú)法精確取樣，無(wú)法稱重。組織量過(guò)多的不能全部取樣，只隨機(jī)選取適量組織提取。

8) 對(duì)于同一個(gè)組織樣品需要同時(shí)提取 DNA 和 RNA 的，請(qǐng)務(wù)必分成兩管分批次送樣。

9) 樣本的特殊處理:樣本的特殊處理包括：鹽處理、溫度處理、藥物處理、病毒侵染、傷害處理、干旱處理等脅迫處理方式，不同程度的處理對(duì)樣本的 RNA 質(zhì)量會(huì)造成不同程度的影響，常見(jiàn)的會(huì)導(dǎo)致 RNA 的降解或者得率降低。因此，經(jīng)過(guò)特殊處理的樣本，在送樣時(shí)，務(wù)必請(qǐng)?jiān)跇颖拘畔沃羞M(jìn)行詳細(xì)的備注，以便盡量提高提取的成功率和避免樣本的浪費(fèi)。

核酸質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn)

常規(guī) RNA 質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn)

備注：

1、對(duì)于昆蟲(chóng)、軟體動(dòng)物等特殊物種，完整性檢測(cè)已基線為準(zhǔn)

2、以上均是單個(gè)文庫(kù)的總量要求，如果樣品做多個(gè)文庫(kù)按(小 RNA>LNCRNA>轉(zhuǎn)錄組 RNA)判。總量不足的文庫(kù)有樣品判 C 不通過(guò)，無(wú)不合格原因，根據(jù)二次提取的總量判定。無(wú)樣品根據(jù)剩余總量判判定下一文庫(kù)。

樣本制備不足、降解可能存在的風(fēng)險(xiǎn)

（一）總量不足或濃度過(guò)低存在風(fēng)險(xiǎn)

1) 文庫(kù)構(gòu)建失敗

2) 文庫(kù)產(chǎn)量低不能上機(jī)測(cè)序或測(cè)序數(shù)據(jù)量不足

3) 導(dǎo)致 RNA-seq 數(shù)據(jù)隨機(jī)性異常

（二）降解樣本

1) 建庫(kù)失敗

2) 導(dǎo)致 RNA-seq 數(shù)據(jù) duplication 比例高、隨機(jī)性差

3) 導(dǎo)致 Small RNA rRNA 比例高，影響有效數(shù)據(jù)，文庫(kù)片段異常

（三）目標(biāo) RNA 含量低

1) 總 RNA 達(dá)到要求，但由于樣本特異性，small RNA 含量低于正常樣本，導(dǎo)致建庫(kù)失敗

2) 總 RNA 達(dá)到要求，但由于處理或組織部位的特異性，mRNA 降解或含量低，導(dǎo)致建庫(kù)失敗或者測(cè)序數(shù)據(jù)中 rRNA 數(shù)據(jù)比例高

（四）蛋白或其他雜質(zhì)污染

1) 可能影響 Small RNA 電泳分離，造成切膠不準(zhǔn)，影響問(wèn)題質(zhì)量

2) 可能影響 RNA-seq 磁珠分離導(dǎo)致建庫(kù)失敗，或即使達(dá)到上機(jī)要求也可能導(dǎo)致文庫(kù)隨機(jī)性差等問(wèn)題