全基因組甲基化測序（wgbs）實驗流程材料方法

1、提取方法

1. 樣本研磨
2. 將裝有樣品的離心管加入1 ml 65 ℃預熱的CTAB提取液和2%的巰基乙醇（如 果是動物組織的話加50ul濃度為20mg/ml的蛋白酶K），在渦旋振蕩儀上震蕩混勻，使樣品完全懸浮，65 ℃烘箱溫浴40 -60min，不能超過1h
3. 溫浴期間搖勻2-3次，保證裂解充分。取出后，冷卻至室溫
4. 12000 rpm離心5 min，取上清液900ul至新的0 ml 無菌離心管中（。加入等體積三氯甲烷/異戊醇（24:1），上下顛倒混勻， 12000 rpm離心20 min
5. 吸取上清液700 ul至新的0 ml 無菌離心管，加入等體積三氯甲烷-異戊醇 （24:1），上下顛倒混勻， 12000 rpm離心20 min
6. 吸取上清液450 ul至新的5 ml無菌離心管中，加入上清液體積的2/3體積（300ul）的異丙醇和1/10體積（45ul）的3M乙酸鈉，充分混勻，-20 ℃放置1 h
7. 12000rpm離心10min（如果從-20℃取出后絮狀沉淀較多，可12000rpm離心20s），棄上清，瞬時離心，用200ul槍頭吸棄多余液體
8. 向沉淀中加1ml 75%的乙醇溶液，輕彈至沉淀懸浮，12000rpm離心5min，棄上清
9. 瞬時離心，用黃槍頭吸棄多余液體，離心管開蓋室溫晾干3-5min至DNA沉淀呈半透明狀
10. 加入≥20 ul含10 ng/ul RnaseA的超純水，根據(jù)沉淀大小決定融水體積，溶解DNA沉淀，37 ℃水浴鍋消化1 h后保存在-20 ℃冰箱備用

注：常規(guī)植物組織提取正常使用CTAB提取，疑難植物（薔薇科等多糖類植物）組織裂解前使用干擾（清洗掉部分多糖等雜質(zhì)）先清洗，清洗完之后在加裂解液；動物組織在裂解時加入2%的蛋白酶K；宏基因組項目提取在裂解時加入5%-10%的溶菌酶

2、檢測方法

2.1?檢測方法

使用?Qubit（廠家YEASEN, 型號CAT 12642-A ，試劑1XdsDNA HS Assay kit for Qubit ?）檢測核酸濃度，使用1%的瓊脂糖電泳檢測完整性

2.2?判定標準

• 濃度≥1.25ng/ul
• 總量大于等于?10ng
• 完整性主帶清晰、主帶不清晰，輕微拖帶在2K以上
• 核酸狀態(tài)正常

3、建庫方法

3.1?基因組打斷

1. 取適量基因組DNA至6mL進口離心管，混入1%的lambda DNA
2. 使用Bioruptor Pico，根據(jù)核酸質(zhì)量情況設置好打斷參數(shù)，進行超聲波打斷

3.2?打斷產(chǎn)物純化

1. 加入適量體積的Vazyme DNA Beads至打斷后的DNA中，吹吸混勻，室溫靜置5min，瞬時離心
2. 置于磁力架上，靜置5min，移棄上清液
3. 加入新鮮配制的80%乙醇，磁力架上靜置30s，移棄上清液；連續(xù)清洗2次后瞬時離心，用10μL槍頭將上清液去除干凈
4. 離心管置于磁力架上，打開管蓋，室溫干燥至磁珠表面無光澤，有細微裂紋
5. 取下離心管，加入無菌水，吹吸混勻，室溫靜置，而后磁力架上靜置，吸取上清液轉(zhuǎn)入新的2mL PCR 管中

3.3?亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化

1. 將CT Conversion Mix平衡至室溫并渦旋混勻，于Nuclease-free PCR管中加入CT Conversion Mix和Input DNA
2. 渦旋或者吹打混勻后短暫離心，將反應液收集至管底
3. 將PCR管置于PCR儀中，設置好程序運行

3.4?轉(zhuǎn)化產(chǎn)物純化

1. 將E-Binding Buffer加入至EpiArt DNA Columns (each in a 2 ml Collection Tube)，將轉(zhuǎn)化后的反應產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至EpiArt DNA Columns。溫和地上下顛倒混勻6 – 8次，使反應產(chǎn)物與E-Binding Buffer完全混勻，離心
2. 棄濾液，沿管壁加入100 μl E-Wash Buffer 至EpiArt DNA Columns，離心
3. 沿管壁加入E-Desulphonation Buffer至EpiArt DNA Columns，室溫(15 ~ 25℃)下靜置反應15 min，離心
4. 沿管壁加入 E-Wash Buffer至EpiArt DNA Columns，離心
5. 重復步驟4，棄濾液，空柱離心將多余的廢液離心至管底
6. 棄EpiArt DNA Columns，將DNA產(chǎn)物轉(zhuǎn)入新的2mLPCR管，產(chǎn)物保存于-30 ~ -15℃，長期保存需放置于-85 ~ -65℃，以防降解

3.5?轉(zhuǎn)化產(chǎn)物加接頭

1. 預熱PCR儀：熱蓋設為105℃，反應溫度設置為95℃。在5 mL離心管管中配制好后續(xù)反應試劑，用移液器輕輕吹打混勻后置于冰上待用
2. 將上一步驟轉(zhuǎn)化純化產(chǎn)物瞬時離心，置于預熱的PCR儀上，95℃加熱2 min ，迅速置于冰上靜置2 min。DNA變性后立即置于冰上，避免已變性為單鏈的DNA慢慢復性
3. 室溫解凍3′ Ligation Buffer 、3′ Ligation Enzyme Mix和3’Adapter，上下顛倒混勻后備用
4. 在5mL離心管中配制如下3’Adapter Ligation預混液（步驟3解凍的試劑）
5. 將3′ Adapter Ligation預混液與已變性的DNA用移液器輕輕吹打混勻后短暫離心，將反應液收集至管底
6. 將反應管置于PCR儀中，設置好程序運行

3.6?單鏈DNA延伸

1. 室溫解凍Extension Primer和Extension Enzyme Mix，上下顛倒混勻后備用
2. 于上一步驟反應管中加入延伸試劑Extension Primer、Extension Enzyme Mix
3. 使用移液器輕輕吹打混勻后瞬時離心，將反應液收集至管底
4. 將PCR管置于PCR儀中，按照程序運行

3.7?反應產(chǎn)物純化

1. 瞬時離心連接反應管，加入2x的Vazyme DNA Beads，輕輕吹吸10次充分混勻
2. 室溫孵育5min，而后置于磁力架上，靜置5min，小心移除上清，避免接觸并吸取磁珠
3. 保持反應管始終置于磁力架中，用排槍向反應管中加入新鮮配制的80%乙醇，磁力架上靜置30s，移棄上清液
4. 重復步驟（4）一次，第二次清洗后，瞬時離心，用10μL槍頭將上清液去除干凈
5. 反應管置于磁力架上，打開管蓋，空氣干燥1-2min，磁珠表面由光亮褐色變?yōu)槟ド昂稚?/li>
6. 將反應管從磁力架上取出，加入Dilution Buffer洗脫DNA，吹吸六次混勻，室溫靜置5min，而后磁力架上靜置5min，小心吸取上清至新的PCR管中

3.8?5’端連接接頭

1. 室溫解凍5′ Ligation Mix和5′ Adapter，上下顛倒混勻后備用
2. 于上一步驟反應管中配制如解凍后的試劑，使用移液器輕輕吹打混勻后瞬時離心，將反應液收集至管底
3. 將PCR管置于PCR儀中，按照程序運行
4. 反應產(chǎn)物純化，同步驟7

3.9?片段篩選

1. 向上述純化后的PCR管中加入5×已混勻的磁珠，吹吸10次混勻，室溫孵育5 min；而后置于磁力架上，靜置5 min，吸取全部上清液至新的PCR管中
2. 加入15×已混勻的磁珠，吹吸10次混勻。室溫孵育5 min；而后置于磁力架上，靜置5 min，移棄上清液
3. 加入100 μL新鮮配制的80%乙醇清洗磁珠（不可對著磁珠吹吸），磁力架上靜置30s，移棄上清液
4. 重復上步驟一次，第二次清洗后用10 μL槍頭將上清液徹底去除干凈
5. PCR管置于磁力架上，打開管蓋，室溫干燥1 min；取下PCR管，加入nuclease-free water，吹吸10~15次混勻，室溫靜置5 min；而后磁力架上靜置5 min，吸取上清液轉(zhuǎn)入新的PCR管中

3.10?PCR 擴增

1. 將VAHTS HiFi Amplification Mix V3和Index Primers*解凍后顛倒混勻，加入上一步驟反應管中
2. 混勻，瞬時離心，置于PCR儀中按照程序運

3.11?PCR產(chǎn)物純化

1. 瞬時離心連接反應管，補加25ul ddH2O，吹洗混勻后加入65 x的Vazyme DNA Beads，輕輕吹吸充分混勻
2. 室溫孵育5min，而后置于磁力架上，靜置5min，小心移除上清，避免接觸并吸取磁珠
3. 保持反應管始終置于磁力架中，向反應管中加入200μL新鮮配制的80%乙醇，磁力架上靜置30s，移棄上清液
4. 重復步驟3）一次，第二次清洗后，瞬時離心，用10μL槍頭將上清液去除干凈
5. 反應管置于磁力架上，打開管蓋，空氣干燥1-2min，磁珠表面由光亮褐色變?yōu)槟ド昂稚?/li>
6. 將反應管從磁力架上取出，加入Dilution Buffer洗脫DNA，吹吸六次混勻，室溫靜置5min，而后磁力架上靜置5min，小心吸取上清至新的PCR管中
7. 重復上述純化步驟進行二次純化。加入65 x的Vazyme DNA Beads，輕輕吹吸充分混勻
8. 室溫孵育5min，而后置于磁力架上，靜置5min，小心移除上清，避免接觸并吸取磁珠
9. 保持反應管始終置于磁力架中，向反應管中加入200μL新鮮配制的80%乙醇，磁力架上靜置30s，移棄上清液
10. 重復步驟（10）一次，第二次清洗后，瞬時離心，用10μL槍頭將上清液去除干凈
11. 反應管置于磁力架上，打開管蓋，空氣干燥1-2min，磁珠表面由光亮褐色變?yōu)槟ド昂稚?/li>
12. 將反應管從磁力架上取出，加入Dilution Buffer洗脫DNA，吹吸六次混勻，室溫靜置5min，而后磁力架上靜置5min，小心吸取30 μL上清至新的PCR管中
13. 分裝2ulGX檢測

3.12?文庫質(zhì)檢

1. 質(zhì)檢方法：文庫通過Qsep-400進行片段質(zhì)檢，?使用?Qubit?3?.0進行文庫濃度的定量
2. 質(zhì)檢標準：濃度≥1ng/ul，峰圖在要求切膠范圍之內(nèi)，片段單一無雜峰

3.13?建庫試劑耗材

• 文庫構(gòu)建試劑盒：EpiArt DNA Enzymatic MethyLation Kit，貨號EM301-00；EpiArt DNA Methylartion Library Kit For Illumina V，貨號NE103-00
• 產(chǎn)物純化磁珠：VAHTSTMDNA?Clean?Beads，?貨號N411-03
• 質(zhì)檢使用試劑：Qsep400 ?標準DNA卡夾
• 定量使用試劑：Qubit TM dsDNA HS Assay Ki
• 5ml離心管、0.2mlPCR管、10ul，200ul槍頭：Axygen

3.14?建庫設備

設備	廠家
PCR儀	艾本德
金屬浴	天根
掌上離心機	天根生化
漩渦震蕩器	SCIENTIFICINDUSTRIES.INC
移液槍	RAININ 瑞寧
磁力架	Life
相機	索尼
冰箱	海爾
四維旋轉(zhuǎn)儀	海門市其林貝爾儀器制造有限公司
質(zhì)檢使用儀器	Bioptic-Qsep400
定量使用儀器	賽默飛Qubit 3.0
超聲波破碎儀	Bioruptor Pico非接觸式全自動超聲波破碎儀、Diagenode
水浴鍋	北京三二八科學儀器有限公司

4、測序方法

測序設備：NovaSeq X plus

測序試劑盒：NovaSeqTMX? Series25B Rgt Kit