Pacbio基因組實驗流程材料方法

1、提取方法

1.1?植物組織：CTAB法

1. 液氮研磨樣品，分裝至離心管中
2. 向離心管中加入 CTAB，水浴
3. 離心后向上清中加入氯仿/異戊醇（24:1），離心
4. 向上清中加入異丙醇和乙酸鈉溶液，離心，棄上清
5. 加入 75％乙醇，離心，棄上清
6. 晾干，加入 TE ?溶解 DNA ，保存在-20℃冰箱

1.2?動物組織：SDS法

1. 液氮研磨組織樣，分裝至離心管中
2. 加入 SDS 溶液，水浴
3. 加入 NaCl 溶液，靜置后離心
4. 向上清中加入氯仿/異戊醇（24:1）后離心
5. 向上清中加入異丙醇后離心，棄上清
6. 加入 75％乙醇，離心，棄上清
7. 晾干，加入 TE 溶解 DNA，保存在-20℃冰箱

1.3?動物血液：Kurabo 試劑盒法

QuickGene DNA whole blood kit S (DB-S)，廠家：Kurabo，貨號：40321300101

1.4?粗體核酸純化

• 試劑盒名稱：QIAGEN Genomic-tip 20/G，廠家：QIAGEN，貨號：10223
• 試劑盒名稱：QIAGEN Genomic-tip 100/G，廠家：QIAGEN，貨號：10243

1.5?微生物樣本

使用TGuide S96磁珠法土壤/糞便基因組DNA提取試劑盒完成核酸的提取

2、檢測方法

2.1檢測方法

• 濃度檢測

Nanodrop：賽默飛 Thermo ，型號 NANODROP2000

Qubit：廠家YEASEN, 型號CAT 12642-A ，試劑1XdsDNA HS Assay kit for Qubit

• 完整性檢測（瓊脂糖凝膠電泳）

電泳儀：廠家：Monad?，型號 Universal – P

電泳槽：廠家：Tanon，型號：HE- 120

2.2?判定標準

• 總量≥6μg（單次建庫）
• 濃度≥50ng/ul
• 體積≥10(ul)
• OD260/280在7-2.2之間，OD260/230在1.8-2.5之間
• AGE：size≥23K，降解條帶>5K，點樣孔無或有輕微污染，N/Q在8-2.5之間
• 樣本狀態(tài)正常，樣本粘稠、顏色異常、有渾濁或不溶物均不合格

注：特殊物種實驗人員會根據(jù)經(jīng)驗進行判斷，具體以檢測報告中的判斷結(jié)果為準

3、建庫方法

DNA 打斷

1. 加入75-1.5 μg gDNA，補Elution Buffer 至100 μL，將gDNA樣品稀釋到終濃度為7.5 ng/μL -15 ng/μL。小心轉(zhuǎn)移到g-TUBE 管中，4600rpm離心2分鐘
2. 重復(fù)離心，直至全部gDNA樣品通過g-TUBE孔洞
3. 倒置g-TUBE管，離心2分鐘
4. 收集打斷好的gDNA樣品于新的5 mL低吸附離心管中

PB純化

1. 將gDNA樣品稀釋到100 μL，若體積超過100 μL，則不需要稀釋
2. 向樣品中中加入45*體積的AMPure PB磁珠（室溫平衡30分鐘）
3. 使用寬口槍頭輕輕吹打15次，混勻上述樣品，瞬離1秒
4. 室溫放置30分鐘，瞬離1秒
5. 轉(zhuǎn)移離心管到磁力架上，直至磁珠完全吸附，將上清液轉(zhuǎn)移到新離，備用
6. 使用5ml 新配的80%酒精洗滌磁珠，30秒后棄掉酒精，重復(fù)一次
7. 瞬離1s，將酒精棄凈
8. 向管中加入20 μL 1X Elution Buffer，使用寬口槍頭輕輕吹打15次，進行混勻
9. 10-15分鐘溶解DNA，瞬離1秒
10. 吸取20 μL上清液于新的5 mL低吸附離心管中
11. 取1 μL稀釋5倍，使用Qubit進行濃度測定

DNA修復(fù)

• 向純化產(chǎn)物中分別加入以下試劑

試劑	體積（μL）
Repair buffer	8
End repair Mix	4
DNA repair mix	2
總體積（Reaction Mix 1）	14

• 使用寬口槍頭輕輕吹打10次，混勻上述樣品，瞬離1秒
• 向每個樣品中加入14μL Reaction Mix 1
• 使用寬口槍頭輕輕吹打10次，混勻，瞬離1秒
• 孵育

溫度	時間（min）
37℃	30
65℃	5
4℃	Hold

接頭連接

• 向上述產(chǎn)物中分別加入以下試劑

試劑	體積（μL）
SMRTbell adapter	4
Ligation mix	30
Ligation enhancer	1
總體積（Reaction Mix 2）	35

• 使用寬口槍頭輕輕吹打10次，混勻上述樣品，瞬離1秒
• 向每個樣品中加入35μL Reaction Mix 2
• 使用寬口槍頭輕輕吹打10次，混勻，瞬離1秒
• 孵育

溫度	時間（min）
20℃	30
4℃	Hold

PB純化

• 向樣品中中加入1*體積的SMRT bell cleanup beads（室溫平衡30分鐘）
• 使用寬口槍頭輕輕吹打15次，混勻上述樣品，瞬離1秒
• 室溫放置10分鐘，瞬離1秒
• 轉(zhuǎn)移離心管到磁力架上，直至磁珠完全吸附，將上清液轉(zhuǎn)移到新離，備用
• 使用5ml新配的80%酒精洗滌磁珠，30秒后棄掉酒精，重復(fù)一次
• 瞬離1s，將酒精棄凈
• 向管中加入40μL1XElutionBuffer，使用寬口槍頭輕輕吹打15次，進行混勻
• 室溫5分鐘溶解DNA，瞬離1秒
• 吸取40μL上清液于新的5mL低吸附離心管中
• 取1μL稀釋5倍，使用Qubit進行濃度測定

酶處理

• 向上述純化產(chǎn)物中分別加入以下試劑

試劑	體積（μL）
Nuclease buffer	5
Nuclease mix	5
總體積（Reaction Mix 3）	10

• 使用寬口槍頭輕輕吹打10次，混勻上述樣品，瞬離1秒
• 孵育

溫度	時間（min）
37℃	15
4℃	Hold

PB磁珠片段篩選

1. 向上述產(chǎn)物中加入1*體積的2.85*稀釋的AMPurePB磁珠（室溫平衡30分鐘）
2. 使用寬口槍頭輕輕吹打15次，混勻上述樣品，瞬離1秒
3. 室溫放置20分鐘，瞬離1秒
4. 轉(zhuǎn)移離心管到磁力架上，直至磁珠完全吸附，將上清液轉(zhuǎn)移到新離心管，備用
5. 使用5ml新配的80%酒精洗滌磁珠，30秒后棄掉酒精，重復(fù)一次
6. 瞬離1s，將酒精棄凈
7. 向管中加入1X Elution Buffer，使用寬口槍頭輕輕吹打15次，進行混勻
8. 室溫10-15分鐘溶解DNA，瞬離1秒
9. 吸取上清液于新的5mL低吸附離心管中
10. 取1μL稀釋5倍，使用Qubit進行濃度測定。純化后DNA樣品可以在4℃保存2周，可以長期保存于-20℃，但避免反復(fù)凍融

4、測序方法

• 最終文庫通過濃度（Qubit）及大?。ˋgilent 5400）的檢測，總量需要大于Smrtlink計算值。
• 使用REVIO SPRQ POLYMERASE KIT（Pacbio，USA） 對上機文庫進行上機前的結(jié)合，使文庫結(jié)合上Primer（Pacbio，USA）及Polymerase（Pacbio，USA）
• 將最終的反應(yīng)產(chǎn)物進行SMRTbell cleanup beads（Pacbio，USA）純化后置于Revio（Pacbio，USA）測序儀上進行測序

5、實驗用試劑

物料名稱	廠家	存貨代碼	規(guī)格
g-TUBE	Covaris	g-TUBE	10個/盒
SMRTbell Prep Kit 3.0	PACBIO	102-182-700	24次/盒
Quant-iTTMds DNA HS Reagent and HS Buffer	英濰捷基	Q32854	500次/盒
AMPure PB (5ml)(純化磁珠)	PACBIO	100-265-900	5ml/瓶
SMRTbell cleanup Beads	PACBIO	102-158-300	10000ul/瓶
REVIO SPRQ POLYMERASE KIT	PACBIO	103-496-900	24次/盒
REVIO SPRQ SEQUENCING PLATE	PACBIO	103-504-900	4次/盒
REVIO SMRT CELL TRAY	PACBIO	102-202-200	4張/盒

6、實驗用設(shè)備

儀器名稱	生產(chǎn)廠家	型號
瞬時離心機	天根生化科技（北京）有限公司	OSE-MC8
﹣20℃度冰箱	青島海爾特種電冰柜有限公司	BC/BD-629HK
4°C 冰箱	海爾	HYC-360
渦旋振蕩器	SCIENTIFICINDUSTRIES.INC	vortex-2G560E
基因擴增儀	Appliedbiosystems	veriti96well9902
恒溫金屬浴	Eppendorf	ThermoMixer F1.5
磁力架	賽默飛世爾	DynaMag96Side skirted
測序儀	Pacbio	Revio