pcr產(chǎn)物測序送樣要求及實(shí)驗(yàn)流程材料方法

 

1、檢測方法

1.1檢測方法

使用 Qubit（廠家YEASEN, 型號CAT 12642-A ，試劑1XdsDNA HS Assay kit for Qubit ）檢測核酸濃度，使用1%的瓊脂糖電泳檢測完整性

1.2判定標(biāo)準(zhǔn)

濃度≥1ng/ul

總量大于等于 30ng

目的條帶清晰可見，且片段小于500bp

PCR產(chǎn)物狀態(tài)正常

2、建庫方法

2.1PCR產(chǎn)物純化和末修

1)PCR產(chǎn)物純化

使用Vazyme DNA Beads對PCR產(chǎn)物進(jìn)行1×純化

2)末端修復(fù)加A

向純化產(chǎn)物中加入End Prep Mix 4和ddH2O，吹吸混勻并瞬時(shí)離心，按照下述程序在PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)

2.2接頭連接和純化

1)向上述末修產(chǎn)物中加入Rapid ligation Buffer 2、Rapid DNA ligase、IDT Adapter X，吹吸混勻后20℃孵育15min（若使用PCR儀則不加熱蓋）

2)使用Vazyme DNA Beads對接頭連接產(chǎn)物進(jìn)行0.8X純化

2.3文庫質(zhì)檢

1)質(zhì)檢方法：文庫通過 Qsep-400進(jìn)行片段質(zhì)檢， 使用Qubit 3 .0進(jìn)行文庫濃度的定量，使用TIANSeq?DNA?Quanti?Kit?1S?(Illumina)進(jìn)行QPCR定量

2)質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)：濃度≥1ng/ul，QPCR定量合格

2.4引物接頭序列

adpter3=”AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC”;

adpter5=”AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT”;

2.5建庫試劑耗材

1)文庫構(gòu)建試劑盒：VAHTSTM Universal DNA Library Prep Kit for illumina 貨號ND607

2)產(chǎn)物純化磁珠：VAHTSTM DNA Clean Beads， 貨號N411-03

3)質(zhì)檢使用試劑：Qsep400 標(biāo)準(zhǔn)DNA 卡夾

4)定量使用試劑：Qubit TM dsDNA HS Assay Ki

5)1.5ml離心管、0.2ml PCR管、10ul，200ul槍頭：Axygen

2.6建庫設(shè)備

3、測序方法

測序設(shè)備：NovaSeq X plus

測序策略：PE150