IF=19.8 | 中科院動(dòng)物研究所在Cell子刊發(fā)表重要研究成果

2024年7月30日，中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所在國(guó)際學(xué)術(shù)期刊Cell Stem Cell發(fā)表一項(xiàng)重要研究成果，題為：Acetyl-CoA metabolism maintains histone acetylation for syncytialization of human placental trophoblast stem cells。該研究通過表觀組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組和非靶向代謝組學(xué)分析研究了人胎盤中原發(fā)性CTBs和hTSCs向STBs分化過程中葡萄糖相關(guān)的代謝組學(xué)特征，并揭示了CTBs和hTSCs從高糖酵解到STBs基礎(chǔ)糖酵解水平的轉(zhuǎn)變。

文章標(biāo)題：Acetyl-CoA metabolism maintains histone acetylation for syncytialization of human placental trophoblast stem cells

期刊名稱：Cell Stem Cell

影響因子：19.8

合作單位：中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所

研究對(duì)象：人類妊娠早期胎盤樣本和人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞(hTSCs)

研究方法：轉(zhuǎn)錄組、表觀組學(xué)和非靶向代謝組學(xué)等

百邁客生物為該研究提供了轉(zhuǎn)錄組和非靶向代謝組檢測(cè)和分析服務(wù)。

研究背景

在妊娠期間，胎盤是連接母體和胎兒的重要瞬時(shí)器官，不斷向胎兒輸送氧氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝物，維持胎兒的正常生長(zhǎng)發(fā)育。胎盤發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的過程，包括胚泡期單層胚滋養(yǎng)外胚層(TE)向致密、多核、多細(xì)胞和多層器官的轉(zhuǎn)變。在懷孕期間，胎盤和胎兒的營(yíng)養(yǎng)分配對(duì)胎兒和母親的健康至關(guān)重要。然而，胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝和分配的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。

實(shí)驗(yàn)材料

從北京大學(xué)第三醫(yī)院(中國(guó)北京)治療性終止健康妊娠的6-8周的人正常絨毛組織收集。術(shù)后1小時(shí)內(nèi)，將組織浸泡在冰凍的DMEM/F12培養(yǎng)基中，進(jìn)行原代細(xì)胞分離或組織固定。從新鮮人絨毛組織中分離到原代滋養(yǎng)細(xì)胞(CTBs和STBs)。將人絨毛組織倒搖3分鐘，通過100mm和38mm篩子，收集38mm篩子上殘留的STB。將殘留在100毫米屏幕上的絨毛組織浸泡在PBS中，修剪成2-3毫米的組織。然后，用0.25%的胰蛋白酶和DNase消化絨毛組織，在4℃，并通過75毫米篩子。離心收集細(xì)胞，在1.25%和2.5%牛血清白蛋白(BSA)中沉淀得到細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞。

研究結(jié)果

1.組織學(xué)分析——糖酵解酶水平在合胞滋養(yǎng)細(xì)胞中顯著降低

妊娠期間，STB是一種重要的胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞，可介導(dǎo)代謝物交換，分泌多種激素，如人絨毛膜促性腺激素(hCG)、孕酮等。為了研究滋養(yǎng)細(xì)胞合胞過程中原代CTBs和STBs之間發(fā)生的代謝變化，該研究挖掘了之前人類妊娠早期胎盤的單細(xì)胞RNA測(cè)序(RNA-seq)數(shù)據(jù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在RNA水平上，原代CTBs中糖代謝和TCA循環(huán)的多個(gè)關(guān)鍵酶的表達(dá)高于STB。

通過免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色在孕早期人類胎盤絨毛組織中，證實(shí)了許多關(guān)鍵的糖酵解酶，包括己糖激酶2 (HK2)、磷酸果糖激酶、血小板型(PFKP)、磷酸果糖激酶、肝型(PFKL)和乳酸脫氫酶A (LDHA)，確實(shí)在CTBs中比體內(nèi)STBs更廣泛地表達(dá)(圖1A)。通過實(shí)時(shí)qPCR和免疫印跡(圖1B)繪制關(guān)鍵代謝酶的變化。結(jié)果顯示，糖酵解酶，包括己糖激酶1 (HK1)、HK2、PFKP、PFKL、丙酮酸激酶M1 (PKM1)、LDHA和乳酸脫氫酶B (LDHB)， CTBs均顯著高于STBs(圖1B和1C)。線粒體生物發(fā)生相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子PGC1a和細(xì)胞色素氧化酶(COX) IV在STBs中高表達(dá)，而糖原代謝酶肝糖原磷酸化酶(PYGL)和糖原1 (GYG1)在CTBs中高于STBs(圖1C)，與糖原的周期性酸-希夫(PAS)染色一致(圖1A)。在主要調(diào)控糖酵解酶的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路中，CTBs中蛋白激酶B (AKT)、核糖體蛋白S6 (S6)和真核翻譯起始因子4E (4EBP1)的磷酸化水平顯著高于STBs(圖1C左)。這些結(jié)果表明，糖酵解和糖原溶解的糖代謝途徑在合胞滋養(yǎng)細(xì)胞中顯著減少，而OxPhos水平基本保持不變。

2.代謝組學(xué)分析——滋養(yǎng)細(xì)胞合胞化伴隨著代謝的重構(gòu)

為了更詳細(xì)地驗(yàn)證CTBs和STBs之間的代謝差異，對(duì)妊娠早期胎盤中的原代CTBs和STBs進(jìn)行了代謝組學(xué)分析(圖2A)。相關(guān)熱圖、主成分分析(PCA)圖和代謝物豐度熱圖顯示，CTBs和STBs之間的代謝物存在顯著差異。CTBs中葡萄糖代謝相關(guān)代謝物豐度高，包括3-磷酸甘油酸(3-PG)、乳酸、丙酮酸、蘋果酸、a-酮戊二酸等。STBs中富含脂肪酸代謝和激素代謝相關(guān)產(chǎn)物，包括雌酮、膽固醇、亞油酸等(圖2B)。CTBs和STBs的前20位代謝物也有顯著差異。代謝物MSEA集富集分析(圖2C)和KEGG代謝物分析顯示CTBs主要富集于葡萄糖代謝和氨基酸代謝，包括Warburg效應(yīng)、色氨酸、甘氨酸和絲氨酸代謝、糖酵解等。相比之下，STBs主要富集脂肪酸代謝和類固醇激素合成相關(guān)通路，包括α -亞麻酸和亞油酸代謝、雌酮代謝、花生四烯酸代謝、類固醇生物合成等。

此外，將代謝組學(xué)結(jié)果與葡萄糖代謝的蛋白質(zhì)分析結(jié)果聯(lián)合分析(圖2D)。結(jié)果表明，CTBs和STBs代謝產(chǎn)物的變化與代謝酶蛋白的變化一致。CTBs的糖酵解代謝物、3-PG、丙酮酸和乳酸明顯高于STBs(圖2D)。CTBs中TCA循環(huán)中的檸檬酸、α-酮戊二酸和蘋果酸明顯高于STBs(圖2D)。相比之下，STBs體內(nèi)類固醇激素代謝的相關(guān)關(guān)鍵代謝物較高，這與STBs合成激素的特點(diǎn)相一致。綜上所述，CTBs和STBs之間的代謝程序存在明顯差異。在高度增殖和未分化的CTBs中，葡萄糖代謝和氨基酸代謝更為活躍，而在有絲分裂后和分化的STBs中，脂肪酸代謝和類固醇激素代謝更為活躍。

3.代謝組分析——葡萄糖代謝的基礎(chǔ)水平是滋養(yǎng)細(xì)胞合胞的必要條件

根據(jù)代謝組學(xué)和蛋白組學(xué)分析結(jié)果，葡萄糖代謝水平在合胞后急劇下降到基礎(chǔ)水平。許多研究表明，葡萄糖代謝的變化對(duì)決定干細(xì)胞的命運(yùn)和分化很重要，因此，研究推測(cè)糖代謝與滋養(yǎng)細(xì)胞合胞之間存在重要聯(lián)系。為了在體外微擾實(shí)驗(yàn)中模擬滋養(yǎng)細(xì)胞的合胞過程，該研究使用了hTSC培養(yǎng)和融合分化系統(tǒng)。再次檢測(cè)hTSCs在中誘導(dǎo)合胞前和合胞過程中相關(guān)代謝酶的蛋白和RNA水平。糖酵解的結(jié)論與原代CTBs和STBs的結(jié)果基本一致。

為了探索葡萄糖代謝對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞合胞過程的功能影響，該研究分別在未分化的hTSCs(在滋養(yǎng)細(xì)胞干細(xì)胞(TS)培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天，TS- d4)和分化的STB(在STB培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天，STB- d4)中使用HK抑制劑2-脫氧葡萄糖(2-DG)和LDH抑制劑oxamate抑制糖酵解的上游和下游速率限制步驟(圖3A)。由于糖代謝降低與STB分化相關(guān)(圖1、2)，研究者最初假設(shè)糖酵解抑制應(yīng)該促進(jìn)合胞化。但是結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未分化的hTSCs相比，僅保留基礎(chǔ)糖酵解水平的合胞hTSCs對(duì)糖酵解的減少比較敏感。

4.代謝組分析——糖酵解代謝產(chǎn)物的較佳水平促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞合胞

接下來(lái)，該研究使用糖酵解的關(guān)鍵代謝物，包括葡萄糖、丙酮酸和醋酸酯(用于補(bǔ)充細(xì)胞內(nèi)乙酰輔酶A)，來(lái)探索糖酵解代謝物對(duì)人滋養(yǎng)細(xì)胞合胞的影響。結(jié)果表明，隨著葡萄糖濃度的增加，從5到18 mM，STB-D4細(xì)胞中HCGB以及SDC1、ERVFRD1、ERVW1、GCM1、PSG4和CYP19A1的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，滋養(yǎng)細(xì)胞的合胞化程度逐漸增強(qiáng)(圖3D)。丙酮酸處理在未分化的hTSCs和正在合胞的hTSCs中導(dǎo)致了類似的反應(yīng)，即一定濃度范圍內(nèi)（10 mM）的代謝物增加了滋養(yǎng)細(xì)胞的合胞 (圖3E)。同樣，在一定濃度范圍內(nèi)，乙酸也顯著促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞合胞(圖3F)，在超高濃度下，HCGB、GCM1、PSG4和CYP19A1被顯著抑制(圖3)。特別指出，糖酵解藥物和中間體對(duì)HTSCs和STBs的合胞有特異性作用，但對(duì)未分化的htsc沒有特異性作用。因此，涉及STB特異性信號(hào)傳導(dǎo)，并且調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層合胞化可能需要較佳水平的基礎(chǔ)糖酵解物質(zhì)。

5.代謝組分析——乙?；拇x調(diào)節(jié)對(duì)合胞作用至關(guān)重要

實(shí)驗(yàn)表明，糖酵解產(chǎn)物顯著抑制hTSCs的合胞，而最佳水平的乙酸促進(jìn)hTSCs的合胞。為了反向確定最關(guān)鍵的糖酵解代謝物，該研究探索了最下游的糖酵解代謝物乙酰輔酶A(由乙酸補(bǔ)充)是否可以挽救糖酵解抑制對(duì)合胞的影響。結(jié)果顯示，在糖酵解抑制的情況下，乙酸能顯著恢復(fù)STB-D4中HCGB和SDC1的表達(dá)水平(圖4A-4C)。融合指數(shù)結(jié)果證實(shí)了合胞恢復(fù)以劑量依賴的方式(圖4D和4E)。然而，當(dāng)乙酸濃度過度增加到50 mM時(shí)，STBs細(xì)胞形態(tài)發(fā)生異常，引發(fā)細(xì)胞死亡，HCGB和SDC1基因表達(dá)無(wú)法檢測(cè)(圖4A)。因此使用10mM醋酸鹽用于所有其他實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)顯示，低濃度20 mM的草酸鹽對(duì)活死染色、線粒體膜電位、總蛋白、ADP/ATP比率和NAD+/NADH比率的影響不顯著或輕微，但通過靶向LC-MS/MS檢測(cè)，乙酰輔酶A顯著降低。10 mM醋酸鹽可使其乙酰輔酶A水平恢復(fù)正常。這些結(jié)果表明，乙酰輔酶A可能對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞的合胞作用很重要。

有報(bào)道稱，由于乙酰轉(zhuǎn)移酶具有較高的Km，細(xì)胞內(nèi)乙酰輔酶a可以作為蛋白質(zhì)乙?；牡孜锊⒅苯诱{(diào)控蛋白質(zhì)乙酰化，從而直接影響細(xì)胞的命運(yùn)。例如，組蛋白乙酰化的代謝調(diào)節(jié)對(duì)染色質(zhì)狀態(tài)轉(zhuǎn)變至關(guān)重要。為了廣泛調(diào)查蛋白質(zhì)乙?；淖兓?，該研究對(duì)乙酰賴氨酸進(jìn)行了免疫印跡特異性檢測(cè)。結(jié)果顯示，未分化hTSCs的乙酰賴氨酸水平對(duì)草酸鹽相對(duì)不敏感，對(duì)乙酸補(bǔ)充也不敏感，除了在- 55 kDa處可能代表乙酰微管蛋白的條帶(圖4F、4G)。相反，分化STBs的乙酰賴氨酸水平被草酸鹽顯著降低，并被乙酸鹽顯著恢復(fù)(圖4F和4G)。特別是，組蛋白(H3和H4, 10-15 kDa)乙?；瘜?duì)乙酸表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性反應(yīng)。因此，該研究檢測(cè)了乙酸鹽和草酸鹽處理的TS-D4和STB-D4細(xì)胞中乙酰基- h3和乙?；? h4k16的水平。結(jié)果顯示，草酸鹽對(duì)未分化hTSCs中H3和H4K16的乙酰化水平影響不大，但顯著抑制STB-D4中H3和H4K16的乙?；?圖4H、4I)。在草酸處理的細(xì)胞中分別添加5和10 mM乙酸時(shí)，H4K16乙酰化水平在劑量依賴性反應(yīng)中表現(xiàn)出最大的梯度，而H3乙酰化水平，包括H3K9/18/27乙?；?，在劑量依賴性反應(yīng)中表現(xiàn)出較平緩的梯度(圖4H、4I和SGM – s5p)。

綜上所述，該研究表明，適當(dāng)?shù)囊宜釢舛瓤梢跃徑馓墙徒庖种茖?duì)合胞的抑制。草酸鹽的糖酵解抑制降低了STBs糖酵解乙酰輔酶A的基礎(chǔ)產(chǎn)生，從而降低了滋養(yǎng)細(xì)胞合胞過程中組蛋白乙酰化的水平。因此，適當(dāng)補(bǔ)充乙酸可以恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)乙酰輔酶A的水平，從而恢復(fù)正常的蛋白質(zhì)乙?；?，特別是組蛋白H3和H4乙酰化，并恢復(fù)正常的滋養(yǎng)細(xì)胞合胞(圖4J)。因此，糖酵解乙酰輔酶A的基礎(chǔ)水平對(duì)于調(diào)節(jié)組蛋白乙?；蚳TSC合胞是至關(guān)重要的。

6.轉(zhuǎn)錄組分析——RNA-seq顯示糖酵解乙酰輔酶A代謝是促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞合胞程序所必需的

為了進(jìn)一步表征乙酸如何在滋養(yǎng)細(xì)胞合胞過程中恢復(fù)糖酵解抑制的作用，作者對(duì)經(jīng)草酸和乙酸處理的TS-D4和STB-D4細(xì)胞進(jìn)行了RNA測(cè)序(N = 8個(gè)樣本)。相關(guān)熱圖分析和主成分分析顯示，經(jīng)草酸和乙酸處理的未分化hTSCs的基因表達(dá)變化無(wú)明顯變化(圖5A)。然而，對(duì)于正常的STB-D4 (STB_c)，草酸處理(STB_ox)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄組發(fā)生劇烈變化，而5和10 mM乙酸處理(STB_oa5, STB_oa10)逐漸使轉(zhuǎn)錄組恢復(fù)正常(圖5A)。基因集富集分析(GSEA)進(jìn)一步證實(shí)未分化的hTSCs被富集用于糖酵解，而分化的STBs則被富集用于類固醇激素基因(圖5B)。這些轉(zhuǎn)錄組結(jié)果再次強(qiáng)調(diào)了未分化的hTSCs對(duì)草酸或乙酸鹽不敏感，而分化的STBs對(duì)草酸抑制和乙酸鹽拯救高度敏感。

根據(jù)翻轉(zhuǎn)圖(圖5C)，被草酸 (STB_ox)特異性下調(diào)但被乙酸(STB_oa5或STB_oa10)逆轉(zhuǎn)的基因表現(xiàn)出強(qiáng)烈的劑量依賴性。合胞化相關(guān)基因，包括SDC1、CGB同源物、ERVW1、ERVFRD1和GCM1，在草酸抑制的STB-D4中以劑量依賴的方式被5和10 mM乙酸部分恢復(fù)(圖5D)。

火山圖顯示，在STB_ox中，CGB同源基因、ERVFRD1、ERVW1、SDC1、CYP17A1等合胞程序基因顯著降低，而JUN、腫瘤壞死因子(TNF)、FAS、TP53等炎癥相關(guān)基因顯著上調(diào)。相反，補(bǔ)充乙酸導(dǎo)致SDC1、CGB同源物、ESRRB、CYP17A1、PSG11等合胞程序基因上調(diào)，表明STBs功能逐漸恢復(fù)。

接下來(lái)，研究者使用短時(shí)間序列表達(dá)挖掘(STEM)技術(shù)分析具有相同趨勢(shì)的基因簇。圖中顯示了胎盤cAMP信號(hào)、激素代謝和ERK/MAPK通路中一些已知的基因(圖5E)。

此外，GSEA進(jìn)一步顯示，與未分化的HTSC (TS_c)相比，STB_c中特異性富集了糖皮質(zhì)激素、激素生物合成、抗菌肽和胺源性激素等四個(gè)基因集(圖5F)。此外，與單獨(dú)處理STB_ox的STB_c和STB_d4 (STB_oa5和STB_oa10)相比，這四個(gè)基因組在同時(shí)處理的STB_c和STB_d4中也顯著富集。

綜上所述，這些結(jié)果表明糖酵解衍生的乙酰輔酶A對(duì)于滋養(yǎng)細(xì)胞合胞程序和STB核心功能的適當(dāng)激活是必要的。與hTSC程序相比，研究發(fā)現(xiàn)整個(gè)STBs分化程序?qū)μ墙徒庖阴］o酶A代謝異常敏感。

7.轉(zhuǎn)錄組分析——滋養(yǎng)細(xì)胞感知葡萄糖衍生的乙酰輔酶A的缺乏，從而在合胞過程中觸發(fā)代謝和炎癥應(yīng)激反應(yīng)

該研究將被乙酸拯救并下調(diào)的基因定義為“下調(diào)”。該集合包括三個(gè)集群，U17(145個(gè)基因)、U20(614個(gè)基因)和U18(288個(gè)基因)。這些基因都與細(xì)胞損傷和炎癥應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。其中許多是眾所周知的抗氧化、自噬、線粒體、DNA損傷和NF-kB特征中的基因(圖5G)。

GSEA進(jìn)一步顯示，與STB_c相比，未分化的TS_c特異性地富集了hippop – yap /Taz-TEAD特征(圖5H)。這些結(jié)果表明，草酸阻斷了STB的合胞，而這種分化阻斷被乙酸修復(fù)。此外，與正常STB_c和經(jīng)草酸和乙酸(STB_oa5和STB_oa10)處理的STB-D4相比，涉及DNA損傷、白素-6 (IL-6)信號(hào)、炎癥反應(yīng)和TNF信號(hào)的四種GSEA特征均在STB_ox中特異性富集(圖5I)。

綜上所述，在滋養(yǎng)細(xì)胞合胞過程中，葡萄糖衍生的乙酰輔酶A的基礎(chǔ)水平是防止代謝應(yīng)激和炎癥應(yīng)激反應(yīng)所必需的。研究發(fā)現(xiàn)STBs在分化和合胞過程中對(duì)糖酵解乙酰輔酶A應(yīng)激高度敏感，并引發(fā)炎癥反應(yīng)。

8.表觀組分析——組蛋白H3K9/18/27和H4K16乙酰化對(duì)葡萄糖的乙?；{(diào)控敏感，直接調(diào)控合胞化和代謝基因

鑒于滋養(yǎng)細(xì)胞可以感知葡萄糖衍生的乙酰輔酶A的缺乏，從而終止合胞程序并觸發(fā)代謝應(yīng)激誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)信號(hào)，研究者研究了組蛋白乙?；欠窨赡苁沁@種現(xiàn)象背后的機(jī)制之一。該研究使用靶下切割和標(biāo)記(CUT&Tag)技術(shù)，對(duì)TSCs、STB^-D1、STB^-D4、STB^-D4ox和STB^-D4-oa10樣品和acetyl-H3K9、acetyl-H3K18、acetyl-H3K27和acetyl-H4K16抗體的數(shù)據(jù)顯示，這四種組蛋白乙?；揎椩诤习^程中表現(xiàn)出明顯的變化。

此外，對(duì)于每個(gè)組蛋白修飾，在TSCs, STB^-D1和STB^-D4的基因啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行了Venn交叉分析。僅在STB組中發(fā)現(xiàn)的基因(TS組中沒有)被定義為STB^UP，表明這些基因啟動(dòng)子在合胞過程中具有相關(guān)的組蛋白乙?；揎?/strong>(圖6A-6D)。同樣，對(duì)STB^-D4、STB^-D4-ox和STB^-D4-oa10進(jìn)行了Venn交叉分析。僅在STB^-D4和STB^-D4-oa10中發(fā)現(xiàn)的基因被定義為STB^res，而在STB^-D4-ox中沒有發(fā)現(xiàn)，這表明這些基因啟動(dòng)子具有由糖酵解乙酰輔酶A代謝調(diào)節(jié)的組蛋白修飾(圖6A-6D)。所有四種組蛋白乙酰化的STB^UP組的交集被定義為STB^UP-all。同樣，所有四種組蛋白乙酰化的STB^res基團(tuán)的交集(圖6E)被定義為STB^res-all。

為了研究STB^UP-al中哪些基因?qū)习陵P(guān)重要，該研究交叉了STB^UP-all和STB^res-all數(shù)據(jù)集。確定了2834個(gè)基因位點(diǎn)，其中TSS上的這四個(gè)組蛋白乙?；稽c(diǎn)都被乙酸拯救并與合胞有關(guān)(圖6E)，包括眾所周知的合胞標(biāo)記SDC1、CGB和ERVFRD1(圖6I)。重要的是，已知CGB參與激素合成/分泌，與TSCs和STB^-D1相比，在STB^-D4中，CGB在其TSS啟動(dòng)子區(qū)域表現(xiàn)出顯著的乙酰- h3k27(圖6I)。GO和KEGG通路分析顯示，這些基因主要參與有絲分裂控制、合胞起始和STB功能，包括MAPK通路、cAMP通路、胎盤發(fā)育、激素合成/分泌、糖、氨基酸和脂肪酸運(yùn)輸(圖6G、6J-6L)。其中，已知CYP19A1參與激素合成/分泌，在STB^-D4的TSS啟動(dòng)子區(qū)域顯示顯著的乙酰- h3k27(圖6J)。胎盤發(fā)育的另一個(gè)關(guān)鍵基因GCM1在STB^-D1和STB^-D4的TSS啟動(dòng)子區(qū)域均顯示出顯著的乙酰- h3k9(圖6K)。cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白1 (CREB1)參與“cAMP應(yīng)答元件結(jié)合”，在STB^-D1和STB^-D4的TSS啟動(dòng)子區(qū)域表現(xiàn)出顯著的乙酰- h4k16(圖6L)。重要的是，草酸處理明顯導(dǎo)致所有這些基因的TSS啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白乙?；@著降低，而乙酸補(bǔ)充部分恢復(fù)了組蛋白乙?；?/strong>(圖6I-6L)。

為了探究被乙酸拯救的組蛋白乙?；欠褚矊?dǎo)致轉(zhuǎn)錄拯救，該研究比較了來(lái)自CUT&Tag的STB^res-all集與來(lái)自RNA-seq的拯救基因集(包括U5、U7和U8，共660個(gè)基因)。分析結(jié)果顯示，這兩個(gè)基因集共有323個(gè)基因(圖6F)，即表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄獲救。對(duì)這些表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄獲救的基因進(jìn)行GO和KEGG通路分析的結(jié)果與RNA-seq分析的結(jié)果相似，在cAMP和MAPK信號(hào)、激素合成/分泌以及其他合胞途徑中的跨膜物質(zhì)運(yùn)輸中都有顯著的富集(圖6H、6M、6N)。

值得注意的是，在“活性跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體活性”途徑中，草酸處理后，SLC30A3在其TSS啟動(dòng)子區(qū)域乙?；鵫3k18顯著降低，而乙酸補(bǔ)充能夠部分恢復(fù)其乙?；鵫3k18(圖6M)。在“類固醇激素應(yīng)答”途徑中，經(jīng)草酸鹽處理后，ESRRB在其TSS啟動(dòng)子區(qū)域乙酰h4k16顯著降低，部分被醋酸鹽挽救(圖6N)。

綜上所述，由乙酰輔酶A調(diào)節(jié)的組蛋白乙?；瘜?duì)于滋養(yǎng)細(xì)胞合胞程序和STB核心功能的適當(dāng)激活是必要的。與TS細(xì)胞對(duì)草酸和乙酸不敏感相比，研究發(fā)現(xiàn)STB分化程序?qū)σ阴］o酶A代謝異常敏感。

圖6-乙?；? h3k9、乙酰基- h3k18、乙?；? h3k27和乙?；? h4k16在TSC合胞過程中的動(dòng)態(tài)變化

9.轉(zhuǎn)錄組和表觀組分析——體內(nèi)短暫的糖酵解乙酰輔酶a缺乏會(huì)永久性地?fù)p害滋養(yǎng)細(xì)胞的合胞作用

人TSCs可以注射到免疫缺陷的NOD-SCID小鼠體內(nèi)，以評(píng)估其體內(nèi)分化潛力。因此，該研究使用這種異種移植模型來(lái)探索糖酵解乙酰輔酶A短暫缺乏對(duì)人滋養(yǎng)細(xì)胞體內(nèi)合胞的永久表觀遺傳影響。

小鼠皮下注射對(duì)照hTSCs (TS-ctrl)、氨基甲酸酯處理hTSCs (TS-ox)和氨基甲酸酯和醋酸酯短暫處理hTSCs (TS-oa10)。隨意喂養(yǎng)NOD-SCID小鼠生長(zhǎng)7天后，檢測(cè)血清hCG，并對(duì)移植的滋養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光和免疫組織化學(xué)染色，以確定體內(nèi)滋養(yǎng)細(xì)胞的合胞程度(圖7A)。然而，結(jié)果顯示STBs分泌到TS-ox小鼠血清中的hCG明顯低于TS – control小鼠(圖7B)。這與靶向數(shù)據(jù)一致，顯示在STB分化的第1天，乙酰輔酶A已經(jīng)開始上升，轉(zhuǎn)錄和表觀基因組數(shù)據(jù)顯示，STB分化的許多標(biāo)記已經(jīng)在第1天開始上升。因此，滋養(yǎng)層細(xì)胞在分化24小時(shí)內(nèi)就已經(jīng)進(jìn)入了STB的命運(yùn)，在滋養(yǎng)層分化的這個(gè)時(shí)間點(diǎn)干擾糖酵解代謝可能對(duì)細(xì)胞命運(yùn)產(chǎn)生不可逆的影響，但不影響細(xì)胞活力。

為了證明這一點(diǎn)，該研究對(duì)每個(gè)滋養(yǎng)細(xì)胞移植物進(jìn)行組織染色。用KRT7和CDH1鑒定滋養(yǎng)細(xì)胞，用SDC1和b-hCG鑒定哪些細(xì)胞是STB。結(jié)果顯示，TS- control小鼠的滋養(yǎng)細(xì)胞移植物在體內(nèi)能夠正常分化并形成多核STB(圖7C、7D)。然而，TS-ox小鼠體內(nèi)形成的多核STB較少，盡管草酸處理的細(xì)胞仍然可以存活并在免疫缺陷小鼠中生長(zhǎng)形成大的KRT7+/CDH1+移植物(圖7E, 7F)。

在TS-oa10小鼠中，多核STB的形成與TS – control小鼠相似，表明短暫的乙酸處理恢復(fù)了hTSCs的合胞能力(圖7G、7H)。此外，該研究計(jì)算了STB面積與移植物總面積的比值，結(jié)果表明，草酸處理的hTSCs在體內(nèi)的合胞能力永久性降低。與TS -ox組相比，TS-oa10組經(jīng)短暫乙酸處理后，體內(nèi)STBs面積完全恢復(fù)(圖7I和7J)。同時(shí)，與TS-ox組相比，STBs向TS-oa10小鼠血清中分泌的hCG也顯著增加(圖7B)。

RNA-seq結(jié)果表明，糖酵解乙酰輔酶A缺乏引起體外STBs的促炎應(yīng)激反應(yīng)。因此，該研究檢查了它們?cè)隗w內(nèi)的炎癥狀態(tài)。結(jié)果顯示，與TS – control小鼠和TS-oa10小鼠相比，TS-ox小鼠滋養(yǎng)細(xì)胞移植物周圍有更多的自然殺傷細(xì)胞(NK)細(xì)胞(天然細(xì)胞毒性觸發(fā)受體1,NCR1)和巨噬細(xì)胞(F4/80, CD163)募集。這些結(jié)果表明，由短暫的糖酵解缺陷引起的異常的促炎滋養(yǎng)細(xì)胞命運(yùn)可以通過醋酸處理永久地恢復(fù)。

鑒于人滋養(yǎng)細(xì)胞移植物在體內(nèi)不再暴露于草酸或乙酸，研究結(jié)果表明，由表觀遺傳決定的STBs分化潛力可能會(huì)因糖酵解乙酰輔酶A代謝的短暫缺乏而永久中斷，由此產(chǎn)生的異常的促炎滋養(yǎng)細(xì)胞可以通過短暫的醋酸補(bǔ)充而在功能上得到恢復(fù)。

研究總結(jié)

該研究通過代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)和表觀組學(xué)等技術(shù)，使用人類妊娠早期胎盤樣本和人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞(hTSCs)發(fā)現(xiàn)，葡萄糖代謝在hTSCs和細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞中高度活躍，但在合胞過程中，葡萄糖代謝降低到基礎(chǔ)水平，仍然是補(bǔ)充乙酰輔酶A和分化潛力所必需的。補(bǔ)充乙酸可以通過補(bǔ)充乙酰輔酶A和維持組蛋白乙?；瘉?lái)挽救糖酵解缺乏的合胞滋養(yǎng)細(xì)胞融合，從而挽救合胞基因的激活。即使是短暫的糖酵解缺乏也會(huì)永久性地抑制分化潛能和促進(jìn)炎癥，在體內(nèi)也可以通過短暫補(bǔ)充乙酸永久地挽救。這些結(jié)果表明，hTSCs在合胞過程中僅保留基礎(chǔ)糖酵解乙酰輔酶A代謝，通過營(yíng)養(yǎng)反應(yīng)性組蛋白乙?；{(diào)節(jié)細(xì)胞命運(yùn)，這對(duì)我們理解胎盤和胎兒營(yíng)養(yǎng)之間的平衡具有重要意義。

1. 當(dāng)hTSCs和CTBs分化為STBs時(shí)，它們的糖酵解通量降低。

2. 分化的HTSC保留基礎(chǔ)糖酵解，對(duì)糖酵解缺乏變得敏感。

3. 分化的hTSCs通過組蛋白乙?；诤习^程中感知乙酰輔酶A。

4.短暫的糖酵解應(yīng)激永久性地降低hTSCs的分化潛能。